ЕКСПРЕСИЯТА НА МИКРОРИБОНУКЛЕИНОВАТА КИСЕЛИНА-199 НОВ ПОТЕНЦИАЛЕН БИОМАРКЕР ЗА ИМУНОМЕДИИРАНО ВЪЗПАЛЕНИЕ

Препис

1 Варненски медицински форум, т. 10, 2021, Online First МУ-Варна ЕКСПРЕСИЯТА НА МИКРОРИБОНУКЛЕИНОВАТА КИСЕЛИНА-199 НОВ ПОТЕНЦИАЛЕН БИОМАРКЕР ЗА ИМУНОМЕДИИРАНО ВЪЗПАЛЕНИЕ Антония Атанасова Катедра Анатомия и клетъчна биология, Факултет по медицина, Медицински университет Варна THE EXPRESSION OF MICRORNA A NEW POTENTIAL BIOMARKER FOR IMMUNOMEDIATED INFLAMMATION Antonia Atanassova Department of Anatomy and Cell Biology, Faculty of Medicine, Medical University of Varna РЕЗЮМЕ Етиологията и патогенезата на хроничните възпалителни заболявания на червата (ХВБЧ) остават неясни, но взаимодействието между генетични и имунологични фактори на околната среда е широко прието. Последните проучвания изследват експресията на микро- РНКите в периферна кръв и тъкани при пациенти с ХВБЧ. Нашето проучване има за цел да оцени и съпостави серумната експресия на mir-199 при пациенти с ХВБЧ с клинични параметри като обхват, активност и тежест на заболяването. В проучването са включени 35 пациенти с язвен колит (ЯК) и 35 пациенти с болест на Крон (БК). Експресията на mir-199 в серума и при двете заболявания се оценява, като се използва количествена PCR в реално време с обратна транскриптаза (RT-qPCR). Нивата на циркулиращата mir-199 корелират обхвата на заболяването, активността и тежестта (CDAI, Монреалска класификация, ендоскопски Майо скор). Серумната експресия на mir-199 при 70 пациенти е сравнена със серумни нива на mir-199 при 30 здрави контроли. Групите на пациентите показаха средна експресия на mir-199 в серума от 2,39 за БК, 1,08 за ЯК и 1,26 за контролната група със значителна разлика в експресията между групите. От настоящото проучване можем да заключим, че съществува значителна връзка между повишената серумна експресия на mir-199 и активността на заболяването (ЯК), обхвата (БК) и тежестта (БК и ЯК). ABSTRACT The etiology and pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD) remain undetermined but an interaction between environmental, genetic and immunological factors is most widely accepted. Recent studies examine the expression of mirnas in peripheral blood and tissues in IBD patients. Our study aims to assess and correlate the serum expression of mir-199 in IBD patients with clinical parameters such as extent, activity, and severity of the disease. A total of 35 patients with ulcerative colitis (UC) and 35 patients with Crohn s disease (CD) were included in the study. Serum mir-199 expression in both IBD diseases was assessed using reverse transcriptase quantitative real-time PCR (RT-qPCR). Circulating mir-199 levels were also correlated with disease extent, activity, and severity indices (CDAI, Montreal classification, Partial Mayo score). Serum expression of mir-199 in the 70 patients was also compared mir-199 serum levels in 30 healthy control subjects. The patients group showed mean serum mir-199 expression of 2.39 for CD, 1.08 for UC, and 1.26 for the control group with significant difference in the expression between groups. From the current study, we could conclude that there is a significant correlation between increased serum expression of mir-199 and disease activity (UC), extent (CD), and severity (CD and UC). Keywords: mir-199, ulcerative colitis, Crohn s disease, inflammatory bowel diseases

2 Експресията на микрорибонуклеиновата киселина-199 нов потенциален биомаркер за имуномедиирано възпаление Ключови думи: mir-199, язвен колит, болест на Крон, хронични възпалителни болести на червата ВЪВЕДЕНИЕ Широко признато е, че хроничните възпалителни болести на червата (ХВБЧ) са сложни заболявания с неясна eтиология и патогенеза. Болестта на Крон (БК) и язвеният колит (ЯК) са основните представители на семейството на ХВБЧ. Тези заболявания имат различна фенотипна изява: локализирано възпаление, стенозираща болест, фистулизиране и абсцедиране, обхващане на различни извънчревни органи и системи с възможност за развитие на колит-асоцииран карцином (КАК). Микрорибонуклеиновите киселини (микро-рнки) са малки некодиращи белтъци РНКи, с дължина около нуклеотида (3). Биогенезата им минава през няколко стъпки на посттранскрипционна модификация в ядрото и цитоплазмата. Микро-РНКите регулират процесите на възпаление, сигналните регулаторни пътища на диференциацията на имунните клетки, които участват в изграждането на вродения и придобит имунитет. Дисрегулацията на генната експресия на микро-рнките може да допринася за развитието на ХВБЧ (3). Ето защо напоследък има нарастващ брой проучвания за приложението на микро-рнкте при диагностика, мониториране и персонализиране на лечението при ХВБЧ (2,3,4,5,7). Намалената експресия на mir-199-5р в Т-клетките води до инхибиране на автофагията и увеличаване секрецията на проинфламаторните цитокини. Свръхекспресията на mir-199-5р стимулира експресия на гени, свързани с автофагията, и снижава нивата на TNF-a,Il-17и Il-23 (10). Wu et al. (2011) съобщават за повишена експресия на mir-199-3р в периферна кръв при пациенти с ЯК и повишена експресия на mir-199-5р при пациенти с БK (11). Сhao Li през 2016 описва, че микро-рнк 199а влиза в групата на профибротичните микро-рн- Ки (5). Най-много проучвания на нейната роля са извършени в областта на белодробната и чернодробна фиброза. Експозицията на transforming growth factor-β (TGF-β) стимулира експресията на микро-рнк-199 а-5р, която от своя страна може да стимулира активация на фибробласти с последваща пролиферация, миграция, инвазия и диференциацията им в миофибробласти (5) mir-199 потиска някои мезенхимните маркери, като таргетът й е N-кадхерин (9). През 2019 Boros et al. съобщават, че mir- 199 оказва негативно въздействие на някои транскрипционни фактори като snail family transcriptional repressor -1(SNAL1), тирозин киназни рецепторни сигнални пътища, като АХL receptor tyrosine kinase (AXL) и хипоксия, индуциращ фактор (hypoxia inducible factor-1, HIF1a). При отпадане на този тип инхибиция и повишаване на експресията на група микро-рнки, сред които и микро-рнк-199, се наблюдава загуба на апикално-базалния поляритет на клетката, разкъсване на връзките между епителните клетки и както и между епителните клетки и базалната ламина, преустройка на екстрацелуларния матрикс, повишена подвижност на клетките, т.е. извършва се епително-мезенхимен преход (ЕМП). Според една съвременна хипотеза тези промени водят до появата на фистулизиращата форма на БК, ЕМП се свързва и с развитието на т.нар. фенотип ракови стволови клетки (cancer stem cells) (2). През 2020 г. Rashid H et al. обобщават данните от различни проучвания и съобщават, че при пациентите с колоректален карцином (КРК) има повишена експресия на група микро-рнки, включително и микро-рнк-199-3р (8). Като се обобщят данните от литературата, се откроява възможността за приложението на тази микро-рнка при системно мониториране на имуномедиираното възпаление и ранна детекция на КАК. Цел на това изследване е да се оцени серумната експресия на mir-199 при пациенти с ХВБЧ и корелацията й с активността, тежестта, формата на протичане и постигането на ремисия. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИ Чрез обратна транскриптаза при количествена PCR в реално време (RT-qPCR) е оценена серумната експресия на mir-199 при 35 пациенти с ЯК, 35 пациенти с БК и 30 здрави контроли. Тежестта на заболяването е оценена посред-

3 Антония Атанасова ством CDAI (Crohn Disease Activity Index) (за БК), S (Монреалската класификация) и ендоскопски Mayo score (за ЯК). Като биомаркери за активност на заболяванията са измерени нивата на С-реактивен протеин (СРП) и фекален калпротектин (ФКП). Оценена е връзката между серумната експресия на mir-199 с СРП и ФКП. РЕЗУЛТАТИ На табл. 1 е представена характеристиката на пациентите с ХВБЧ според Монреалската класификация и серумната експресия на mir-199. Поради липса на валидирани референтни прагови нива на експресията на микро-рнките за разграничаване на пациенти с ХВБЧ от здрави индивиди бе определена праговата стойност (Сut-оff) на експресията на mir-199 при здрави контроли. Тя е специфична за дадената популация и служи като ориентир за оценка на експресията на микро-рнк 199 при пациенти с БК и ЯК. В нашето проучване праговата стойност на mir-199 е 0.96 (AUC = ( ); р=0.241) с чувствителност 60% и специфичност 60%. При сравняване на правите стойности и тези от екс- Показател БК Възраст, год. Пол Табл. 1. Характеристика на пациентите с ХВБЧ според Монреалската класификация и експресия на mir-199 Локализация * БК/ЯК Форма на протичане* Давност на ХВБЧ, мес. CDAI S (severity)* Mayo score Лечение mean±sd, range ЯК 41.51±13.55 (18-75) Пациенти БК 41.54±15.21 (18-73) Експресия на mir-199 ЯК r=0.365 p=0.031 r=0.226 p=0.192 Мъже 18/51.4% 15/42.9% 2.07± ±0.29 Жени 17/48.6% 20/57.1% 2.73± ±0.82 L1/Е1 19/54.3% 1/2.9% 3.49± L2/Е2 5/4.3% 11/31.4% 0.92± ±0.90 L3/Е3 11/31.4% 23/65.7% 1.17± ±0.53 В1 17/48.6% ± В2 11/31.4% ± В3 6/17.1% ± В2-В3 1/ 2.9% Хронично рецидивираща - 28/80.0% ±0.52 Хронично персистираща - 7/20.0% ±0.98 mean±sd, range 66.91±59.67 (3-204) ± (1-492) r=0.062 p=0.722 r=0.117 p=0.502 Ремисия 18/52.9% ± Лека активност 5/14.7% ± Умерена активност 11/31.4% ± Ремисия ±0.43 Лека активност ±0.65 Умерена активност ±1.24 Тежка активност ±0.34 Ремисия ±0.79 Лека активност ±0.42 Умерена активност ±1.04 Тежка активност ±0.25 5АСА 2/5.7% 12/34.3% 2.25± ±0.38 КС 7/20.0% 8/22.9% 1.24± ±0.96 Имуномодулатори 2/5.7% 3/8.6% 1.24± ±0.37 Биологично лечение 24/68.6% 12/34.3% 2.63± ±0.68 r коефициент на корелация; р < 0.05; *Монреалска класификация

4 Експресията на микрорибонуклеиновата киселина-199 нов потенциален биомаркер за имуномедиирано възпаление пресията на mir-199 се установяват сигнификантно по-високи серумни нива при пациентите с БК (2.39±3.91, р<0.05), докато при пациентите с ЯК (1.08±0.64) не се установява подобна разлика. Резултатите показват, че серумната експресия на mir-199 корелира правопропорционално с възрастта при пациентите с БК. Не се установява съществена разлика в експресията на mir-199 според пола, тежестта, формата на протичане и давността на заболяването. При пациентите с БК се установява съществена разлика в експресията на mir-199, която е значително по-висока при тънкочревна локализация (L1) на болестта. Хронично персистиращата форма (т.е. без формиране на ясно обособена ремисия) на ЯК корелира с високата експресия на mir-199. Умерената активност на ЯК корелира повишената експресия на mir-199. Поради липса на валидирани референтни прагови нива на експресията на микро-рнките за разграничаване на пациенти с ХВБЧ от здрави индивиди бе определена праговата стойност (Сut-оff) на експресията на mir-199 за разграничаване на пациенти с ХВБЧ от здрави контроли, която е специфична за дадената популация и служи като ориентир за оценка на експресията при БК и ЯК. В нашето проучване праговата стойност на mir-199 е 0.96 (AUC = ( ); р=0.241) с чувствителност 60% и специфичност 60%. При сравняване на праговите стойности и тези от експресията на mir-199 се установяват сигнификантно по-високи нива при пациентите с БК (2.39±3.91, р<0.05), докато при пациентите с ЯК (1.08±0.64) не се намери подобна разлика. mir-199 има правопропорционална умерена зависимост (r=0.343; p<0.05), която показва, че в 11.76% от случаите експресията на mir-199 може да се свърже с активност на БК. При изследване на нивото на ФКП при пациенти с БК се установи, че експресията на mir- 199 се увеличава при повишени нива на ФКП (р=0.009), като е намерена правопропорционална умерена зависимост (r=0.461; p=0.0063), показваща, че в 21.3% от случаите повишената експресия на mir-199 се свързва с повишените нива на ФКП при пациенти с това заболяване. Високата експресия на mir-199 се явява рисков фактор за повишаване нивата на ФКП при пациенти с БК (OR=10.0 ( ); p<0.05). ДИСКУСИЯ В настоящото изследване установихме, че експресията на mir-199 при пациенти с БК и ЯК има както прилики, така и разлики, които са установени и от други автори (6,11). Wu et al. установяват, че експресията на mir-199 е повишена при пациенти с активен ЯК и БК в сравнение със здрави контроли (11). Paraskevi et al. също докладват за повишени нива на серумната експресия на mir199a-5p при пациенти с БК и ЯК (съответно 7.26 ±1.24 за БК и 5.64 ±0.82 за ЯК) (6). За разлика от тези автори в настоящото изследване се установи, че високата експресия на mir199 корелира с умерената тежест на заболяването при пациенти с ЯК и хронично персистиращата форма на протичане. В свое изследване Ahmed et al. установяват значително по-високи стойности в експресията на тази микро-рнка при пациенти с колоректален карцином (1). В това проучване се установи висока експресия на mir-199 при пациентите с хронично персистираща форма на протичане ЯК. Поради установената връзка в литературата на високата експресия на mir-199 при пациенти с КРК уместно е при тези пациенти мониторирането им да бъде в по-кратки интервали, за да се избегне формирането на колит-асоцииран карцином (8). При пациентите с БК се установи, че тези в ремисия имат несигнификантно по-висока експресия на mir199 спрямо тези в активност. От друга страна се установи, че циркулиращата mir199 има по-високи стойности при пациентите с БК спрямо здрави контроли (съответно 2.39 за БК към 1.26 за здрави контроли), докато при пациентите с ЯК стойностите на серумната експресия на микро-рнката са по-ниска в сравнение с тези на здравите контроли (съответно 1.08 за ЯК към 1.26 за здрави контроли). В свое изследване Iborra et al. установяват, че има съществена разлика в серумните нива на mir199 при пациенти с ЯК спрямо здрави контроли (1.38; р=0.027) (4). От друга страна, Zeng et al. установяват, че експресията на mir-199 се повишава при пациенти с активна БК спрямо пациенти с БК, които са в ремисия (12). Противоположно на тези резултати, експресията на mir-199 в ремисия е по-висока в сравнение с тази при пациентите с умерена активност на БК. Други автори като Fasseu et al. (3) и Pekow и Kwon (7) намират, че експресията на mir-199 (mir-199a-3p, mir-199b-5p) се понижава в тъкан на дебелото черво при пациенти с ЯК спрямо пациенти с БК в ремисия. В настоящото изследване също се установява по-ниска експресия на mir- 199 при пациентите с дебелочревна локализация и в двете групи пациенти. От друга страна, при пациентите с БК високата експресия на ми-

5 Антония Атанасова кро-рнката корелира с тънкочревната локализация (L1) на болестта. В литературата не бяха намерени данни за връзката на експресията на тази микро-рнка и възрастта при пациентите с ХВБЧ. В това изследване се установи, че серумната експресия на mir- 199 корелира правопропорционално с възрастта при пациентите с БК. Въпреки че не беше установена съществена разлика в нивата на циркулиращата mir-199 според прилаганата терапия и двете групи пациенти, може да каже, че експресията на микро-рн- Ката на фона на биологична терапия се повишава при пациентите с БК (2.63), като се доближава до нивата постигнати при ремисия (2.52). При пациентите с ЯК се наблюдава постигане на ремисия според експресията на mir-199 при лечение с 5АСА (0.94). Малката популация, различните извадки и методологията, използвана в публикуваните проучвания, могат да обяснят различните модели на експресия на микро-рнката, идентифицирани в нашата група. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В заключение резултатите от настоящето изследване показват, че има конкретни модели на експресия на mir-199, свързани с различни етапи на ХВБЧ. Тези открития демонстрират, че mir-199 може да играе определена роля при мониториране на активност и ремисия на тези пациенти. Тази микро-рнка може да послужи за разграничаването на БК от ЯК. Установените резултати показват, че mir-199 може да се използва като възможен биомаркер за отдиференциране на пациентите с БК от тези с ЯК. Необходимо е обаче настоящите резултати да бъдат потвърдени чрез по-големи проучвания, като пациентите бъдат групирани според лечението, продължителността на заболяването, формата на протичане или локализация, за да се изясни ролята на mir-199 като биомаркер за терапевтични цели. ЛИТЕРАТУРА 1. Ahmed, F. E., Jeffries, C. D., Vos, P. W., Flake, G., Nuovo, G. J., Sinar, D. R., et al. (2009). Diagnostic microrna markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genom. Proteom. 6, Boros É, Nagy I. The Role of MicroRNAs upon Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Inflammatory Bowel Disease. Cells. 2019;8(11):1461. doi: /cells Fasseu M, Tréton X, Guichard C, Pedruzzi E, Cazals-Hatem D, Richard C, Aparicio T, Daniel F, Soulé JC, Moreau R, Bouhnik Y, Laburthe M, Groyer A, Ogier-Denis E. Identification of restricted subsets of mature microrna abnormally expressed in inactive colonic mucosa of patients with inflammatory bowel disease. PLoS One 2010; 5: e13160 [PMID: DOI: / journal. pone Iborra M, Bernuzzi F, Correale C, Vetrano S, Fiorino G, Beltrán B, Marabita F, Locati M, Spinelli A, Nos P, Invernizzi P, Danese S. Identification of serum and tissue micro- RNA expression profiles in different stages of inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol Aug;173(2): doi: /cei Li C. Intestinal Fibrosis in Inflammatory Bowel Disease: The Role of MicroRNAs. Exploratory Research and Hypothesis in Medicine 2016 vol. 1, Paraskevi A, Theodoropoulos G, Papaconstantinou I et al. Circulating microrna in inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis 2012; 6: Pekow JR, Kwon JH. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis Jan;18(1): doi: / ibd Rashid H, Hossain B, Siddiqua T, Kabir M, Noor Z, Ahmed M, Haque R. Fecal MicroRNAs as Potential Biomarkers for Screening and Diagnosis of Intestinal Diseases. Front Mol Biosci Aug 7;7:181. doi: /fmolb Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microrna generation cascades. The Journal of Biochemistry, 2010, 149(1): Wang Y, Luo J, Wang X, Yang B, Cui L. MicroRNA-199a-5p Induced Autophagy and Inhibits the Pathogenesis of Ankylosing Spondylitis by Modulating the mtor Signaling via Directly Targeting Ras Homolog Enriched in Brain (Rheb). Cell Physiol Biochem. 2017;42(6): doi: /

6 Експресията на микрорибонуклеиновата киселина-199 нов потенциален биомаркер за имуномедиирано възпаление 11. Wu, F., Guo, N. J., Tian, H. Y., Marohn, M., Gearhart, S., Bayless, T. M., et al. Peripheral blood micrornas distinguish active ulcerative colitis and crohn s disease. Inflamm. Bowel Dis. 2011, 17 (1), doi: / ibd Zeng, Zhen; Mukherjee, Arjudeb; Zhang, Hu (2019). From Genetics to Epigenetics, Roles of Epigenetics in Inflammatory Bowel Disease. Frontiers in Genetics, 10, doi: / fgene Адрес за кореспонденция: Доц. д-р Антония Йорданова Атанасова Катедра Анатомия и клетъчна биология Факултет по медицина Медицински университет Варна ул. Проф. Марин Дринов 55 Варна antonia.atanasova@mu-varna.bg, aniatanassova@abv.bg