Gastric Cancer

Препис

1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Код GM333 4-то издание HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) e директен анализ чрез използването на флуоресцентна in situ хибридизация (FISH), разработен за количественото определяне на амплификацията на гена HER2 във фиксирани във формалин и включени в парафин (FFPE) хистологични препарати на рак на гърдата и FFPE проби от пациенти с метастатичен аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е предназначено за употреба като допълнение към HercepTest за оценката на пациенти, за които се предвижда лечение с Herceptin. Флаконът съдържа реагенти, достатъчни за 20 теста. Допълнителните реагенти, които трябва да се използват заедно с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Код GM300 GM301 GM302 GM303 GM304 Име на продукт ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Pre-Treatment Solution (20х) (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) P04125BG_03/GM333 стр. 1/56

2 Съдържание Страница Предназначение... 3 Принцип на процедурата - Гърда... 4 Реагенти - Гърда... 5 Предпазни мерки - Гърда... 6 Съхранение - Гърда... 7 Приготвяне на препарат - Гърда... 8 ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА - Гърда... 8 A. Приготвяне на реагенти - Гърда... 8 Б. Процедура на оцветяване - Гърда Контрол на качеството - Гърда Интерпретация на оцветяването - Гърда Ограничения - Гърда Работни характеристики - Гърда Отстраняване на неизправности - Гърда Приложение 1 - Гърда Приложение 2 - Гърда Кратко описание и обяснение - Стомах Принцип на процедурата - Стомах Реагенти - Стомах Предпазни мерки - Стомах Съхранение - Стомах Приготвяне на пробите - Стомах ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА - Стомах A. Приготвяне на реагентите - Стомах Б. Процедура на оцветяване - Стомах Контрол на качеството - Стомах Интерпретация на оцветяването - Стомах Ограничения - Стомах Работни характеристики - Стомах Откриване и отстраняване на проблеми - Стомах Приложение 3 - Стомах Приложение 4 - Стомах Приложение 5 - Стомах Източници Обяснение на символите P04125BG_03/GM333 стр. 2/56

3 Предназначение За употреба при ин витро диагностика. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е хибридизационна сонда за автоматизиран директен анализ чрез използването на флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) в апарат на Dako Omnis и, наред с допълнителни устройства за реагенти, е предназначен за количествено определяне на амплификацията на гена HER2 във фиксирани във формалин и включени в парафин (FFPE) хистологични препарати на рак на гърдата и FFPE проби от пациенти с аденокарцином на стомаха, включително на хранопроводно-стомашното съединение. HER2 IQFISH pharmdx е показан като допълнение към HercepTest при извършването на оценка на пациенти, за които се предвижда лечение с Herceptin (трастузумаб) (вижте информационната листовка в опаковката на Herceptin ). За пациенти с рак на гърдата резултатите от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) са предназначени за употреба като допълнение към клинико-патологичната информация, използвана понастоящем за даване на прогноза при пациенти в стадий II на рак на гърдата с позитивни лимфни възли. Аденокарциномът на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение се нарича още рак на стомаха в настоящия документ. За приложение при рак на гърдата, моля, направете справка със страници За приложение при рак на стомаха, моля, направете справка със страници Важно: Моля, обърнете внимание на разликите между тъканите от рак на гърдата и тъканите от рак на стомаха, особено в разделите за интерпретация на оцветяването P04125BG_03/GM333 стр. 3/56

4 Рак на гърдата Кратко описание и обяснение - Гърда Човешкият ген HER2 (известен и като ERBB2 или NEU) е разположен върху хромозома 17 и кодира протеина HER2 или p185 HER2. Протеинът HER2 е тирозин-киназен мембранен рецептор с хомология с рецептора на епидермалния фактор на растежа (EGFR или HER1) (1-2). Генът HER2 присъства в 2 копия във всички нормални диплоидни клетки. При част от пациентите с рак на гърдата генът HER2 е амплифициран като част от процеса на злокачествена трансформация и развитие на тумора (3-8). Амплификацията на гена HER2 обикновено води до свръхекспресия на протеина HER2 на повърхността на клетките от рак на гърдата (9). Амплификацията на гена HER2 и/или свръхекспресията на неговия протеин се проявяват при 20-25% от случаите на рак на гърдата (10). Тази повишена регулация се асоциира с неточна прогноза, повишен риск от рецидив и намалена преживяемост. Редица изследвания сочат, че HER2 статусът корелира с чувствителността или резистентността към определени схеми на химиотерапия (11). Демонстрацията на висока свръхекспресия на протеина HER2 или амплификацията на гена HER2 е съществена за започване на терапия с Herceptin, моноклонално антитяло срещу протеина HER2. Клиничните изследвания сочат, че пациентите, чиито тумори имат висока свръхекспресия на протеина HER2 и/или амплификация на гена HER2, имат найголяма полза от Herceptin (12). Този продукт (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е IQISH комплект сонди за автоматизиран директен FISH анализ, който открива амплификацията на гена HER2. Този продукт трябва да се използва със специфични допълнителни реагенти в Dako Omnis и се получава от ръчно извършен анализ на амплификацията на HER2-гена, HER2 IQFISH pharmdx, код K5731. Принцип на процедурата - Гърда HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е IQISH комплект сонди, който се състои от комбинация от Texas Red-маркирани ДНК сонди, покриващи 218 kb област, включващи HER2 гена върху хромозома 17, и от комбинация от флуоресцеин-маркирани пептиднонуклеинова киселина (PNA) сонди, (13) насочени към центромерната област на хромозома 17 (CEN-17). Специфичната хибридизация до две цели води до формиране на отчетлив червен флуоресцентен сигнал при всеки локус на ген HER2 и отчетлив зелен флуоресцентен сигнал при всеки центромер на хромозома 17. Оценката на амплификацията на гена HER2 с помощта на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е изцяло автоматизиран метод на апарата Dako Omnis. Три различни валидирани HER2 FISH протокола за оцветяване могат да бъдат избрани в софтуера на работната станция Dako Link Omnis. Протоколите се различават само по времето на разграждане на пепсина, като впоследствие може да се избере разграждане на пепсина за 10 минути (кратък протокол), 15 минути (протокол със средна продължителност) или 20 минути (дълъг протокол) (вижте още по-долу). За първоначален анализ се препоръчва протокола със средна продължителност. След оцветяване в Dako Omnis препарати се заливат с Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), която съдържа 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), и се поставят на покривно стъкло. С помощта на флуоресцентен микроскоп, оборудван с подходящите филтри (вижте приложение 2), се локализират туморните клетки и се извършва преброяване на червените (HER2) и зелените (CEN-17) сигнали. Тогава се изчислява съотношението HER2/CEN-17. Нормалните клетки в анализирания тъканен срез ще служат за вътрешен контрол на позитивния резултат от оцветяването. За подробности вижте раздела Интерпретация на оцветяването. P04125BG_03/GM333 стр. 4/56

5 Рак на гърдата Моля, консултирайте се с Ръководството(ата) за потребителя на Dako Omnis за подробни инструкции относно зареждането и свалянето на слайдове, ISH Lids (Dako Omnis), реагенти, наливни течности и отпадъци. Реагенти - Гърда HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителните реагенти могат да се поръчат отделно като единични реагенти. Осигурени материали HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, готова за употреба комбинация от Texas Redмаркирани HER2 ДНК сонди и флуоресцеин-маркирани CEN-17 PNA сонди, предоставяни в IQISH хибридизационен буферен разтвор. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) се доставя върху сух лед. За да се гарантира, че реагентът не е излаган на високи температури при транспортиране, при получаване на пратката сухият лед трябва да се съдържа в нея. Флаконите за реагент с размразено съдържание трябва винаги да са в изправено положение при съхранение и работа. Флаконът за реагент съдържа позлатено метално топче, което позволява смесването на реагента с помощта на Dako Omnis Mixing Device (вижте Ръководството за потребителя за Dako Omnis Mixing Device). Важно е реагентът да се смеси щателно, преди да се зареди в Dako Omnis. Материали, които са необходими, но не са осигурени Допълнителни реагенти Необходимо е следните реагенти да се намират в апарата Dako Omnis, за да се извърши анализ на амплификацията на гена HER2 с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, концентриран 20x; да се разтваря в съотношение 1:20 в 3,5 L наливна бутилка на Dako Omnis (код GC109). Продуктът съдържа антимикробен агент и инертен зелен цвят за лесна идентификация и улеснение на потребителя. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96% етанол (готов за употреба). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml разтвор на пепсин A (готов за употреба), ph 2,0; съдържа стабилизатор и антимикробно средство. Пепсинът се доставя в сух лед. За да се гарантира, че реагентът не е излаган на високи температури при транспортиране, при получаване на пратката сухият лед трябва да се съдържа в нея. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml буферен разтвор от физиологичен разтвор на натриев цитрат концентриран 20x; да се разтваря в съотношение 1:20 в 3,5 L наливна бутилка на Dako Omnis (код GC109). Продуктът съдържа антимикробен агент, почистващ препарат и инертен жълт цвят за лесна идентификация и улеснение на потребителя. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml флуоресцентна среда за заливка (готова за употреба) с DAPI. Въпреки че описаните по-горе реагенти не са предоставени с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), те са описани накратко по-долу. За повече информация, моля, направете справка с инструкциите за употреба за всяко устройство. Допълнителни реагенти и устройства Dako Omnis, код GI100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), код GC807 Clearify, код GC810 Dako Omnis Mixing Device, код GC116 ISH Lid, код GC102 ISH Cleaning Solution, код GC207 P04125BG_03/GM333 стр. 5/56

6 Рак на гърдата Покривни стъкла за заливка (24 mm x 50 mm) Моля, направете справка с основното и разширеното ръководства за потребителя на Dako Omnis за използване на допълнителни реагенти и устройства. Микроскопско оборудване и принадлежности Филтри за флуоресцентен микроскоп: DAPI и FITC/Texas Red двоен филтър или FITC и Texas Red моно филтри. Вижте приложение 2 за подробности. Използването на DAPI филтър при високо увеличение въздейства отрицателно на интензивността на сигнала. Трябва да се избягват дългите периоди на излагане. Трябва да се използва флуоресцентен микроскоп със 100 W живачна лампа като източник на светлина. Други източници на светлина не се препоръчват за тези филтри. Папка за микроскопски слайдове (картонена тава за 20 слайда с капак на панти или друг подобен). Предпазни мерки - Гърда 1. За употреба при ин витро диагностика. 2. За професионална употреба. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) съдържа 10-<25% етилен карбонат и 3-<5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е означен: Внимание H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Предизвиква сериозно дразнене на очите. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. Като общо правило не се допуска лица под 18 годишна възраст да работят с продукта. Потребителите трябва да бъдат подробно запознати с правилната работна процедура, опасните свойства на продукта и необходимите инструкции за безопасност. За допълнителна информация, моля, направете справка с информационния лист за безопасност (SDS). 4. Хистологичните препарати, преди и след фиксиране, както и всички материали, влезли в контакт с тях, трябва да се третират като пренасящи инфекция материали и да се изхвърлят, като се вземат подходящите предпазни мерки (14). Никога не преливайте реагентите с уста и не позволявайте на реагентите и пробите да влизат в контакт с кожата и лигавиците. При контакт на реагентите с чувствителни места, промийте с обилно количество вода. 5. Сведете до минимум микробното замърсяване на реагента, за да избегнете неточни резултати. 6. Методи за фиксиране на тъкани и дебелина на препарата, различни от определените, могат да окажат влияние на морфологията на тъканите и/или интензивността на сигнала. 7. Реагентът е разреден оптимално. Допълнителното разреждане може да доведе до влошаване на работните характеристики. 8. Носете подходящи лични предпазни средства, за да избегнете контакт с очите и кожата. За допълнителна информация, моля, консултирайте се с информационния лист за безопасност на материала (SDS). 9. Неизползваният разтвор трябва да се изхвърля в съответствие с местните, държавните и федералните разпоредби. P04125BG_03/GM333 стр. 6/56

7 Рак на гърдата Съхранение - Гърда Съхранявайте HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) при < -18 C (препоръчителен диапазон от -18 C до -25 C) на тъмно. Винаги дръжте флакона за реагент в изправено положение. Замразяването и размразяването на реагента до 10 пъти не влияе на неговата ефективност. Не оставяйте този компонент на стайна температура. Възможно е възникване на неблагоприятни въздействия, ако HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителните реагенти: ISH pepsin (Dako Omnis) и Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) бъдат изложени на топлина. Не оставяйте тези компоненти на стайна температура. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителният реагент Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) могат да бъдат повлияни неблагоприятно, ако бъдат изложени на силна светлина. Не съхранявайте тези компоненти, нито извършвайте анализ на силна светлина, като например пряка слънчева светлина. Съхранявайте допълнителните реагенти ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) и Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) на тъмно при температура 2-8 C. Съхранявайте ISH Pepsin (Dako Omnis) при C. Капачето на флакона, включително щракващото горно капаче, на всички реагенти трябва да е затворено по време на съхранение. Разредените разтвори (работният разтвор на ISH Stringent Wash Buffer и работният разтвор на ISH Pre-Treatment Solution) могат да се съхраняват при температура 2-8 C в продължение на 30 дни. Не използвайте каквито и да било реагенти след изтичане на срока на годност, указан върху контейнера за реагент. При съхранение капачето на реагента, включително щракващото горно капаче, трябва да е затворено. Ако реагентите се съхраняват при условия, различни от посочените, потребителят трябва да одобри характеристиките на реагента (15). Няма видими признаци, които да показват нестабилност на този продукт. Следователно, е важно да се оценят нормалните клетки в анализирания тъканен срез. Ако се наблюдава неочакван флуоресцентен модел, за който няма обяснение, и има съмнения за проблем с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) или неговите допълнителни реагенти, моля, свържете се с отдел Техническо обслужване на Dako Стабилност в апарата Dako Omnis Стабилността в апарата на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителните реагенти ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) и ISH Pepsin (Dako Omnis) е 80 часа. Стабилността в апарата на разредения ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) и ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) е 7 дни. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis. Употребата на реагенти с изтекъл срок на годност ще доведе до появата на съобщение на апарата Dako Omnis; всички слайдове, оцветени с реагент с изтекъл срок на годност, ще променят статуса си на съмнителен и регистърът на слайдовете на работната станция ще покаже, че се използва реагент с изтекъл срок на годност. P04125BG_03/GM333 стр. 7/56

8 Рак на гърдата Приготвяне на препарат - Гърда Препарати от биопсии, ексцизии или резекции трябва да се третират за запазване на тъканите за FISH анализ. Стандартните методи на обработка на тъканите за имуноцитохимично оцветяване трябва да се използват за всички препарати (16). Включени в парафин срези Само тъкани, съхранени в неутрален буфериран формалин и включени в парафин, са подходящи за употреба. Например препаратите трябва да се блокират в дебелина от 3 или 4 mm и трябва да се фиксират за часа в неутрален буфериран формалин. След това тъканите се дехидрират чрез степенувани серии етанол и ксилен, следвани от инфилтриране с разтопен парафин, осъществено при температура не по-висока от 60 C. Правилно фиксираните и включени тъкани ще се запазят за неопределено време преди формирането им на срези и заливането на слайдове, ако се съхраняват на хладно място (15-25 C) (16-17). Други фиксатори не са подходящи. От хистологичните препарати трябва да се приготвят срези с дебелина 4-6 µm. Слайдовете, изисквани за анализ на амплификацията на гена HER2, и проверката за наличие на тумор трябва да се приготвят по едно и също време. Препоръчват се минимум два серийни среза, като единият е за проверка за наличие на тумор с оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване), а другият е за анализ на амплификацията на гена HER2. Препоръчва се тъканните срези да се заливат на Dako FLEX IHC Microscope Slides, код K8020. Слайдовете Superfrost Plus (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) също са подходящи. Уверете се, че предметните стъкла не са с изтекъл срок на годност. Препаратите трябва да се анализират в рамките на < 6 месеца от формирането на срези при съхранение при 2-25 C. ЗАБЕЛЕЖКА: Хистологичните препарати трябва да бъдат поставени на предметното стъкло в рамките на определената зона за оцветяване на слайда. Моля, направете справка с Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis за размера на зоните за оцветяване на слайда. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА - Гърда A. Приготвяне на реагенти - Гърда A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Флаконът с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) съдържа позлатено метално топче, използвано за смесване. Преди зареждането на флакона в Dako Omnis реагентът трябва да се размрази и щателно да се размеси, тъй като в замразено състояние фазата му се разделя. Използвайте Dako Omnis Mixing Device за размесването на сонди. Следвайте процедурата по-долу за размесването на сонди в Dako Omnis Mixing Device и за повече подробности вижте Ръководството за смесителя. 1. Извадете флакона HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) от фризера. 2. Заредете флакона в Dako Omnis Mixing Device. 3. Свържете смесителя и се уверете, че e включен зеленият индикатор за състояние Изберете програмата Thaw + mix ( Размразяване + смесване ). Важно: Флакони, съхранявани под -25 C да се размразяват (непосредствено) преди зареждането на флакона в Dako Omnis Mixing Device и да се използва програмата Mix ( Смесване ). 4. Махнете флакона от смесителя. P04125BG_03/GM333 стр. 8/56

9 Рак на гърдата 5. Отворете щракващото горно капаче, чукнете го леко в посока назад и го щракнете в отвора за позициониране (вижте основното ръководство за потребителя на Dako Omnis за подробности). 6. Незабавно заредете флакона в модула за съхранение на реагент в апарата Dako Omnis. Ако по време на процедурата по оцветяване се използва функция за непрекъснато зареждане на реагент, уверете се, че времето от размесване до аспирация на флакона в Dako Omnis е поне 10 минути. Сондата HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) може отново да се размрази и да се използва до 10 пъти. Винаги размесвайте комплекта сонди HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) непосредствено преди зареждане в апарата. Не разклащайте. Общата стабилност в апарата на ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е 80 часа, когато се съхранява в модула за съхранение на реагент на Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). След престоя в апарата Dako Omnis HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) трябва незабавно да се замрази до температура < -18 C (препоръчва се температура от -18 C до -25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Пригответе работен разтвор чрез разреждане на концентрат от ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20, както следва: 1. Напълнете наливна бутилка Dako Omnis 3,5 L, маркирана с PTB (син етикет), до линията за пълнене с дейонизирана вода (3,325 L). Уверете се, че преди напълване наливната бутилка е поставена на хоризонтална повърхност. 2. Изсипете докрай една бутилка концентрат 175 ml ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) в наливната бутилка. 3. Прехвърлете свалящия се етикет от бутилката с концентрат върху наливната бутилка. Затегнете капака на наливната бутилка и я обърнете внимателно 2-3 пъти. 4. Използвайте ръчния баркод скенер на Dako Omnis, за да разпознаете реагента (сканирайте свалящия се етикет и наливната бутилка). 5. Незабавно заредете наливната бутилка в апарата Dako Omnis. Разреденият разтвор може да се използва в рамките на 7 дни, когато се съхранява вътре в Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). Неизползваният разреден разтвор може да се съхранява при температура 2-8 C в продължение на 30 дни. След съхранение на студено се уверете, че разреденият разтвор е темпериран до температура от поне 18 C, преди да го заредите в Dako Omnis. ЗАБЕЛЕЖКА: Изхвърлете разредения разтвор, ако изглежда мътен. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Пригответе работен разтвор чрез разреждане на концентрат от ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20, както следва: 1. Напълнете наливна бутилка Dako Omnis 3,5 L, маркирана с PTB (син етикет), до линията за пълнене с дейонизирана вода (3,325 L). Уверете се, че преди напълване наливната бутилка е поставена на хоризонтална повърхност. 2. Изсипете докрай една бутилка концентрат 175 ml ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) в наливната бутилка. 3. Прехвърлете свалящия се етикет от бутилката с концентрат върху наливната бутилка. Затегнете капака на наливната бутилка и я обърнете внимателно 2-3 пъти. 4. Използвайте ръчния баркод скенер на Dako Omnis, за да разпознаете реагента (сканирайте свалящия се етикет и след това наливната бутилка). 5. Незабавно заредете наливната бутилка в апарата Dako Omnis. P04125BG_03/GM333 стр. 9/56

10 Рак на гърдата Разреденият разтвор може да се използва в рамките на 7 дни, когато се съхранява вътре в Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). Неизползваният разреден разтвор може да се съхранява при температура 2-8 C в продължение на 30 дни. След съхранение на студено се уверете, че разреденият разтвор е темпериран до температура от поне 18 C, преди да го заредите в Dako Omnis. ЗАБЕЛЕЖКА: Изхвърлете разредения разтвор, ако изглежда мътен. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) е готов за употреба реагент. Преди зареждане в апарата Dako Omnis отворете щракващото горно капаче на флакона, чукнете го леко в посока назад и натиснете в отвора. Общата стабилност в апарата ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) е 80 часа, когато се съхранява в модула за съхранение на реагент на Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). След края на процедурата ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) може да се приведе до температура на съхранение (2-8 C), за да се запази времето на стабилност в апарата. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) е готов за употреба реагент. Преди зареждане в апарата Dako Omnis се уверете, че реагентът е размразен и отворете щракващото горно капаче на флакона, чукнете го леко в посока назад и натиснете в отвора. Общата стабилност в апарата на ISH Pepsin (Dako Omnis) е 80 часа, когато се съхранява в модула за съхранение на реагент на Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). След края на процедурата ISH Pepsin (Dako Omnis) трябва да се приведе до температура на съхранение C, за да се запази времето на стабилност в апарата. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) е готова за употреба среда за заливка, която се използва извън апарата Dako Omnis. Приведете Fluorescence Mounting Medium до температура на съхранение (2-8 C) незабавно след употреба. A.7 Допълнителни принадлежности Освен това следните принадлежности трябва да се заредят в апарата Dako Omnis: дейонизирана вода, разреден Wash Buffer 20x (Dako Omnis), код GC807, Clearify, код GC810, ISH Cleaning Solution код GC207 и ISH Lid (Dako Omnis), код GC102, както е посочено в Ръководството(ата) за потребителя на Dako Omnis. Б. Процедура на оцветяване - Гърда Б.1 Процедурни бележки HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е хибридизационна сонда за автоматизиран пряк анализ чрез флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) в апарата Dako Omnis и заедно с допълнителните реагенти GM300, GM301, GM302, GM303 и GM304 (GM304 извън апарата) е предназначена за количественото определяне на амплификацията на гена HER2. Преди употреба потребителят трябва да прочете внимателно всички инструкции и да се запознае с всички компоненти и свързаните с тях предпазни мерки. Автоматизираната процедура на оцветяване FISH в Dako Omnis включва депарафинизацията на тъканни срези, откриване на епитоп, разграждане на пепсин, хибридизация и цялостно промиване. Слайдовете се свалят в сухата станция за сваляне. Всички стъпки от протокола се програмират предварително в софтуера на Dako Omnis. Моля, вижте ръководството(ата) за потребителя на Dako Omnis за инструкции относно зареждането на слайдове, ISH Lid, реагенти и т.н. Три утвърдени HER2 IQFISH протокола: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium и HER2 IQFISH Pepsin Long, които P04125BG_03/GM333 стр. 10/56

11 Рак на гърдата се различават единствено по времето на разграждане на пепсина, са програмирани предварително в софтуера на Dako Omnis и могат да се избират за всеки от петте слайда в стойката за слайдове. Това позволява да се оптимизира разграждането на тъканта, което може да зависи от състоянията, предшестващи анализа. Протоколът HER2 IQFISH Pepsin Medium се счита за стандартния протокол. Различните протоколи за оцветяване могат да се видят на работната станция на Dako Link Omnis. В допълнение потребителят може да реши да използва Template IQFISH protocol. Оптималните условия може да варират в зависимост от типа на препарата и метода за неговото приготвяне и трябва да се валидират от всяка лаборатория. Б.2. Процедура преди оцветяването 1. Изберете протокола HER2 IQFISH, който да се приложи за всеки слайд от софтуера на работната станция Dako Link Omnis под протоколите IQFISH. 2. Разпечатайте етикетите на слайдовете и ги прикрепете към предметните стъкла. 3. Поставете слайдовете в стойката за слайдове. За повече информация вижте Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis. В стойката за слайдове може да се поместят от един до пет слайда. Препоръчва се поне два слайда да се оцветят с процедурата на оцветяване HER2 IQFISH. 4. Заредете стойката за слайдове в Dako Omnis. 5. Заредете ISH Lid (по един ISH Lid на стойка за слайдове) в Dako Omnis. 6. Уверете се, че наливните бутилки с течности се намират в и са регистрирани от апарата Dako Omnis. Течности в наливната бутилка: Clearify (средство за почистване), разреден ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), разреден ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) и разреден Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Заредете ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) и ISH Pepsin (Dako Omnis), току-що размесен HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и ISH Cleaning Solution (Dako Omnis) в модула за съхранение на реагент. Уверете се, че всички щракващи горни капачета на флакони са отворени. 8. Следвайте инструкциите на сензорния екран и докоснете Done ( Готово ), за да започнете процедурата на оцветяване. Б.3. Процедура на оцветяване Процедурата на оцветяване HER2 IQFISH в апарата Dako Omnis (обобщена в таблица1) може да се следи от работната станция Dako Link Omnis: Таблица 1. Опростен преглед на стъпките от протокола за оцветяване HER2 IQFISH. Стъпка Реагент Време и температура Отстраняване на парафин Откриване на епитоп Clearify (средство за почистване) ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 10 минути, 38 C 15 минути, 97 C Промивка ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 2 x 3 минути, 32 C Разреждане* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 минути, 15 минути или 20 минути Изсушаване 15 минути, 45 C Денатурация 10 минути, 66 C Хибридизация HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 минути, 45 C Цялостно промиване ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 минути, 61 C * Може да се избира измежду три утвърдени времена на разграждане на пепсина чрез използването на посочените по-горе HER2 IQFISH протоколи. P04125BG_03/GM333 стр. 11/56

12 Рак на гърдата Ако не предстоят допълнителни ISH оцветявания, приведете реагентите до препоръчителните температури за съхранение. Б.4. Процедура след оцветяването Отстранете слайдовете и приложете до 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), съдържаща DAPI, в целевата област на слайда. Тъканният срез трябва да бъде напълно покрит от Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Приложете покривно стъкло. ЗАБЕЛЕЖКА: Слайдовете може да се интерпретират след 15 минути или в рамките на 7 дни след заливка. Така или иначе избледняването настъпва, ако слайдовете се изложат на светлина или висока температура. За да се намали до минимум избледняването, съхранявайте слайдовете на тъмно при температура C. Контрол на качеството - Гърда 1. Сигналите трябва да бъдат ярки, отчетливи и лесни за оценяване. 2. Нормалните клетки позволяват вътрешен контрол на процедурата на оцветяване. Нормалните клетки трябва да имат 1-2 ясно видими зелени сигнала, които указват, че CEN-17 PNA сондата успешно е хибридизирала до центромерната област на хромозома 17. Нормалните клетки трябва също така да имат 1-2 ясно видими червени сигнала, които указват, че HER2 ДНК сондата успешно е хибридизирала до гена(ите) HER2. В следствие на формирането на тъканните срези някои нормални клетки ще имат помалко от очакваните два сигнала от всеки цвят. Неуспешното отчитане на сигнали в нормални клетки указва неуспешен анализ и резултатите трябва да се считат за невалидни. 3. Морфологията на ядрата трябва да бъде интактна, когато се извършва оценка с помощта на DAPI филтър. Многобройните призрачни клетки и общата зле изразена морфология на ядрата показва висока степен на разграждане на препарата, което е причина за загуба или прекъснатост на сигнала. Такива препарати трябва да се считат за невалидни. 4. На оценяване трябва да се подложат поне 20 туморни клетки. 5. Разликите във фиксирането, обработването и включването на тъканите в лабораторията на потребителя могат да доведат до променливи резултати, изискващи редовна оценка на вътрешните контроли. Интерпретация на оцветяването - Гърда Оценявана тъкан Трябва да се тестват само препарати от пациенти с инвазивен карцином. В случаи на карцином in situ и инвазивен карцином в един и същи препарат, трябва да се оценява само инвазивният компонент. Избягвайте области с некроза и области, в които границите на ядрото са неясни. Не включвайте ядра, които изискват субективна оценка. Пропуснете ядрата със слаба интензивност на сигнала и неспецифичен или силен фон. Преброяване на сигналите Локализирайте тумора на оцветен с хематоксилин и еозин (H&E) слайд и оценете същата област върху оцветен с FISH слайд. Сканирайте няколко области на туморни клетки, за да отчетете евентуалното наличие на хетерогенност. Изберете област с добро ядрено разпределение. Започнете анализа в горния ляв квадрант на избраната област и, сканирайки от ляво надясно, пребройте сигналите в рамките на границата на ядрото на всяко оценено ядро според указанията по-долу (вижте също приложение 2). Фокусирайте горе и долу, за да откриете всички сигнали в индивидуалните ядра P04125BG_03/GM333 стр. 12/56

13 Рак на гърдата Пребройте два сигнала с един и същи размер и разделени с разстояние, равняващо се или по-малко от диаметъра на сигнала, като само един сигнал При ядра с високи нива на амплификация на гена HER2 сигналите на HER2 може да са разположени много близо един до друг, образувайки сноп от сигнали. В тези случаи броят на сигналите на HER2 не може да се определи, а трябва да бъде приблизително изчислен. Специално внимание трябва да се обърне на зелените сигнали, тъй като сноповете сигнали на HER2 могат да покрият зелените сигнали и да ги направят невъзможни за виждане. Ако имате съмнения, моля, проверете зелените сигнали със специфичен FITC филтър. Не оценявайте ядра без сигнали или само с едноцветни сигнали. Оценявайте само ядра с един или повече FISH сигнали от всеки цвят. Указания за преброяване на сигналите 1 Не преброявайте. Ядрата се припокриват, не всички части на ядрата са видими 2 Два зелени сигнала, не оценявайте ядра само с едноцветни сигнали 3 Пребройте като 3 зелени и 12 червени сигнала (оценка на снопа) 4 Пребройте като 1 зелен и 1 червен сигнал. Два сигнала с един и същи размер и разделени с разстояние, равняващо се или по-малко от диаметъра на един сигнал, се броят като един 5 Не бройте (свръх- или недостатъчно разградени или ядра). Липсващи сигнали в центъра на ядрото (пръстеновидни ядра). 6 Пребройте като 2 зелени и 3 червени сигнала. Два сигнала с един и същи размер и разделени с разстояние, равняващо се или по-малко от диаметъра на един сигнал, се броят като един 7 Пребройте като 1 зелен и 5 червени сигнала 8 Пребройте като 3 зелени (1 зелен извън фокус) и 3 червени сигнала 9 Сноп от червени сигнали, прикриващ зелени сигнали. Проверете зелените сигнали със специфичен FITC филтър или не бройте изобщо Запишете бройките в таблица, както е показано в приложение 1. Бройте по 20 ядра от всеки хистологичен препарат, по възможност от различни туморни области (18). Изчислете съотношението HER2/CEN-17, като разделите общия брой червени HER2 сигнали на общия брой зелени CEN-17 сигнали. P04125BG_03/GM333 стр. 13/56

14 Рак на гърдата Препарати със съотношение HER2/CEN-17, което е над или равно на 2, трябва да се отчитат като HER2 ген амплифицирани (3, 18-20). Резултатите при или близо до минималното допустимо ниво (1,8-2,2) трябва да се интерпретират внимателно. Ако съотношението е близо до пределната стойност (1,8-2,2), пребройте още 20 ядра и преизчислете съотношението за 40-те ядра. Ако имате съмнения, препаратът трябва да се оцени отново. При случаи, които са на границата, се гарантира консултация между патолога и лекуващия лекар. Ограничения - Гърда 1. Само за автоматизирана употреба в апарати Dako Omnis. 2. Необходимо е специализирано обучение за избора на тъкан, фиксирането и приготвянето слайдове, както и за IQFISH интерпретация на оцветяването. Интерпретацията на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) оцветявания не трябва да се извършва от лица, страдащи от нарушено цветоусещане. 3. Резултатите от FISH зависят от третирането и обработването на тъканта преди оцветяване. Неправилното фиксиране, измиване, изсушаване, затопляне, оформяне на срези или замърсяване с други тъкани или флуиди може да окаже влияние върху хибридизацията на сондата. Противоречивите резултати може да се дължат на разлики в методите за фиксиране и включване или на вродени несиметричности в тъканта. 4. Ефективността на анализа HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) не е оценявана за проби от тумор на гърдата с микрокалцификати. 5. Отговорност на потребителя е да валидира Template IQFISH protocol. Работни характеристики - Гърда Ефикасност на хибридизацията Ефикасността на хибридизацията на HER2 IQFISH pharmdx е изследвана чрез 180 фиксирани във формалин и включени в парафин тъканни срези, тествани в три изследователски лечебни заведения. Всички 180 тъканни срези могат да бъдат преброени в съответствие с ръководствата за преброяване на продукта. Ефикасността на хибридизацията е 100%. Съотношението HER2/CEN-17, изчислено и използвано в изследванията на работните характеристики, се основава на преброяването на сигнали в 20 ядра чрез дадените насоки за оценяването в раздел Интерпретация на оцветяването на тази инструкция за употреба. Аналитична чувствителност Аналитичната чувствителност на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е изследвана чрез 20 различни тъканни препарти от карцином на гърдата (10 проби с амплифициран статус на гена HER2 и 10 неамплифицирани проби). Съотношението между броя HER2 сигнали и CEN-17 сигнали е изчислено въз основа на преброяването на сигналите в 20 ядра на нормални клетки в рамките на тъканната проба. Съотношението HER2/CEN-17 за нормални клетки, установено в 20-те хистологични препарата на карцином на гърдата, е между 0,97-1,11. P04125BG_03/GM333 стр. 14/56

15 Аналитична специфичност HER2 ДНК сондите в HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) са подредени в крайна последователност и картирани за потвърждаване на общо покритие от 218 kb, включително гена HER2. Рак на гърдата CEN-17 PNA сондите в HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) са тествани посредством FISH, поотделно и заедно, за да се потвърди тяхната специфична хибридизация до центромерната област на хромозома 17. За изключване на кръстосана хибридизация до хромозоми, различни от хромозома 17, са проведени проучвания на метафазните пластинки според стандартните процедури за контрол на качеството на Dako. Оценени са общо 275 метафазни пластинки с отчетливи сигнали за специфична хибридизация на HER2 ДНК и CEN 17 PNA комплекти сонди. Във всички 275 случая хибридизацията е специфична за хромозома 17. При никой от 275-те случая не се забелязва кръстосана хибридизация до локусите на други хромозоми. От това следва, че специфичността на сондата е 100% (275 от 275). За измерване способността на IQFISH анализа единствено да идентифицира целевите вещества HER2 и CEN-17 без вмешателство от страна на други вещества, са извършени изследвания на хистологични препарати на карцином на гърдата, като са пропуснати HER2 и CEN-17 сондите от хибридизационни смеси, и е употребен само хибридизационен буферен разтвор. Общо 20 препарата са оценени за наличието на сигнали, които не са свързани с комплекта сонди. Няма засичане на други хромозомни цели или да е наблюдавана намеса в тясно свързани субстанции в някой от 20-те препарата. Изследвания на надеждността Надеждността на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) анализа е тествана при различна концентрация на PNA сонди, време за откриване на епитоп, период на инкубация на пепсина, време на денатурация, време на хибридизация, както и време за цялостно промиване и температура. Различните параметри са тествани на пет FFPE хистологични препарата за рак на гърдата (представени са амплифицирани и неамплифицирани хистологични препарати). Всички параметри са тествани под и над стандартните настройки на протокола с изключение на концентрацията на PNA сонда и температурата на цялостно промиване, за които стандартната настройка на протокола е включена в настройките. Тестовите параметри са: Концентрация на PNA сонда: Тествана при 100% и +/-17%. Време за откриване на епитоп: Тествано при 13 мин 45 сек и 16 мин 15 сек. Период на инкубация на пепсина: Тестван при 14 мин 45 сек и 16 мин 15 сек. Време на денатурация: Тествано при 9 мин 45 сек и 10 мин 45 сек. Време на хибридизация: Тествано при 70 мин и 80 мин. Време за цялостно промиване: Тествано при 8 мин 45 сек и 11 мин 15 сек. Температура на цялостно промиване: Тествана при 59 C, 61 C и 63 C. Трите концентрации на PNA сонди са оценени в разделена на малки части структура на експеримента (JMP инструмент, SAS), което е извършено с 12 различни протоколи за оцветяване, както е показано на таблица 2. P04125BG_03/GM333 стр. 15/56

16 Рак на гърдата Таблица 2. Дванадесет различни протокола за оцветяване, използвани в изследването на надеждността. Тестови параметър Протокол за надеждност Време за откриване на епитоп (мин) Период на пепсина (мин) Време на денатурация (мин) Време на хибридизация (мин) Време за цялостно промиване (мин) Температура на цялостно промиване ( 0 C) PNA конц. в комплект сонди 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Всички пет хистологични препарати са оцветени, като се използват всички 12 протокола. Резултатът от изследването на надеждността е интензивност на сигнала и качество на морфологията. Всички протоколи са излъчили оцветяване във всички хистологични препарати (общо 60) с ярки, отличителни и лесни за оценка сигнали и по този начин подходящи за преброяване на сигналите. Освен това ефектът от дебелината на тъканния срез върху резултатите от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) анализа е тестван при различна дебелина на среза на FFPE хистологични препарати на рак на гърдата. Общо пет последователни срези от пет препарата на човешки карцином на гърдата с различна дебелина (3, 4, 5, 6 и 7 µm) са тествани с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Средният коефициент на изменението на съотношението на HER2/CEN-17 е 5,8% (вариращ от 4,3% до 7,1%). Възпроизводимост Възпроизводимостта за всеки ден и всяка партида в рамките на лабораторията е тествана чрез HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Изследването е проектирано като вътрешно, заслепено, рандомизирано изследване на съотношенията HER2/CEN-17 чрез срези от осем различни фиксирани във формалин, включени в парафин препарати от рак на гърдата с различни нива на амплификация на гена HER2. Осемте препарата са тествани с HercepTest и представят два препарата с HER2 IHC 0/1+, два с HER2 IHC 2+, два с HER2 IHC 3+ и два препарата с предварително определено HER2/CEN-17 FISH съотношение между 1,5 и 2,5, получено чрез HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731). Всеки препарат е оцветен с три различни партиди от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) в пет непоследователни дни. Общо 240 тъканни оцветявания са обработени за цялото изследване, като всяка комбинация е оцветена в две идентични копия. Измененията в съотношенията между дните и партидите са показани на фигура 1. Данните са анализирани, използвайки Box-Cox трансформация чрез Модела на случайния ефект за получаване на еднородност на дисперсията на данните. Общият коефициент на изменението е установен да бъде 4,3% и е открито, че изменението за ден и партида допринася съответно с 1,5% и 0%. P04125BG_03/GM333 стр. 16/56

17 Рак на гърдата Фигура 1. HER2/CEN-17 съотношения, получени в лабораторни условия в изследване на възпроизводимостта на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), включващи целеви резултати за възпроизводимостта за всеки ден и всяка партида. В допълнение възпроизводимостта за всеки ден и всяко лечебно заведение на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е тествана външно в стратифицирани и заслепени изследвания в три лечебни заведения (едно в САЩ и две в Европа) на тъканни срези от 12 различни фиксирани във формалин, включени в парафин препарати от рак на гърдата. Три от препаратите са HER2 IHC 0/1+, три са HER2 IHC 2+, три са HER2 IHC 3+ и три препарата имат предварително определено HER2/CEN-17 FISH съотношение между 1,5 и 2,5, получено съответно чрез HercepTest и HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731). Препаратите са оцветени и анализирани в изследователски лечебни заведения. Всеки препарат е оцветен минимум пет пъти за минимум пет непоследователни дни и оценен от един наблюдател за всяко заведение. 192 срези са оцветени и включени в статистическия анализ. Данните са анализирани чрез Box-Cox трансформация и са изчислени компоненти на дисперсията. Общият коефициент на изменението, базиращ се на 95% горна граница на достоверност, е 15%. Изменението на съотношението HER2/CEN-17 за ден и лечебно заведение е представено на фигура 2. Фигура 2. Диаграма на изменението на съотношенията HER2/CEN-17 в нетрансформирани единици, получени от изследването за всеки ден и всяко лечебно заведение на възпроизводимостта на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) на хистологични препарати на рак на гърдата. Анализът HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е тестван за възпроизводимост на всеки наблюдател като част от вътрешно ръководено изследване на сравнение на методите чрез използването на трима наблюдатели за получаване на независима оценка на оцветените препарати. Възпроизводимостта е тествана на 140 различни човешки препарати на карцином на гърдата с неамплифициран и амплифициран статус на гена HER2. Данните са P04125BG_03/GM333 стр. 17/56

18 Рак на гърдата анализирани чрез Box-Cox трансформация. Средният коефициент на изменението за всеки наблюдател е 9%. Повторяемост Повторяемостта в лабораторни условия на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е тествана чрез последователни срези от осем човешки препарати на карцином на гърдата с неамплифициран и амплифициран статус на гена HER2. Тъканите са тествани в две идентични копия в пет непоследователни дни с три различни партиди в общо 240 слайда (120 срези по две идентични копия). Моделът на случайния ефект, използван за анализ на данни, влияе на дисперсията на свойствата за дни и партиди (както е показано във вътрешното изследване на възпроизводимостта). Остатъчната дисперсия е равна на дисперсията между копията и оттам на повторяемостта. Горната граница на достоверността 95% за всеки повтарящ се коефициент на изменението е 4,4%. Изследвания за сравнение на методите Сравнение на резултатите от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) с тези от HER2 IQFISH pharmdx HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е сравнен с HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731) в сравнително изследване на 140 човешки хистологични препарати на карцином на гърдата. Препаратите съдържат 77 случая на неамплифициран HER2 и 63 случая на амплифициран HER2 с известен резултат от HercepTest, както е показано в таблица 3. Таблица 3. Разпространение на препаратите въз основа на резултата от HercepTest и резултата от HER2 FISH (статуса на гена HER2), получени с HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731). HercepTest оценка на оцветяване Общо n HER2 FISH статус Амплифициран Неамплифициран Общо FISH тествани проби Резултатите от кръстосаната табулация на статуса на гена HER2, получени чрез двата анализа, с изчисляване на процент на цялостно съответствие (OPA), процент на положително съответствие (PPA) и процент на отрицателно съответствие (NPA), са показани на таблица 4. Корелацията между съотношенията HER2/CEN-17 чрез двата анализа е показана на фигура 3. Таблица 4. Кръстосана табулация на статуса на гена HER2, получена чрез HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731) и HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). HER2 генен статус (Dako Omnis) Неамплифицир ан HER2 генен статус (K5731) Неамплифициран Амплифициран Общо Амплифициран Общо OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% P04125BG_03/GM333 стр. 18/56

19 Рак на гърдата Фигура 3. Корелация между съотношенията HER2/CEN-17 чрез HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731) на 140 препарати на рак на гърдата (линейно съвпадение: y = 0,11 + 0,95*x; R 2 = 0,97. Претеглена с инверсна дисперсия, за да позволи линейно съвпадение). HER2/CEN-17 съотношенията са трансформирани в регистри за анализ. Интервалът на достоверност от 95% за средната разлика между двата метода за оцветяване при съотношение HER2/CEN-17 = 2 е установена да бъде [0,002; 0,031]. Това означава, че разлика по-голяма от 3% не се очаква при достоверност 95%. Средно квадратичната грешка (RMSE) е 9%, показваща размера на средната флуктуация около средната стойност. Сравнение на резултатите от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) с тези от PathVysion HER-2 DNA Probe Kit HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е сравнен с PathVysion HER-2 DNA Probe Kit в сравнително изследване на 140 човешки хистологични препарати на карцином на гърдата. Препаратите съдържат 80 случая на неамплифициран HER2 и 60 случая на амплифициран HER2 с известна оценка от HercepTest, както е показано в таблица 5. Таблица 5. Разпространение на препаратите въз основа на оценката от HercepTest и оценката от HER2 FISH (статуса на гена HER2), получени с HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731). HercepTest оценка на Общо оцветяване n HER2 FISH статус Амплифициран Неамплифициран Общо FISH тествани проби Резултатите от кръстосаната табулация на статуса на гена HER2, получени чрез двата анализа, с изчисляване на процент на цялостно съответствие (OPA), процент на положително съответствие (PPA) и процент на отрицателно съответствие (NPA), са показани на таблица 6. Корелацията между съотношенията HER2/CEN-17 чрез двата анализа е показана на фигура 4. P04125BG_03/GM333 стр. 19/56

20 Рак на гърдата Таблица 6. Кръстосана табулация на статуса на гена HER2, получена чрез PathVysion HER-2 DNA Probe Kit и HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). HER2 генен статус (PathVysion) Неамплифициран Амплифициран Общо HER2 генен Неамплифициран статус (Dako Амплифициран Omnis) Общо OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Фигура 4. Корелация между съотношенията HER2/CEN-17 чрез HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и PathVysion на 140 препарата на рак на гърдата (линейно съвпадение: y = 0,01 + 0,98*x; R 2 = 0,96. Претеглена с инверсна дисперсия, за да позволи линейно съвпадение). HER2/CEN-17 съотношенията са трансформирани в регистри за анализ. Интервалът на достоверност от 95% за средната разлика между двата метода за оцветяване при съотношение HER2/CEN-17 = 2 е установена да бъде [0,001; 0,031]. Това означава, че разлика по-голяма от 3% не се очаква при достоверност 95%. Средно квадратичната грешка (RMSE) е 10%, показваща размера на средната флуктуация около средната стойност. Клинична полза при избор на пациенти за лечение с Herceptin (трастузумаб) HER2 FISH pharmdx Kit е проучвана в сравнителни изследвания с PathVysion HER-2 DNA Probe Kit и Dako HercepTest. Резултатите от HER2 FISH тестването са налични за общо 940 препарати на рак на гърдата. Сравнение на резултатите от HER2 FISH pharmdx Kit с тези от PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Три изследвания са извършени, за да се сравнят резултатите от теста с HER2 FISH pharmdx Kit спрямо резултатите от теста с PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (вижте таблица 7). Изследванията са извършени в отделни географски локации и няма припокриване в използването на препаратите. Тествани са общо 328 препарати. P04125BG_03/GM333 стр. 20/56

21 Рак на гърдата Таблица 7. Кратко описание на данните от изследванията за сравнение на FISH метод. Предназначение на изследването Съвпадение (95% интервал на достоверност) Процент на положително съответствие (95% интервал на достоверност) Процент на отрицателно съответствие (95% интервал на достоверност) Изследване на съвпадение (датски препарати, N=190) 93,68% (90,22% - 97,14%) 86% (77,34% - 95,08%) 97% (94,05% - 99,89%) Изследване на съвпадение (японски препарати, N=52) Изследване на съвпадение (френски препарати, N=86) (21)* 96,15% N/A 97% N/A 96% N/A * Сравнителните данни са предоставени в статията, но HER2 FISH анализът не е идентифициран. Получени са общо 12 различни тестови резултати между тест с HER2 FISH pharmdx Kit и тест с PathVysion HER-2 DNA Probe за датски клинични препарати (вижте таблица 8). Таблица 8. Кратко описание на данните от 12-те различни резултати от тестовете. HER2 FISH(положителен)/PathVysion(отрицателен) ИД HER2 FISH съотношение 160 2,10* (1,82-2,51) 208 3,61 (2,95-4,73) 306 2,20* (1,79-2,24) 846 2,58 (2,06-3,50) PathVysion съотношение 1,51 (1,39-1,68) 1,62 (1,51-1,82) 1,33 (1,18-1,44) 1,51 (1,42-1,76) HercepTest оценка HER2 FISH(отрицателен)/PathVysion(положителен) ИД HER2 FISH съотношение ,68 (1,38-1,83) ,44 (1,07-1,83) ,7 (1,52-1,95) ,44 (1,16-1,83) 735 1,68 (1,40-1,99) 746 1,05 (0,96-1,18) 837 1,52 (1,48-1,79) 881 1,83* (1,15-2,69) PathVysion съотношени е 2,02* (1,84-2,29) 2,21* (1,94-2,64) 2,15 (2,02-2,45) 2,55 (2,38-3,26) 2,03* (1,89-2,19) 4,53 (4,27-5,17) 2,15 (2,10-2,67) 2,68 (2,39-3,14) * CI на средните включени регистрирани съотношения 2,0. Цифрите в скоби са 95% CI HercepTest оценка В този различен анализ са използвани регистрирани съотношения. 95%-ният интервал на достоверност е изчислен за 60 регистрирани съотношения от ядрото, които са използвани за изчисляване на съотношението на PathVysion HER-2 DNA Probe. За 4-те примера, при които HER2 FISH pharmdx Kit е с положителен резултат, а PathVysion HER-2 DNA Probe e с отрицателен, няма интервал, който да включва критичната стойност 2. За 8-те примера HER2 FISH pharmdx Kit е с отрицателен резултат, а PathVysion HER-2 DNA Probe e с положителен, 95% CI от 3 ( 234, 284 и 735) включва критичната стойност 2. Сходно на това 95%-ният интервал на достоверност е изчислен за регистрираните съотношения от ядрото, които са използвани за изчисляване на съотношението на HER2 FISH pharm Dx Kit. За 4-те примера HER2 FISH pharmdx Kit е с положителен резултат, а PathVysion HER-2 DNA Probe e с отрицателен, 2 включват критичната стойност 2 ( 160 и 306). За осемте примера, при които HER2 FISH pharmdx Kit е с отрицателен резултат, а PathVysion HER-2 DNA Probe e с положителен, 95% CI от 1 ( 881) включва критичната стойност 2. Сравнение на резултатите от HER2 FISH pharmdx Kit с тези от HercepTest Проведени са четири изследвания, сравняващи резултати от HER2 FISH pharmdx Kit с такива от HercepTest. Общо 940 препарати са сравнени, като резултат от 3+ оценка на P04125BG_03/GM333 стр. 21/56

22 Рак на гърдата оцветяване е използван като положителен IHC резултат в HercepTest анализа (вижте таблица 9). Таблица 9. Кратко описание на сравнителните изследвания на HER2 FISH pharmdx Kit и IHC (HercepTest ). Предназначение на изследването Съвпадение (95% интервал на достоверност) Процент на положително съответствие (95% интервал на достоверност) Процент на отрицателно съответствие (95% интервал на достоверност) Датски клинични препарати (N=682) 93,11% (91,21% - 95,01%) 91% (87,39% - 94,57%) 94% (92,12% - 96,46%) Японски клинични препарати (N=52) Френско изследване (N=86) (31) Датско пилотно изследване (N=120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% Данни за разпространението от резултатите от тестовете HercepTest и HER2 FISH за датски клинични препарати са представени в таблица 10. Таблица 10. Разпространение на статуса на HER2 от HercepTest и HER2 FISH pharmdx Kit. HercepTest оценка на Общо оцветяване n % % HER2 FISH статус Амплифициран Неамплифициран Общо FISH тествани проби P04125BG_03/GM333 стр. 22/56

23 Рак на гърдата Отстраняване на неизправности - Гърда Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 1. Няма сигнали или слаби сигнали 1a. Реагентите са били изложени на високи температури при транспортиране или съхранение 1б. Микроскопът не функционира правилно Неподходящ комплект филтри Неправилна лампа Твърде стара живачна лампа Замърсени и/или напукани колекторни лещи Неподходящо имерсионно масло 1a. Проверете условията на съхранение. Уверете се, че е имало сух лед при получаването на доставките с IQISH комплект сонди и пепсин. Уверете се, че реагентите са били съхранявани съгласно указанията. 1б. Проверете микроскопа и се уверете, че използваните филтри са подходящи за употреба с комплекта сонди с флуорохром и че е избрана правилната живачна лампа в пределите на очаквания ѝ експлоатационен живот (вижте приложение 2). Ако имате съмнения, моля, свържете се с местния доставчик на микроскопа. 1в. Слаби сигнали 1в. Избягвайте продължителния микроскопски преглед и сведете до минимум излагането на източници на силна светлина. 1г. Неправилно идентифицирани буфери 1г. Заменете наливните буфери и се уверете, че правилно сте ги регистрирали (в работната станция) и идентифицирали (на сензорния екран). За повече информация се консултирайте с Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis. Моля, имайте предвид: ISH Pre- Treatment Solution е зелен, а ISH Stringent Wash Buffer е жълт. 2. Области без сигнал 2. Уловени са въздушни мехурчета по време на заливката 2. Не допускайте въздушни мехурчета. Ако забележите такива, внимателно ги отстранете с помощта на форцепс. P04125BG_03/GM333 стр. 23/56

24 Рак на гърдата Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 3. Прекомерно фоново оцветяване 3a. Неправилна фиксация на тъканта 3a. Уверете се, че се използват само фиксирани във формалин, включени в парафин тъканни срези. 4. Зле изразена морфология на тъканта 5. Високо ниво на зелена автофлуоресценци я на слайда, включително в области без FFPE тъкан 3б. Продължително излагане на хибридизиран срез на силна светлина 4a. Неправилна обработка с пепсин 4б. Ако обработката с пепсин е прекалено продължителна или дебелината на срезите е много малка, това може да доведе до появата на призрачни клетки или пръстеновидни клетки 5. Употреба на предметни стъкла с изтекъл срок на годност или непрепоръчани такива 3б. Избягвайте продължителния микроскопски преглед и сведете до минимум излагането на силна светлина. 4a. Смяна с друг от трите различни протокола за оцветяване. Уверете се, че ISH Pepsin (Dako Omnis) се съхранява при правилната температура. 4б. Опитайте протокол за оцветяване със скъсен период на инкубация на пепсина. Уверете се, че дебелината на среза е 4 6 µm. 5. Изберете предметни стъкла, както е указано. Уверете се, че предметните стъкла не са с изтекъл срок на годност. ЗАБЕЛЕЖКА: Ако проблемът не може да бъде отнесен към някоя от горепосочените причини или ако предложението за корективни действия не реши проблема, моля, свържете се с отдел Техническо обслужване на Dako за допълнително съдействие. P04125BG_03/GM333 стр. 24/56

25 Рак на гърдата Приложение 1 - Гърда HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), код GM333 Схема на оценяване Дата на процедурата: Партида HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Идентификационен номер на дневника на процедурата на оцветяване: Идентификационен номер на препарата: Ядро HER2 оценка (червен) Пребройте сигнали в 20 ядра CEN-17 оценка (зелен) Ядро Общо (1-10) Общо (11-20) HER2 оценка (червен) CEN-17 оценка (зелен) За определяне на съотношението HER2/CEN-17, пребройте количеството HER2 сигнали и количеството на CEN-17 сигнали в същите 20 ядра и разделете общия брой HER2 сигнали на общия брой CEN-17 сигнали. Ако съотношението HER2/CEN-17 е близо до пределната стойност (1,8-2,2), пребройте още 20 ядра и преизчислете съотношението за 40 те ядра. Съотношението при или близо до минималното допустимо ниво (1,8-2,2) трябва да се интерпретира внимателно (вижте указанията за преброяване). Обща оценка (1-20) HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 P04125BG_03/GM333 стр. 25/56

26 Рак на гърдата Ядро HER2 оценка (червен) Пребройте сигнали в още 20 ядра CEN-17 оценка (зелен) Ядро Общо (21-30) Общо (31-40) HER2 оценка (червен) CEN-17 оценка (зелен) Изчислете съотношението HER2/CEN-17 въз основа на 40-те преброени ядра Обща оценка (1-40) HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 Съотношение < 2: Не е наблюдавана амплификация наher2 гена Съотношение 2: Наблюдавана е амплификация наher2 гена Дата и подпис, техник: Дата и подпис, патолог: За указания за оценяване: вижте Интерпретация на оцветяването. P04125BG_03/GM333 стр. 26/56

27 Рак на гърдата Приложение 2 - Гърда HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), код GM333 Спецификации на флуоресцентен микроскоп Dako препоръчва да се използва следното оборудване с HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Тип микроскоп Епифлуоресцентен микроскоп 2. Лампа Живачна лампа, 100 W (поддържайте запис на време на работа) 3. Цели За скрининг на тъканта са приложими цели за 16X или 20X увеличение с помощта на имерсионно масло За силно увеличение и преброяване на сигналите са препоръчителни само цели като например 100х увеличение с помощта на имерсионно масло 4. Филтри Филтрите се проектират индивидуално за всеки специфичен флуорохром и трябва да се избират по съответния начин. Dako препоръчва използването на специфичен DAPI филтър в комбинация с висококачествен Texas Red/FITC двоен филтър. DAPI филтър Texas Red/FITC двоен филтър Texas Red и FITC единични филтри могат да се използват за потвърждение и преброяване Флуорохром Дължина на вълната на възбуждане Дължина на вълната на излъчване FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm За всеки тип микроскоп има специфичен филтър и използването на подходящите филтри е от ключово значение за интерпретацията. Ако ви е необходима подробна информация, моля, свържете се със своя доставчик на микроскоп или представител на Dako. 5. Масло Нефлуоресциращо масло Предпазни мерки Не се препоръчва живачна лампа, 50 W Не могат да се използват родаминови филтри Не се препоръчват тройни филтри Неоптимизираният микроскоп може да доведе до проблеми с интерпретацията на флуоресцентните сигнали. Важно е експлоатационният живот на източника на светлината да не е изтекъл и тя да е правилно подравнена и фокусирана. Клиентите трябва да следят и следват препоръките на производителя на живачната лампа. Микроскопът трябва да е преминал поддръжка, а живачната лампа трябва да е изравнена, преди да се интерпретират резултатите. Трябва да се положат усилия пробата да бъде изложена на възможно най-малко светлина на възбуждане, за да се сведе до минимум отслабването на флуоресценцията. P04125BG_03/GM333 стр. 27/56

28 Рак на гърдата Препоръчваме ви да обсъдите установката на вашия конкретен микроскоп с производителя, преди да пристъпите към флуоресцентна in situ хибридизация или да направите справка с литературата по въпроса. P04125BG_03/GM333 стр. 28/56

29 Рак на стомаха Кратко описание и обяснение - Стомах Човешкият ген HER2 (известен и като ERBB2 или NEU) е разположен върху хромозома 17 и кодира протеина HER2 или p185 HER2. Протеинът HER2 е тирозин-киназен мембранен рецептор с хомология с рецептора на епидермалния фактор на растежа (EGFR или HER1) (1-2). Генът HER2 присъства в 2 копия във всички нормални диплоидни клетки. Свръхекспресията на протеина HER2 и амплификацията на гена HER2 при рака на стомаха са демонстрирани в голям брой изследвания (разгледани в (23). HER2 позитивността може да се открие при приблизително 20% от пациентите чрез IHC или FISH (23). Предварителните клинични ин витро и ин виво изследвания показват, че трастузумаб (Herceptin ) е ефективен при различни видове рак на стомаха, което води до започване на няколко клинични изследвания (23-27). Всички пациенти във фаза III на изследването BO18255 (ToGA Открито, рандомизирано, многоцентрово, изследване от фаза III на трастузумаб в комбинация с флуоропиримидин и цисплатин в сравнение с единствено химиотерапия като терапия от първа линия при пациенти с HER2-позитивен рак на стомаха в напреднал стадий ), спонсорирано от Hoffmann-La Roche AG, бяха избрани с помощта на Dako HercepTest (IHC) и Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH), като HER2 позитивността е определена като IHC 3+ или FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). Изследването демонстрира клиничната полза както от HercepTest (IHC), така и от HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) за оценката на HER2 статуса при пациенти с аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение в напреднал стадий, за които се планира лечение с трастузумаб (28). Не бяха включени пациенти, чийто тумор няма амплификация на ген, но чийто протеин HER2 има слаба до силна свръхекспресия [FISH(-)/IHC 2+]. Следователно не е ясно дали пациентите, чиито тумори не са генно амплифицирани, но чийто протеин HER2 има свръхекспресия [т.е. FISH(-), IHC 2+ или 3+], ще се повлияят от лечението с Herceptin. Изследването също така демонстрира, че амплификацията на ген (FISH) и свръхекспресията на протеин (IHC) не са взаимосвързани така, както при рака на гърдата; следователно не трябва да се използва един метод за определяне на HER2 статуса. Този продукт (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е IQISH комплект сонди за автоматизиран директен FISH анализ, който открива амплификацията на гена HER2. Този продукт трябва да се използва със специфични допълнителни реагенти в Dako Omnis и се получава от ръчно извършен анализ на амплификацията на HER2-гена, HER2 IQFISH pharmdx, код K5731. Принцип на процедурата - Стомах HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е IQISH сонда, която се състои от комбинация от Texas Red маркирани ДНК сонди, покриващи 218 kb област, включващи HER2 гена върху хромозома 17, и от комбинация от флуоресцеин маркирани пептидно-нуклеинова киселина (PNA) сонди, (13) насочени към центромерната област на хромозома 17 (CEN-17). Специфичната хибридизация до две цели води до формиране на отчетлив червен флуоресцентен сигнал при всеки локус на ген HER2 и отчетлив зелен флуоресцентен сигнал при всеки центромер на хромозома 17. Оценката на амплификацията на гена HER2 с помощта на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е изцяло автоматизиран метод на апарата Dako Omnis. Три различни валидирани HER2 FISH протокола за оцветяване могат да бъдат избрани в софтуера на работната станция Dako Link Omnis. Протоколите се различават само по времето на разграждане на пепсина, като впоследствие може да се избере разграждане на пепсина за 10 минути (кратък протокол), 15 минути (протокол със средна продължителност) или 20 минути (дълъг протокол) (вижте още по-долу). За първоначален анализ се препоръчва протокола със средна продължителност. P04125BG_03/GM333 стр. 29/56

30 Рак на стомаха След оцветяване в Dako Omnis препарати се заливат с Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), която съдържа 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), и се поставят на покривно стъкло. С помощта на флуоресцентен микроскоп, оборудван с подходящите филтри (вижте приложение 5), се локализират туморните клетки и се извършва преброяване на червените (HER2) и зелените (CEN-17) сигнали. Тогава се изчислява съотношението HER2/CEN-17. Нормалните клетки в анализирания тъканен срез ще изпълняват ролята на вътрешна положителна контрола на ефективността на предварителната обработка и хибридизацията. За подробности вижте раздела Интерпретация на оцветяването. Моля, консултирайте се с Ръководството(ата) за потребителя на Dako Omnis за подробни инструкции относно зареждането и свалянето на слайдове, ISH Lids (Dako Omnis), код GC102, реагенти, наливни течности и отпадъци. Реагенти - Стомах HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителните реагенти могат да се поръчат отделно като единични реагенти. Осигурени материали HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml, готова за употреба комбинация от Texas Red маркирани HER2 ДНК сонди и флуоресцеин маркирани CEN-17 PNA сонди, предоставяни в IQISH хибридизационен буферен разтвор. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) се доставя върху сух лед. За да се гарантира, че реагентът не е излаган на високи температури при транспортиране, при получаване на пратката сухият лед трябва да се съдържа в нея. Флаконите за реагент с размразено съдържание трябва винаги да са в изправено положение при съхранение и работа. Флаконът за реагент съдържа позлатено метално топче, което позволява смесването на реагента с помощта на Dako Omnis Mixing Device (вижте Ръководството за потребителя за Dako Omnis Mixing Device). Важно е реагентът да се смеси щателно, преди да се зареди в Dako Omnis. Материали, които са необходими, но не са осигурени Допълнителни реагенти Необходимо е следните реагенти да се намират в апарата Dako Omnis, за да се извърши анализ на амплификацията на гена HER2 с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml, концентриран 20x; да се разтваря в 3,5 L наливна бутилка на Dako Omnis (код GC109). Продуктът съдържа антимикробен агент и инертен зелен цвят за лесна идентификация и улеснение на потребителя. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96% етанол (готов за употреба). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml разтвор на пепсин A (готов за употреба), ph 2,0; съдържа стабилизатор и антимикробно средство. Пепсинът се доставя в сух лед. За да се гарантира, че реагентът не е излаган на високи температури при транспортиране, при получаване на пратката сухият лед трябва да се съдържа в нея. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml буферен разтвор от физиологичен разтвор на натриев цитрат, концентриран 20x; да се разтваря в съотношение 1:20 в 3,5 L наливна бутилка на Dako Omnis (GC109). Продуктът съдържа антимикробен агент, почистващ препарат и инертен жълт цвят за лесна идентификация и улеснение на потребителя. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml флуоресцентна среда за заливка (готова за употреба) с DAPI. P04125BG_03/GM333 стр. 30/56

31 Рак на стомаха Въпреки че описаните по-горе реагенти не са предоставени с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), те са описани накратко по-долу. За повече информация, моля, направете справка с инструкциите за употреба за всяко устройство. Допълнителни реагенти и устройства Dako Omnis, код Gl100 Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), код GC807 Clearify, код GC810 Dako Omnis Mixing Device, код GC116 ISH Lid, код GC102 ISH Cleaning Solution, код GC207 Покривни стъкла за заливка (24 mm x 50 mm) Моля, направете справка с основното и разширеното ръководства за потребителя на Dako Omnis за използване на допълнителни реагенти и устройства. Микроскопско оборудване и принадлежности Филтри за флуоресцентен микроскоп: DAPI и FITC/Texas Red двоен филтър или FITC и Texas Red моно филтри - вижте приложение 5 за подробности. Използването на DAPI филтър при високо увеличение въздейства отрицателно на интензивността на сигнала. Трябва да се избягват дългите периоди на излагане. Трябва да се използва флуоресцентен микроскоп със 100 W живачна лампа като източник на светлина. Други източници на светлина не се препоръчват за тези филтри. Папка за микроскопски слайдове (картонена тава за 20 слайда с капак на панти или друг подобен) Предпазни мерки - Стомах 1. За употреба при ин витро диагностика. 2. За професионална употреба. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) съдържа 10-<25% етилен карбонат и 3-<5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е означен: Внимание H319 Предизвиква сериозно дразнене на очите. P280 Използвайте предпазни средства за очите и лицето. P264 Да се измие ръце старателно след употреба. P305 + P351 + P338 ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. Като общо правило не се допуска лица под 18 годишна възраст да работят с продукта. Потребителите трябва да бъдат подробно запознати с правилната работна процедура, опасните свойства на продукта и необходимите инструкции за безопасност. За допълнителна информация, моля, направете справка с информационния лист за безопасност (SDS). 4. Хистологичните препарати, преди и след фиксиране, както и всички материали, влезли в контакт с тях, трябва да се третират като пренасящи инфекция материали и да се изхвърлят, като се вземат подходящите предпазни мерки (14). Никога не преливайте реагентите с уста и не позволявайте на реагентите и пробите да влизат в контакт с P04125BG_03/GM333 стр. 31/56

32 Рак на стомаха кожата и лигавиците. При контакт на реагентите с чувствителни места, промийте с обилно количество вода. 5. Сведете до минимум микробното замърсяване на реагента, за да избегнете неточни резултати. 6. Методи за фиксиране на тъкани и дебелина на препарата, различни от определените, могат да окажат влияние на морфологията на тъканите и/или интензивността на сигнала. 7. Реагентът е разреден оптимално. Допълнителното разреждане може да доведе до влошаване на работните характеристики. 8. Носете подходящи лични предпазни средства, за да избегнете контакт с очите и кожата. За допълнителна информация, моля, направете справка с информационния лист за безопасност на материала (SDS). 9. Неизползваният разтвор трябва да се изхвърля в съответствие с местните, държавните и федералните разпоредби. 10. Поради разнородния характер на препаратите от рака на стомаха е важно да се извърши пълно сканиране на целия препарат за оценка на разпространението на сигнала, преди да бъде избрана област за преброяване на сигнали. 11. Не се препоръчва оценката на много малки препарати (т.e. препаратите трябва да имат интактна морфология и достатъчен брой ядра за преброяване). 12. Ако HER2 FISH анализът е извършен върху препарат от биопсия, трябва да се анализират няколко (7-8) оценяеми биопсии от различни области на тумора, за да се гарантира надеждно определяне на HER2 статуса. 13. За определяне на всички тъканни ядра в проба от биопсия е важно да се провери оцветения с хематоксилин и еозин слайд. 14. Амплификацията на гена HER2 и свръхекспресията на протеинa HER2 не са взаимосвързани така, както при рака на гърдата; следователно не трябва да се използва един метод за определяне на HER2 статусa. P04125BG_03/GM333 стр. 32/56

33 Рак на стомаха Съхранение - Стомах Съхранявайте HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) при < -18 C (препоръчителен диапазон от -18 C до -25 C) на тъмно. Винаги дръжте флакона за реагент в изправено положение. Замразяването и размразяването на реагента до 10 пъти не влияе на неговата ефективност. Не оставяйте този компонент на стайна температура. Възможно е възникване на неблагоприятни въздействия, ако HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителните реагенти: ISH pepsin (Dako Omnis) и Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) бъдат изложени на топлина. Не оставяйте тези компоненти на стайна температура. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителният реагент Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) могат да бъдат повлияни неблагоприятно, ако бъдат изложени на силна светлина. Не съхранявайте тези компоненти, нито извършвайте анализ на силна светлина, като например пряка слънчева светлина. Съхранявайте допълнителните реагенти ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20х) (Dako Omnis) и Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) на тъмно при температура 2-8 C. Съхранявайте ISH Pepsin (Dako Omnis) при C. Капачето на флакона, включително щракващото горно капаче, на всички реагенти трябва да е затворено по време на съхранение. Разредените разтвори (работният разтвор на ISH Stringent Wash Buffer и работният разтвор на ISH Pre-Treatment Solution) могат да се съхраняват при температура 2-8 C в продължение на 30 дни. Не използвайте реагенти след изтичане на срока на годност, указан на контейнера за реагент. При съхранение капачето, включително щракващото горно капаче, трябва да е затворено. Ако реагентите се съхраняват при условия, различни от посочените, потребителят трябва да одобри характеристиките на реагента (15). Няма видими признаци, които да показват нестабилност на този продукт. Следователно, е важно да се оценят нормалните клетки в анализирания тъканен срез. Ако се наблюдава неочакван флуоресцентен модел, за който няма обяснение, и има съмнения за проблем с HER2 IQFISH pharmdx, моля, свържете се с отдел Техническо обслужване на Dako. Стабилност в апарата Dako Omnis Стабилността в апарата на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и допълнителните реагенти: ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) и ISH Pepsin (Dako Omnis) е 80 часа. Стабилността в апарата на разредения ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) и ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) е 7 дни. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis. Употребата на реагенти с изтекъл срок на годност ще доведе до появата на съобщение на апарата Dako Omnis; всички слайдове, оцветени с реагент с изтекъл срок на годност, ще променят статуса си на съмнителен и регистърът на слайдовете на работната станция ще покаже, че се използва реагент с изтекъл срок на годност. Приготвяне на пробите - Стомах Проби на аденорцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение от биопсии, ексцизии или резекции трябва да се третират за запазване на тъканите за FISH анализ. Стандартните методи на обработка на тъканите за имунохистохимично оцветяване трябва да се използват за всички препарати (16). При тестването на малки проби от биопсия, осигурете интактна туморна морфология и наличие на достатъчно ядра за преброяване. Ако HER2 FISH P04125BG_03/GM333 стр. 33/56

34 Рак на стомаха анализът се извърши върху препарат от биопсия, трябва да се анализират няколко (7-8) оценяеми биопсии от различни области на тумора, за да се гарантира надеждно определяне на HER2 статуса. Включени в парафин срези Само тъкани, съхранени в неутрален буфериран формалин и включени в парафин, са подходящи за употреба. Например препаратите трябва да се блокират в дебелина от 3 или 4 mm и трябва да се фиксират за часа в неутрален буфериран формалин. Препаратите от биопсия са фиксирани за 6-8 часа в изследването ToGA [относно изследването направете справка с (28)]. След това тъканите се дехидрират чрез степенувани серии етанол и ксилен, следвани от инфилтриране с разтопен парафин, осъществено при температура не по-висока от 60 C. Правилно фиксираните и включени тъкани ще се запазят за неопределено време преди формирането им на срези и заливането на слайдове, ако се съхраняват на хладно място (15-25 C) (16-17). Други фиксатори не са подходящи. От хистологичните препарати трябва да се приготвят срези с дебелина 3-6 µm. Слайдовете, изисквани за анализ на амплификацията на гена HER2, и проверката за наличие на тумор трябва да се приготвят по едно и също време. Препоръчват се минимум два серийни среза, като единият е за проверка за наличие на тумор с оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване), а другият е за анализ на амплификацията на гена HER2. Препоръчва се тъканните срези да се заливат на Dako FLEX IHC Microscope Slides, код K8020. Слайдовете Superfrost Plus (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ) също са подходящи. Уверете се, че предметните стъкла не са с изтекъл срок на годност. Препаратите трябва да се анализират в рамките на < 6 месеца от формирането на срези при съхранение при 2-25 C. ЗАБЕЛЕЖКА: Хистологичните препарати трябва да бъдат поставени на предметното стъкло в рамките на определената зона за оцветяване на слайда. Моля, направете справка с Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis за размера на зоните за оцветяване на слайда. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА - Стомах A. Приготвяне на реагентите - Стомах A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Флаконът с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) съдържа позлатено метално топче, използвано за смесване. Преди зареждането на флакона в Dako Omnis реагентът трябва да се размрази и щателно да се размеси, тъй като в замразено състояние фазата му се разделя. Използвайте Dako Omnis Mixing Device за размесването на сонди. Следвайте процедурата по-долу за размесването на сонди в Dako Omnis Mixing Device и за повече подробности вижте Ръководството за смесителя. 1. Извадете флакона HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) от фризера 2. Заредете флакона в Dako Omnis Mixing Device 3. Свържете смесителя и се уверете, че e включен зеленият индикатор за състояние 4. Изберете програмата Thaw + mix ( Размразяване + смесване ). Важно: Флакони, съхранявани под -25 C да се размразяват (непосредствено) преди зареждането на флакона в Dako Omnis Mixing Device и да се използва програмата Mix ( Смесване ). 5. Махнете флакона от смесителя. P04125BG_03/GM333 стр. 34/56

35 Рак на стомаха 6. Отворете щракващото горно капаче, чукнете го леко в посока назад и го щракнете в отвора за позициониране (вижте Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis за подробности). 7. Незабавно заредете флакона в модула за съхранение на реагент в апарата Dako Omnis. Ако по време на процедурата по оцветяване се използва функция за непрекъснато зареждане на реагент, уверете се, че времето от размесване до аспирация на флакона в Dako Omnis е поне 10 минути. Сондата HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) може отново да се размрази и да се използва до 10 пъти. Винаги размесвайте комплекта сонди HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) непосредствено преди зареждане в апарата. Не разклащайте. Общата стабилност в апарата на ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е 80 часа, когато се съхранява в модула за съхранение на реагент на Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). След престоя в апарата Dako Omnis HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) трябва незабавно да се замрази до температура < -18 C (препоръчва се температура от -18 C до -25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Пригответе работен разтвор чрез разреждане на концентрат от ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 1:20, както следва: 1. Напълнете наливна бутилка Dako Omnis 3,5 L, маркирана с PTB (син етикет), до линията за пълнене с дейонизирана вода (3,325 L). Уверете се, че преди напълване наливната бутилка е поставена на хоризонтална повърхност. 2. Изсипете докрай една бутилка концентрат 175 ml ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) в наливната бутилка. 3. Прехвърлете свалящия се етикет от бутилката с концентрат върху наливната бутилка. Затегнете капака на наливната бутилка и я обърнете внимателно 2-3 пъти. 4. Използвайте ръчния баркод скенер на Dako Omnis, за да разпознаете реагента (сканирайте свалящия се етикет и наливната бутилка). 5. Незабавно заредете наливната бутилка в апарата Dako Omnis. Разреденият разтвор може да се използва в рамките на 7 дни, когато се съхранява вътре в Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). Неизползваният разреден разтвор може да се съхранява при температура 2-8 C в продължение на 30 дни. След съхранение на студено се уверете, че разреденият разтвор е темпериран до температура от поне 18 C, преди да го заредите в Dako Omnis. ЗАБЕЛЕЖКА: Изхвърлете разредения разтвор, ако изглежда мътен. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Пригответе работен разтвор чрез разреждане на концентрат от ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 1:20, както следва: 1. Напълнете наливна бутилка Dako Omnis 3,5 L, маркирана с PTB (син етикет), до линията за пълнене с дейонизирана вода (3,325 L). Уверете се, че преди напълване наливната бутилка е поставена на хоризонтална повърхност. 2. Изсипете докрай една бутилка концентрат 175 ml ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) в наливната бутилка. 3. Прехвърлете свалящия се етикет от бутилката с концентрат върху наливната бутилка. Затегнете капака на наливната бутилка и я обърнете внимателно 2-3 пъти. 4. Използвайте ръчния баркод скенер на Dako Omnis, за да разпознаете реагента (сканирайте свалящия се етикет и след това наливната бутилка). 5. Незабавно заредете наливната бутилка в апарата Dako Omnis. P04125BG_03/GM333 стр. 35/56

36 Рак на стомаха Разреденият разтвор може да се използва в рамките на 7 дни, когато се съхранява вътре в Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). Неизползваният разреден разтвор може да се съхранява при температура 2-8 C в продължение на 30 дни. След съхранение на студено се уверете, че разреденият разтвор е темпериран до температура от поне 18 C, преди да го заредите в Dako Omnis. ЗАБЕЛЕЖКА: Изхвърлете разредения разтвор, ако изглежда мътен. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) е готов за употреба реагент. Преди зареждане в апарата Dako Omnis отворете щракващото горно капаче на флакона, чукнете го леко в посока назад и натиснете в отвора. Общата стабилност в апарата ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) е 80 часа, когато се съхранява в модула за съхранение на реагент на Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). След края на процедурата ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) може да се приведе до температура на съхранение (2-8 C), за да се запази времето на стабилност в апарата. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) е готов за употреба реагент. Преди зареждане в апарата Dako Omnis се уверете, че реагентът е размразен и отворете щракващото горно капаче на флакона, чукнете го леко в посока назад и натиснете в отвора. Общата стабилност в апарата на ISH Pepsin (Dako Omnis) е 80 часа, когато се съхранява в модула за съхранение на реагент на Dako Omnis. Оставащата стабилност в апарата се проследява от софтуера на Dako Omnis (вижте по-горе). След края на процедурата ISH Pepsin (Dako Omnis) трябва да се приведе до температура на съхранение C, за да се запази времето на стабилност в апарата. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) е готова за употреба среда за заливка, която се използва извън апарата Dako Omnis. Приведете Fluorescence Mounting Medium до температура на съхранение (2-8 C) незабавно след употреба. A.7 Допълнителни принадлежности Освен това следните принадлежности трябва да се заредят в апарата Dako Omnis: дейонизирана вода, разреден Wash Buffer 20x (Dako Omnis), код GC807, Clearify, код GC810, ISH Cleaning Solution (Dako Omnis), код GC207 и ISH Lid (Dako Omnis), код GC102, както е посочено в Ръководството(ата) за потребителя на Dako Omnis. Б. Процедура на оцветяване - Стомах Б.1 Процедурни бележки HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е хибридизационна сонда за автоматизиран пряк анализ чрез флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) в апарата Dako Omnis и заедно с допълнителните реагенти GM300, GM301, GM302, GM303 и GM304 (GM304 извън апарата) е предназначена за количественото определяне на амплификацията на гена HER2. Преди употреба потребителят трябва да прочете внимателно всички инструкции и да се запознае с всички компоненти и свързаните с тях предпазни мерки. Автоматизираната процедура на оцветяване в Dako Omnis включва депарафинизацията на тъканни срези, откриване на епитоп, разграждане на пепсин, хибридизация и цялостно промиване. Слайдовете се свалят в сухата станция за сваляне. Всички стъпки от протокола се програмират предварително в софтуера на Dako Omnis. P04125BG_03/GM333 стр. 36/56

37 Рак на стомаха Моля, консултирайте се с Ръководството(ата) за потребителя на Dako Omnis за инструкции относно зареждането на слайдове, ISH Lid, реагенти и т.н. Три утвърдени HER2 IQFISH протоколи: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium и HER2 IQFISH Pepsin Long, които се различават единствено по времето на разграждане на пепсина, са програмирани предварително в софтуера на Dako Omnis и могат да се избират за всеки от петте слайда в стойката за слайдове. Това позволява да се оптимизира разграждането на тъканта, което може да зависи от състоянията, предшестващи анализа. Протоколът HER2 IQFISH Pepsin Medium се счита за стандартния протокол. Различните протоколи за оцветяване могат да се видят на работната станция на Dako Link Omnis. В допълнение потребителят може да реши да използва Template IQFISH protocol. Оптималните условия може да варират в зависимост от типа на препарата и метода за неговото приготвяне и трябва да се валидират от всяка лаборатория. Б.2. Процедура преди оцветяването 1. Изберете протокола HER2 IQFISH, който да се приложи за всеки слайд от софтуера на работната станция Dako Link Omnis под протоколите IQFISH. 2. Разпечатайте етикетите на слайдовете и ги прикрепете към предметните стъкла. 3. Поставете слайдовете в стойката за слайдове. За повече информация вижте Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis. В стойката за слайдове може да се поместят от един до пет слайда. Препоръчва се поне два слайда да се оцветят с процедурата на оцветяване HER2 IQFISH. 4. Заредете стойката за слайдове в Dako Omnis. 5. Заредете ISH Lid (по един ISH Lid на стойка за слайдове) в Dako Omnis. 6. Уверете се, че наливните бутилки с течности се намират в и са регистрирани от апарата Dako Omnis. Течности в наливната бутилка: Clearify (средство за почистване), разреден ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis), разреден ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) и разреден Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Заредете ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) и ISH Pepsin (Dako Omnis), току-що размесен HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и ISH Cleaning Solution в модула за съхранение на реагент. Уверете се, че всички щракващи горни капачета на флакони са отворени. 8. Следвайте инструкциите на сензорния екран и докоснете Done ( Готово ), за да започнете процедурата на оцветяване. Б.3. Процедура на оцветяване Процедурата на оцветяване HER2 IQFISH в апарата Dako Omnis (обобщени в таблица 11) може да се следи от работната станция Dako Link Omnis: P04125BG_03/GM333 стр. 37/56

38 Рак на стомаха Таблица 11. Опростен преглед на стъпките от протокола за оцветяване HER2 IQFISH. Стъпка Реагент Време и температура Отстраняване на парафин Clearify (средство за почистване) 10 минути, 38 C Откриване на ISH Pre-Treatment Solution 15 минути, 97 C епитоп (Dako Omnis) Промивка ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 2 x 3 минути, 32 C Разреждане* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 минути, 15 минути или 20 минути Изсушаване 15 минути, 45 C Денатурация 10 минути, 66 C Хибридизация HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 минути, 45 C Цялостно ISH Stringent Wash Buffer промиване (Dako Omnis) 10 минути, 61 C * Може да се избира измежду три утвърдени времена на разграждане на пепсина чрез използването на посочените по-горе HER2 IQFISH протоколи. Ако не предстоят допълнителни ISH оцветявания, приведете реагентите до препоръчителните температури за съхранение. Б.4. Процедура след оцветяването Отстранете слайдовете и приложете до 30 µl Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), съдържаща DAPI, в целевата област на слайда. Тъканният срез трябва да бъде напълно покрит от Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis). Приложете покривно стъкло. ЗАБЕЛЕЖКА: Слайдовете може да се интерпретират след 15 минути или в рамките на 7 дни след заливка. Така или иначе избледняването настъпва, ако слайдовете се изложат на светлина или висока температура. За да се намали до минимум избледняването, съхранявайте слайдовете на тъмно при температура C. Контрол на качеството - Стомах 1. Сигналите трябва да бъдат ярки, отчетливи и лесни за оценяване. 2. Нормалните клетки позволяват вътрешен контрол на процедурата на оцветяване. Нормалните клетки трябва да имат 1-2 ясно видими зелени сигнала, които указват, че CEN-17 PNA сондата успешно е хибридизирала до центромерната област на хромозома 17. Нормалните клетки трябва също така да имат 1-2 ясно видими червени сигнала, които указват, че HER2 ДНК сондата успешно е хибридизирала до гена(ите) HER2. Поради формирането на тъканни срези някои нормални клетки ще имат по-малко от очакваните два сигнала от всеки цвят. Невъзможността да се откриват сигнали в нормалните клетки показва неуспешен анализ и резултатите трябва да се считат за невалидни. 3. Морфологията на ядрата трябва да бъде интактна, когато се извършва оценка с помощта на DAPI филтър. Многобройните призрачни клетки и общата зле изразена морфология на ядрата показва висока степен на разграждане на препарата, което е причина за загуба или прекъснатост на сигнала. Такива препарати трябва да се считат за невалидни. 4. На оценяване трябва да се подложат поне 20 туморни клетки. 5. Разликите във фиксирането, обработването и включването на тъканите в лабораторията на потребителя могат да доведат до променливи резултати, изискващи редовна оценка на вътрешните контроли. P04125BG_03/GM333 стр. 38/56

39 Интерпретация на оцветяването - Стомах Рак на стомаха Оценявана тъкан Локализирайте тумора на оцветен с хематоксилин и еозин слайд и оценете същата област върху FISH-оцветен слайд (в DAPI филтъра). Трябва да се анализират само проби от пациенти с аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение. В случаи на чревна метаплазия и аденокарцином в същата проба трябва да се оценява само компонента на карцином. Избягвайте области със силно възпаление, некроза и области, в които границите на ядрото са неясни. Не включвайте ядра, които изискват субективна оценка. Не включвайте ядра със слаба интензивност на сигнала и неспецифичен или силен фон. Започнете съответно с микроскопска оценка на целия FISH-оцветен срез и обозначената област върху оцветения с хематоксилин и еозин срез. Преди преброяването на FISH оцветения срез, имайте предвид общото разпространение на сигнала (хомогенно или хетерогенно) на площта за преброяване на сигнала. В случай на хетерогенно разпространение имайте предвид дали фокусна амплификация или едноклетъчна амплификация (мозайка) е налична. 1) Хомогенно разпространение на сигнала В случай че разпространението на сигнала е хомогенно, установете броя на хромозомните центромери (зелени сигнали) и съответно броя на HER2 гените (червени сигнали) от 20 клетки в 1-2 представителни туморни области. 2) Хетерогенно разпространение на сигнала В случай че разпространението на сигнала е хетерогенно, пребройте общо 20 клетки от избраните области, както е посочено по-долу: A) Ако съществува фокусна амплификация, то следва да се избират зони с амплифицирани клетки. Б) Ако разпределението е мозаечно или има амплифицирани, полизомни и дизомни клетки, бройте в областите с амплифицирани клетки. В тези области трябва да се преброят не само амплифицираните клетки, но и намиращите се в съседство неамплифицирани клетки, или общо 20 клетки. Ако е възможно не избирайте припокриващи се области. Отхвърлете оцветеното или бактериално ДНК Определен брой специализирани клетки (мастоцити и макрофаги), които са разпръснати в стомашната тъкан, демонстрират високо ниво на оцветяване на HER2 сондата поради наличие на бактериално ДНК. Това води до клетки, които флуоресцират в ярко червен цвят и се различават значително от туморните клетки с амплификация на гена HER2. Преброяване на сигналите Когато дадена област бъде избрана за оценка на сигнала, започнете анализа в едно от 20 те намиращи се в съседство ядра и след това започнете преброяването клетка по клетка, като не отчитате ядрата, които не отговарят на критериите за качество. Локализирайте тумора на оцветен с хематоксилин и еозин (H&E) слайд и оценете същата област върху оцветен с FISH слайд. Сканирайте целия оцветен слайд, за да отчетете евентуалното наличие на хетерогенност. Изберете област с добро ядрено разпределение. Започнете анализа в горния ляв квадрант на избраната област и, сканирайки от ляво надясно, пребройте сигналите в рамките на границата на ядрото на всяко оценено ядро според указанията по-долу (вижте също приложение 5). Фокусирайте горе и долу, за да откриете всички сигнали в индивидуалните ядра Пребройте два сигнала с един и същи размер и разделени с разстояние, равняващо се или по-малко от диаметъра на сигнала, като само един сигнал. Разстоянието трябва да е поне равно на диаметъра на един сигнал със стандартен размер, за да бъдат отчетени два отделни сигнала. Когато разстоянието между два сигнала е по-малко от диаметъра на сигнал, тогава той се отчита като един сигнал. P04125BG_03/GM333 стр. 39/56

40 Рак на стомаха При ядра с високи нива на амплификация на гена HER2 сигналите на HER2 може да са разположени много близо един до друг, образувайки сноп от сигнали. В тези случаи броят на сигналите на HER2 не може да се определи, а трябва да бъде приблизително изчислен. Специално внимание трябва да се обърне на зелените сигнали, тъй като сноповете от червени HER2 сигнали могат да покрият зелените сигнали и да ги направят невъзможни за виждане. Ако имате съмнения, моля, проверете зелените сигнали със специфичен FITC филтър. Не оценявайте ядра без сигнали или само с едноцветни сигнали. Оценявайте само ядра с един или повече FISH сигнали от всеки цвят. Указания за преброяване на сигналите 1 Не преброявайте. Ядрата се припокриват, не всички части на ядрата са видими 2 Два зелени сигнала, не оценявайте ядра само с едноцветни сигнали 3 Пребройте като 3 зелени и 12 червени сигнала (оценка на снопа) 4 Пребройте като 1 зелен и 1 червен сигнал. Два сигнала с един и същи размер и разделени с разстояние, равняващо се или по-малко от диаметъра на един сигнал, се броят като един 5 Не бройте (свръх- или недостатъчно разградени ядра). или Липсващи сигнали в центъра на ядрото (пръстеновидни ядра). 6 Пребройте като 2 зелени и 3 червени сигнала. Два сигнала с един и същи размер и разделени с разстояние, равняващо се или по-малко от диаметъра на един сигнал, се броят като един 7 Пребройте като 1 зелен и 5 червени сигнала 8 Пребройте като 3 зелени (1 зелен извън фокус) и 3 червени сигнала 9 Сноп от червени сигнали, прикриващ зелени сигнали. Проверете зелените сигнали със специфичен FITC филтър или не бройте изобщо Запишете бройките в таблица, както е показано в приложения 3 и 4. Бройте по 20 ядра от всеки хистологичен препарат, по възможност от различни туморни области. Изчислете съотношението HER2/CEN-17, като разделите общия брой червени HER2 сигнали на общия брой зелени CEN-17 сигнали. Препарати със съотношение HER2/CEN-17, което е над или равно на 2, трябва да се отчитат като HER2 ген амплифицирани (29). Резултатите при или близо до минималното допустимо ниво (1,8-2,2) трябва да се интерпретират внимателно. P04125BG_03/GM333 стр. 40/56

41 Рак на стомаха Ако съотношението е близо до пределната стойност (1,8-2,2), пребройте 40 различни ядра и изчислете съотношението за 40-те ядра. Ако броят продължава да е близо до пределната стойност, то е валиден резултатът от втората оценка. Ако е налично, трябва да се включи и имунохистохимичното оцветяване на HER2 за по-добра ориентация по време на второто преброяване. Ако имате съмнения, препаратът трябва да се оцени отново. При случаи, които са на границата, се гарантира консултация между патолога и лекуващия лекар. Ограничения - Стомах 1. Само за автоматизирана употреба в апарати Dako Omnis. 2. Необходимо е специализирано обучение за приготвянето на тъкан и слайдове и за IQFISH интерпретация на оцветяването. Интерпретацията на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) оцветявания не трябва да се извършва от лица, страдащи от нарушено цветоусещане. 3. Резултатите от FISH зависят от третирането и обработването на тъканта преди оцветяване. Неправилното фиксиране, измиване, изсушаване, затопляне, оформяне на срези или замърсяване с други тъкани или флуиди може да окаже влияние върху хибридизацията на сондата. Противоречивите резултати може да се дължат на разлики в методите за фиксиране и включване или на вродени несиметричности в тъканта. 4. Отговорност на потребителя е да валидира Template IQFISH protocol Работни характеристики - Стомах Ефикасност на хибридизацията Ефикасността на хибридизацията на HER2 IQFISH pharmdx е изследвана чрез 180 фиксирани във формалин и включени в парафин тъканни срези, тествани в три изследователски лечебни заведения. Всички 180 тъканни срези могат да бъдат преброени в съответствие с ръководствата за преброяване на продукта. Ефикасността на хибридизацията е 100%. Съотношението HER2/CEN-17, изчислено и използвано в изследванията на работните характеристики, се основава на преброяването на сигнали в 20 ядра чрез дадените насоки за оценяването в раздел Интерпретация на оцветяването на тази инструкция за употреба. Аналитична чувствителност Аналитичната чувствителност на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е изследвана чрез 20 различни препарата от аденокарцином на стомаха (10 проби с амплифициран статус на гена HER2 и 10 неамплифицирани проби). Съотношението между броя HER2 сигнали и CEN-17 сигнали е изчислено въз основа на преброяването на сигналите в 20 ядра от нормални клетки в рамките на тъканната проба. Съотношението HER2/CEN-17 за 20-те хистологични препарата от аденокарцином на стомаха е между 0,94 и 1,19. Аналитична специфичност HER2 ДНК сондите в HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) са подредени в крайна последователност и картирани за потвърждаване на общо покритие от 218 kb, включително гена HER2. CEN-17 PNA сондите в HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) са тествани поотделно и заедно, за да се потвърди тяхната специфична хибридизация до центромерната област на хромозома 17. За изключване на кръстосана хибридизация до хромозоми, различни от хромозома 17, са проведени проучвания на метафазните пластинки според стандартните процедури за контрол на качеството на Dako. Оценени са общо 275 метафазни пластинки с отчетливи P04125BG_03/GM333 стр. 41/56

42 Рак на стомаха сигнали за специфична хибридизация на HER2 ДНК и CEN 17 PNA комплекти сонди. Във всички 275 случая хибридизацията е специфична за хромозома 17. При никой от 275-те случая не се забелязва кръстосана хибридизация до локусите на други хромозоми. Тогава специфичността на сондата е 100% (275 от 275). За измерване способността на IQFISH анализа единствено да идентифицира целевите вещества HER2 и CEN-17 без вмешателство от страна на други вещества, изследванията са извършени на препарати на аденокарцином на стомаха, като са пропуснати HER2 и CEN-17 сондите от хибридизационни смеси, и е употребен само хибридизационен буферен разтвор. Общо 20 препарата са оценени за наличието на сигнали, които не са свързани с комплекта сонди. Няма засичане на други хромозомни цели или да е наблюдавана намеса в тясно свързани субстанции в някой от 20-те препарата. Изследвания на надеждността Надеждността на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) анализа е тествана при различна концентрация на PNA сонди, време за откриване на епитоп, период на инкубация на пепсина, време на денатурация, време на хибридизация, както и време за цялостно промиване и температура. Различните параметри са тествани на три различни FFPE хистологични препарати на аденокарцином на стомаха и две FFPE тъканни проби от хранопроводно-стомашното съединение (GEJ) (във всяка група са представени както амплифицирани, така и неамплифицирани хистологични препарати). Всички параметри са тествани под и над стандартните настройки на протокола с изключение на концентрацията на PNA сонда и температурата на цялостно промиване, за които стандартната настройка на протокола е включена в настройките. Тестовите параметри са: Концентрация на PNA сонда: Тествана при 100% и +/-17%. Време за откриване на епитоп: Тествано при 13 мин 45 сек и 16 мин 15 сек. Период на инкубация на пепсина: Тестван при 14 мин 45 сек и 16 мин 15 сек. Време на денатурация: Тествано при 9 мин 45 сек и 10 мин 45 сек. Време на хибридизация: Тествано при 70 мин и 80 мин. Време за цялостно промиване: Тествано при 8 мин 45 сек и 11 мин 15 сек. Температура на цялостно промиване: Тествана при 59 C, 61 C и 63 C. Трите концентрации на PNA сонди са оценени в разделена на малки части структура на експеримента (JMP инструмент, SAS), които са извършени с 12 различни протоколи за оцветяване, както е показано на таблица 12. P04125BG_03/GM333 стр. 42/56

43 Рак на стомаха Таблица 12. Дванадесет различни протокола за оцветяване, използвани в изследването на надеждността. Тестови параметър Протокол за надеждност Време за откриване на епитоп (мин) Период на пепсина (мин) Време на денатурация (мин) Време на хибридизация (мин) Време за цялостно промиване (мин) Температура на цялостно промиване ( 0 C) PNA конц. В комплект сонди 1 16,25 16,25 9, , % 2 13,75 14,75 10, , % 3 16,25 14,75 9, , % 4 13,75 14,75 10, , % 5 13,75 14,75 9, , % 6 13,75 16,25 10, , % 7 13,75 16,25 10, , % 8 16,25 14,75 9, , % 9 13,75 16,25 9, , % 10 16,25 16,25 10, , % 11 16,25 16,25 10, , % 12 16,25 14,75 10, , % Всички пет хистологични препарати са оцветени, като се използват всички 12 протокола. Резултатът от изследването на надеждността е интензивност на сигнала и качество на морфологията. Всички протоколи са излъчили оцветяване във всички хистологични препарати (общо 60) с ярки, отличителни и лесни за оценка сигнали и по този начин подходящи за преброяване на сигналите. Освен това ефектът от дебелината на тъканния срез върху резултатите от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) анализа е тестван при различна дебелина на среза на FFPE хистологични препарати на рак на стомаха. Общо пет последователни срези от препарати на аденокарцином на стомаха с различна дебелина (3, 4, 5, 6 и 7 µm) са тествани с HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Средният коефициент на дисперсията на съотношението HER2/CEN-17 е 3,9% (вариращ от 3,2% до 5,0%). Възпроизводимост Възпроизводимостта за всеки ден и всяка партида в рамките на лабораторията е тествана чрез HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Изследването е проектирано като вътрешно, заслепено, рандомизирано изследване на съотношенията HER2/CEN-17 чрез срези от осем различни фиксирани във формалин, включени в парафин препарати от рак на стомаха, включително хранопроводно-стомашното съединение (GEJ), с различни нива на амплификация на гена HER2. Осемте препарата са тествани с HercepTest и представят два препарата с HER2 IHC 0/1+, два с HER2 IHC 2+, два с HER2 IHC 3+ и два препарата с предварително определено HER2/CEN-17 FISH съотношение между 1,5 и 2,5, получено чрез HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731). Всеки препарат е оцветен с три различни партиди от HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) в пет непоследователни дни. Общо 240 тъканни оцветявания са обработени за цялото изследване, като всяка комбинация е оцветена в две идентични копия. Измененията в съотношението между дните и партидите са показани на фигура 8. Данните са анализирани, използвайки Box-Cox трансформация чрез Модела на случайния ефект за получаване на еднородност на дисперсията на данните. Общият коефициент на изменението е установен да бъде 6,5% и е открито, че изменението за ден и партида допринася съответно с 0,7% и 0,8%. P04125BG_03/GM333 стр. 43/56

44 Рак на стомаха Фигура 8. HER2/CEN-17 съотношения, получени в лабораторни условия в изследване на възпроизводимостта на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), включващи целеви резултати за възпроизводимостта за всеки ден и всяка партида. Средната стойност за всеки хистологичен препарат е показана с хоризонтална линия. В допълнение ежедневната и междуцентровата възпроизводимост на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) беше тествана във външно стратифицирано и заслепено проучвание в три центъра (един в САЩ и два в Европа) на тъканни срези от 12 различни фиксирани във формалин, включени в парафин препарати от аденокарцином на стомаха, включително от хранопроводно-стомашното съединение (GEJ). Три от препаратите бяха HER2 IHC 0/1+, три бяха HER2 IHC 2+, три бяха HER2 IHC 3+ и три препарата имаха предварително определено съотношение HER2/CEN-17 FISH между 1,5 и 2,5, получено съответно чрез HercepTest и HER2 IQFISH pharmdx (код K5731). Препаратите са оцветени и анализирани в изследователски лечебни заведения. Всеки препарат е оцветен минимум седем пъти за минимум седем непоследователни дни и оценен от един наблюдател за всяко заведение. 314 срези са оцветени и включени в статистическия анализ. Данните са анализирани чрез Box-Cox трансформация и са изчислени компоненти на дисперсията. Общият коефициент на дисперсията, базиращ се на 95% граница на достоверност, е 24%. Изменението на съотношението HER2/CEN-17 за ден и център е представено на фигура 9. Фигура 9. Диаграма на изменението на съотношенията HER2/CEN-17 в нетрансформирани единици, получени от изследването за всеки ден и всяко лечебно заведение на възпроизводимостта на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) на хистологични препарати на рак на стомаха. Анализът HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е тестван за възпроизводимост на всеки наблюдател като част от вътрешно ръководено изследване на сравнение на методите чрез използването на трима наблюдатели за получаване на независима оценка на оцветените P04125BG_03/GM333 стр. 44/56

45 Рак на стомаха препарати. Възпроизводимостта е тествана на 139 различни препарата на аденокарцином на стомаха с неамплифициран и амплифициран статус на гена HER2. Данните са анализирани чрез Box-Cox трансформация. Средният коефициент на изменението за всеки наблюдател е 18%. Препаратите от аденокарцином на стомаха съдържат 96,4% препарат от резекция и 5,6% препарат от биопсия. 81,3% от препаратите са получени от стомах и 18,7% от хранопроводно-стомашното съединение. Повторяемост Повторяемостта в лабораторни условия на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) е тествана чрез последователни срези от осем препарати на аденокарцином на стомаха с неамплифициран и амплифициран статус на гена HER2. Тъканите са тествани в две идентични копия в пет непоследователни дни с три различни партиди в общо 240 слайда (120 срези по две идентични копия). Моделът на случайния ефект е използван за анализ на данни и влияе на дисперсията на свойствата за дни и партиди (вижте вътрешното изследване на възпроизводимостта по-горе). Остатъчната дисперсия отговаря на дисперсията между копията и оттам на повторяемостта. Горната граница на достоверността 95% за всеки повтарящ се коефициент на изменението е 7,1%. Изследване за сравнение на методите Сравнение на HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) с HER2 IQFISH pharmdx (K5731) Изследването включва 140 препарата на рак на стомаха, съдържащи различни типове тъкани от аденокарцином на стомаха, т.е. стомах или хранопроводно-стомашно съединение (GEJ), и резекции или биопсии с хомогенна или хетерогенна (фокусна или мозаечна) дистрибуция на сигнала, както е показано на таблица 13. Таблица 13. Разпространение на препаратите в тип рак на стомаха (стомах или GEJ), категория на разпространение на сигнала (хомогенно или хетерогенно) и тип тъкан (резекция или биопсия). Тип рак на стомаха Брой препарати Разпростран ение на сигнала Брой препарати Тип тъкан Брой препарати Стомах 113 Хомогенно 58 Резекция 134 Хранопро- Водно стомашно съединение (GEJ) 27 Хетерогенно - фокусно Хетерогенно - мозаечно Биопсия 6 Общо 140 Общо 140 Общо 140 Препаратите съдържат 76 случая на неамплифициран HER2 и 64 случая на амплифициран HER2 с известна оценка от HercepTest, както е показано в Таблица 14. Таблица 14. Разпространение на препаратите, основано на оценката от HercepTest и HER2 FISH, получено с HER2 FISH pharmdx Kit (K5731). HercepTest оценка на Общо оцветяване n HER2 FISH статус Амплифициран Неамплифициран Общо FISH тествани проби Резултатите от кръстосаната табулация на статуса на HER2, получени чрез двата анализа, с изчисляване на процент на цялостно съответствие (OPA), процент на положително съответствие (PPA) и процент на отрицателно съответствие (NPA), са показани на P04125BG_03/GM333 стр. 45/56

46 Рак на стомаха Таблица 15. Корелацията между съотношенията HER2/CEN-17 чрез двата анализа е показана на фигура 10. Таблица 15. Кръстосана табулация на статуса на гена HER2, получена чрез HER2 IQFISH pharmdx (K5731) и HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). HER2 генен статус (K5731) Неамплифициран Амплифициран Общо HER2 генен Неамплифициран статус (Dako Амплифициран Omnis) Общо OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% Фигура 10. Корелация между съотношенията HER2/CEN-17 от HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) и HER2 IQFISH pharmdx (Код K5731) на 140 препарата на рак на стомаха (линейно съвпадение: y = 0,06 + 0,97*x; R 2 = 0,97. Претеглена с инверсна дисперсия, за да позволи линейно съвпадение). Интервалът на достоверност от 95% за средната разлика между двата метода за оцветяване при съотношение HER2/CEN-17 = 2 е установена да бъде [0,007; 0,022]. Това означава, че не се очаква разлика по-голяма от 2%. Клинични данни Клиничната безопасност и ефикасност на трастузумаб (Herceptin ) е демонстрирана в изследването BO18255 (ToGA изпитването Отворено, рандомизирано, мултицентрово изследване от фаза III на трастузумаб в комбинация с цисплатин и флуоропиримидин (капецитабин или 5-флуороурацил) (FC+H) в сравнение с единствено химиотерапия (FC) като терапия от първа линия при пациенти с HER2 позитивен рак на стомаха в напреднал стадий ) (28). Изследването е планирано като открито, рандомизирано, многоцентрово изследване от фаза III при HER2 позитивни пациенти с аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение в напреднал стадий. В BO18255 изследването HER2 позитивността е определена или като IHC позитивна (3+) при използван P04125BG_03/GM333 стр. 46/56

47 Рак на стомаха HercepTest (Dako) и/или FISH позитивна (HER2/CEN-17 2,0) при използван HER2 FISH pharmdx Kit (Dako). След включване в изследването пациентите са рандомизирани за получаване на химиотерапия (5-FU или капецитабин и цисплатин) или химиотерапия плюс трастузумаб. Изходното измерване с главна ефикасност е общата преживяемост (OS), анализирана посредством стратифициран логаритмичен рангов тест. Финалният OS анализ, основан на 351 смъртни случая, е статистически значим (номинално ниво на значимост 0,0193). Една година след финалния анализ е проведен актуализиран OS анализ. Средната обща преживяемост от 13,5 месеца на Herceptin плюс химиотерапевтично рамо е значително по-дълга в сравнение с 11,0 месеца средна обща преживяемост на единствено химиотерапевтично рамо. Резултатите относно ефикасността и на двата финален и актуализиран анализи, са обобщени в таблица 16 и фигура 11. Таблица 16. Обща преживяемост в популация с намерение за лечение (ITT). Финална обща преживяемост Смъртни случаи (%) Медиана 95% CI (мес.) Относителен риск 95% CI p-стойност*, двустранно Актуализирана обща преживяемост Смъртни случаи (%) Медиана 95% CI (мес.) Относителен риск 95% CI FC рамо N= (62,2%) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3, 13,0) *В сравнение с номиналното ниво на значимост 0,0193 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) FC + Н рамо N= (56,0%) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9, 15,1) Фигура 11. Актуализирана обща преживяемост при пациенти с метастатичен рак на стомаха P04125BG_03/GM333 стр. 47/56

48 Рак на стомаха Проучвателен анализ на OS, основаващ се на тестване на амплификацията на гена (FISH) и свръхекспресията на протеина (IHC), е обобщен в таблица 17. Таблица 17. Проучвателни анализи посредством HER2 статус с резултати от актуализираната обща преживяемост. FISH+ / IHC 0, 1+ подгрупа (N=133) Смъртни случаи / n (%) Средна OS продължителност (мес.) 95% CI (мес.) FC N=296 а 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4, 11,7) FC+H N=298 б 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2, 10,7) Относителен риск (95% CI) 1,33+ (092, 1,92) FISH+ / IHC2+ подгрупа (N=160) Смъртни случаи / n (%) 65/80 (81%) 64/80 (80%) Средна OS продължителност (мес.) 95% CI (мес.) 10,8 (6,8, 12,8) 12,3 (9,5, 15,7) Относителен риск (95% CI) 0,78+ (0,55, 1,10) FISH+ или FISH-/IHC3+ в подгрупа (N=294) Смъртни случаи / n (%) 104/143 (73%) Средна OS продължителност (мес.) 13,2 95% CI (мес.) (11,5 15,2) Относителен риск (95% CI) 0,66+ (0,5, 0,87) 96/151 (64%) 18,0 (15,5, 21,2) Средната преживяемост е установена от кривите Kaplan-Meier. а Двама пациенти на FC рамо, които са FISH+, но с неизвестен IHC статус, са изключени от анализите. б Двама пациенти на Herceptin рамо, които са FISH+, но с неизвестен IHC статус, са изключени от анализите. в Включва 6 пациенти на химиотерапевтично рамо, 10 пациенти на Herceptin рамо с FISH-, IHC3+ и 8 пациенти на химиотерапевтично рамо, 8 пациенти на Herceptin рамо с неизвестен FISH статус, IHC3+. P04125BG_03/GM333 стр. 48/56

49 Рак на стомаха Откриване и отстраняване на проблеми - Стомах Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 1. Няма сигнали или слаби сигнали 1a. Реагентите са били изложени на високи температури при транспортиране или съхранение 1a. Проверете условията на съхранение. Уверете се, че е имало сух лед при получаването на доставките с IQISH комплект сонди и пепсин. Уверете се, че реагентите са съхранявани съгласно указанията. 1б. Микроскопът не функционира правилно Неподходящ комплект филтри Неправилна лампа Твърде стара живачна лампа Замърсени и/или напукани колекторни лещи Неподходящо имерсионно масло 1б. Проверете микроскопа и се уверете, че използваните филтри са подходящи за употреба с комплекта сонди с флуорохром и че е избрана правилната живачна лампа в пределите на очаквания ѝ експлоатационен живот (вижте приложение 5). Ако имате съмнения, моля, свържете се с местния доставчик на микроскопа. 1в. Слаби сигнали 1в. Избягвайте продължителния микроскопски преглед и сведете до минимум излагането на източници на силна светлина. 1г. Неправилно идентифицирани буфери 1г. Заменете наливните буфери и се уверете, че правилно сте ги регистрирали (в работната станция) и идентифицирали (на сензорния екран). За повече информация се консултирайте с Основното ръководство за потребителя на Dako Omnis. Моля, имайте предвид: ISH Pre- Treatment Solution е зелен, а ISH Stringent Wash Buffer е жълт. P04125BG_03/GM333 стр. 49/56

50 Рак на стомаха Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 2. Области без сигнал 2. Уловени са въздушни мехурчета по време на заливката 2. Не допускайте въздушни мехурчета. Ако забележите такива, внимателно ги отстранете с помощта на форцепс. 3. Прекомерно фоново оцветяване 4. Зле изразена морфология на тъканта 5. Високо ниво на зелена автофлуоресценция на слайда, включително в области без FFPE тъкан 3a. Неправилна фиксация на тъканта 3б. Продължително излагане на хибридизиран срез на силна светлина 4a. Неправилна обработка с пепсин 4б. Ако обработката с пепсин е прекалено продължителна или дебелината на срезите е много малка, това може да доведе до появата на призрачни клетки или пръстеновидни клетки. 5. Употреба на предметни стъкла с изтекъл срок на годност или непрепоръчани такива. 3a. Уверете се, че се използват само фиксирани във формалин, включени в парафин тъканни срези. 3б. Избягвайте продължителния микроскопски преглед и сведете до минимум излагането на силна светлина. 4a. Смяна с друг от трите различни протокола за оцветяване. Уверете се, че ISH Pepsin се съхранява при правилната температура. 4б. Опитайте протокол за оцветяване със скъсен период на инкубация на пепсина. Уверете се, че дебелината на среза е 3-6 µm. 5. Изберете предметни стъкла, както е указано. Уверете се, че предметните стъкла не са с изтекъл срок на годност. ЗАБЕЛЕЖКА: Ако проблемът не може да бъде отнесен към някоя от горепосочените причини или ако предложението за корективни действия не реши проблема, моля, свържете се с отдел Техническо обслужване на Dako за допълнително съдействие. P04125BG_03/GM333 стр. 50/56

51 Рак на стомаха Приложение 3 - Стомах HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), код GM333 Схема на оценяване Дата на процедурата: Партида HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Идентификационен номер на дневника на процедурата на оцветяване: Идентификационен номер на препарата: Характеризиране на разпространението на сигнала в тъканта: Хомогенно: Хетерогенно фокусно: Ядро или Хетерогенно мозаечно: Пребройте сигнали в 20 ядра HER2 CEN-17 оценка оценка Ядро (червен) (зелен) Общо (1-10) Общо (11-20) HER2 оценка (червен) CEN-17 оценка (зелен) За определяне на съотношението HER2/CEN-17, пребройте количеството HER2 сигнали и количеството на CEN-17 сигнали в същите 20 ядра и разделете общия брой HER2 сигнали на общия брой CEN-17 сигнали. Ако съотношението HER2/CEN-17 е близо до пределната стойност (1,8-2,2), пребройте 40 различни ядра и преизчислете съотношението за 40-те ядра (вижте схемата за повторно оценъчно преброяване, приложение 4). Съотношението при или близо до минималното допустимо ниво (1,8-2,2) трябва да се интерпретира внимателно (вижте указанията за преброяване). Обща оценка (1-20) HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 Съотношение < 2: Не е наблюдавана амплификация наher2 гена Съотношение 2: Наблюдавана е амплификация на HER2 гена Дата и подпис, техник: Дата и подпис, патолог: За указания за оценяване: вижте Интерпретация на оцветяването. P04125BG_03/GM333 стр. 51/56

52 Приложение 4 - Стомах Рак на стомаха HER2 IQFISH pharmdx, код GM333 Схема на повторно оценъчно преброяване Дата на процедурата: Партида HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): Идентификационен номер на дневника на процедурата на оцветяване: Идентификационен номер на препарата: Ядро HER2 (червен) CEN17 (зелен) Ядро Сигнали в допълнителни 40 ядра (1-40) HER2 (червен) CEN-17 (зелен) Ядро HER2 (червен) CEN-17 (зелен) Ядро HER2 (червен) CEN-17 (зелен) Общо (1-10) Общо (11-20) Общо (21-30) Общо (31-40) За определяне на съотношението HER2/CEN-17, пребройте количеството HER2 сигнали и количеството на CEN-17 сигнали в същите 40 ядра и разделете общия брой HER2 сигнали на общия брой CEN-17 сигнали. Докладвайте общата оценка от 1-40 ядра в таблицата по-долу. Обща оценка (1-40) HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 Съотношение < 2: Не е наблюдавана амплификация наher2 гена Съотношение 2: Наблюдавана е амплификация на HER2 гена Дата и подпис, техник: Дата и подпис, патолог: За указания за оценяване: вижте Интерпретация на оцветяването. P04125BG_03/GM333 стр. 52/56

53 Рак на стомаха Приложение 5 - Стомах HER2 IQFISH pharmdx, код GM333 Спецификации на флуоресцентен микроскоп Dako препоръчва да се използва следното оборудване с HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333: 1. Тип микроскоп Епифлуоресцентен микроскоп 2. Лампа Живачна лампа, 100 W (поддържайте запис на време на работа) 3. Цели За скрининг на тъканта са приложими цели за 16X или 20X увеличение с помощта на имерсионно масло За силно увеличение и преброяване на сигналите са препоръчителни само цели като например 100х увеличение с помощта на имерсионно масло 4. Филтри Филтрите се проектират индивидуално за всеки специфичен флуорохром и трябва да се избират по съответния начин. Dako препоръчва използването на специфичен DAPI филтър в комбинация с висококачествен Texas Red/FITC двоен филтър. DAPI филтър Texas Red/FITC двоен филтър Texas Red и FITC единични филтри могат да се използват за потвърждение и преброяване Флуорохром Дължина на вълната на възбуждане Дължина на вълната на излъчване FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm За всеки тип микроскоп има специфичен филтър и използването на подходящите филтри е от ключово значение за интерпретацията. Ако ви е необходима подробна информация, моля, свържете се със своя доставчик на микроскоп или представител на Dako. 5. Масло Нефлуоресциращо масло Предпазни мерки Не се препоръчва живачна лампа, 50 W Не могат да се използват родаминови филтри Не се препоръчват тройни филтри Неоптимизираният микроскоп може да доведе до проблеми с интерпретацията на флуоресцентните сигнали. Важно е експлоатационният живот на източника на светлината да не е изтекъл и тя да е правилно подравнена и фокусирана. Клиентите трябва да следят и следват препоръките на производителя на живачната лампа. Микроскопът трябва да е преминал поддръжка, а живачната лампа трябва да е изравнена, преди да се интерпретират резултатите. Трябва да се положат усилия пробата да бъде изложена на възможно най-малка светлина на възбуждане, за да се сведе до минимум отслабването на флуоресценцията. Препоръчваме ви да обсъдите установката на вашия конкретен микроскоп с производителя, преди да пристъпите към флуоресцентна in situ хибридизация или да направите справка с литературата по въпроса. P04125BG_03/GM333 стр. 53/56

54 Източници 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230: Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50: Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press P04125BG_03/GM333 стр. 54/56

55 18. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92: Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53: Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2: Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3): Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52: P04125BG_03/GM333 стр. 55/56

56 Обяснение на символите Каталожен номер Температурни ограничения Годност до Медицински апарат за ин витро диагностика Да се пази от слънчева светлина (консултирайте се с раздела за съхранение) Производител Консултирайте се с указанията за употреба Партиден код Пиктограма GHS (вижте раздела с предпазни мерки) Редакция Произведено от: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup, Дания Тел.: Факс: Дистрибутор в САЩ: Dako North America Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Тел.: 805/ , Безплатен телефон: 800/ Информация за заявките: Тел. 800/ Факс 805/ отдел Техническо обслужване : тел. 800/ P04125BG_03/GM333 стр. 56/56