СПЕЦИАЛИЗИРАН НАУЧЕН СЪВЕТ ПО МОРФОЛОГИЯ Медицински университет Проф. Параскев Стоянов1 Варна Катедра по съдебна медицина, деонтология и клетъчна биол

Препис

1 СПЕЦИАЛИЗИРАН НАУЧЕН СЪВЕТ ПО МОРФОЛОГИЯ Медицински университет Проф. Параскев Стоянов1 Варна Катедра по съдебна медицина, деонтология и клетъчна биология Антон Божидаров Тончев Дългосрочна съдба и молекулярен контрол на ендогенни прогениторни клетки в краен мозък на възрастни примати Шифър Анатомия, хистология и цитология АВТОРЕФЕРАТ на дисертационен труд за присъждане на научна степен "доктор на медицинските науки Варна 2007

2

3 СПЕЦИАЛИЗИРАН НАУЧЕН СЪВЕТ ПО МОРФОЛОГИЯ Медицински университет Проф. Параскев Стоянов Варна Катедра по съдебна медицина, деонтологня и клетъчна биология Антон Божидаров Тончев Дългосрочна съдба и молекулярен контрол на ендогенни прогениторни клетки в краен мозък на възрастни примати Шифър Анатомия, хистология и цитология АВТОРЕФЕРАТ на дисертационен труд за присъждане на научна степен "доктор на.медицинските науки ОФИЦИАЛНИ РЕЦЕНЗЕНТИ чл. кор БАН проф. д-р Михаил Давидов, дмн проф. д-р Николай Лазаров, дмн проф. д-р Камен Узунов, дмн Варна 2007

4 Дисертационният труд съдържа 370 страници и е онагледен с 259 фигури и 13 таблици. Литературната справка включва 505 заглавия, 504 от които - на латиница. Дисертационният труд е обсъден и насочен за официална зашита от разширен катедрен съвет на Катедра по съдебна медицина, деонтология и клетъчна биология. Медицински университет-варна. Изследванията са извършени в Катедрата по неврохирургия към медицинския факултет на Университета на Каназава. гр. Каназава. Япония и УНС по клетъчна биология към Катедрата по съдебна медицина, деонтология и клетъчна биология. Медицински университет-варна. Зашитата па дисертационния труд ще се състои на г. от 16ч. часа в Анатомичната аудитория на Медицински университет София, на открито заседание на Специализирания научен съвет по морфология. Материалите по защитата са на разположение в Секретариата на СНС по морфология. Катедра по анатомия и хистология. Медицински университет София. ул. Здраве 2", тел. 02/

5 Тончев Съдържание 1. Въведение 4 2. Цели и задачи 6 3. Материали и методи 7 4. Резултати У вреда в мозъчни региони след исхемия 4.2. Исхемия и прогениторни клетки в gyrus dentalus 4.3. Исхемия и прогениторни клетки в зона около долен рог на латерален вентрикул и СА I сектор 4.4. Диференциален молекулярен контрол на прогениторни клетки в хипокамп 4.5. Ограничена невронална продукция в постисхемичен стриатум и неокортекс 4.6. Исхемия и прогениторни клетки в преден миграционен поток и bulbus olfactorius 4.7. Исхемия и прогениторни клетки в зона около преден рог на латерален вентрикул -SVZa 4.8. Експресия на транскрипционни фактори в SIZa прогенитори 4.9. Експресия на секреторни фактори и техни рецептори в SVZa прогенитори 5. Обсъждане Изводи Справка за приносите на дисертационния труд Публикации във връзка с дисертационния труд Библиография 65 lo.summary (Резюме на английски език) Благодарности 67 3

6 1. Въведение Мозъкът на полово зрелите бозайници съдържа стволови/прогениторни клетки. Терминът мозъчни прогенитори/неврални прогенитори, който е широко застъпен в настоящата работа, включва всички незрели прекурсорни клетки в ЦНС, включително стволови, невронални и глиални прогенитори (1). Преференциалната употреба на този термин се обуславя от липсата на селективни маркери, които категорично да отличат различните видове недиференцирани клетки, като по този начин изразът мозъчни (или неврални) прогенитори представлява компромисна формулировка, когато пълна яснота относно идентичността на даден пролифериращ клетъчен тип все оше не е налице. В мозъка съществуването на подобни клетки бе удостоверено едва през последните двадесет години, като преди това десетилетия наред преобладава тезата, че мозъкът става структурно стабилен скоро след раждане и си остава стабилен през остатъка от живота (2). Въпреки наличието на данни от 60" години на миналия век за генеза на нови неврони в мозъка на полово зрели бозайници, тезата за наличие на прогенитори, способни за невронална продукция при възрастните, не намира отклик сред мнозинството изследователи. През 90те години наминалия век, обаче, такива клетки са изолирани от ЦНС на възрастни (3,4) и към днешна дата тяхното наличие е широко възприето от научната общност, като най-подробно тези клетки са описани в две зони на мозъка, означавани като герминативни зони или прогениторни ниши: субепендимната зона на предния рог на латералния вентрикул (известна още и като субвентрикулна зона, subventricular zone, съкр. SVZ) и субгрануларната зона в gyrus dentatus на хипокампа (от англ. subgranular zone, съкр. SGZ). SVZ и SGZ съдържат прогениторни клетки, вкл. стволови клетки, които са в състояние да пролиферират както in vivo, така и in vitro, и да генерират неврони в bulbus olfactorius и грануларния слой на gyrus dentatus, съответно (5-7). Пролиферацията и диференциацията на прогениторни клетки в мозък на възрастни примати е слабо проучена, особено след патологични състояния. Откриването и проследяването на такива клетки изисква използването на методи, чиято употреба при хора е редуцирана от етични причини. Това прави маймуните, като еволюционно най-близките до човека бозайници, ценен експериментален модел за подобни изследвания. Неврогенеза (процес на продукция на неврони от стволови/прогениторни клетки) в мозъка на възрастните бозайници е една от най-динамично развиващите се теми в невронауката в последното десетилетие, като интересът към нея бележи експоненциален растеж. Засилва се надеждата у пациенти и изследователи, че ендогенни мозъчни прогенитори могат да бъдат мобилизирани да заместят загиналите неврони при заболявалия, свързани с невронална загуба, като мозъчен 4

7 инсулт и невродегенеративни заболявалия, като болестите на Паркинсон, и Алцхаймер (6,8,9). В съшото време, повечето обнадеждаващи резултати произхождат от модели при гризачи, което налага тяхното потвърждаване в приматния мозък. Настоящето изследване бе фокусирано върху количеството и дългосрочната съдба на прогениторни клетки в няколко зони на краен мозък на възрастни примати след мозъчна исхемия. Мозъчната исхемия е най-честият механизъм за увреда на мозъка Нейното най-често клинично проявление - исхемичният мозъчен инсулт - има честота от на души и смъртност от около 30%, което го превръща в трета по значимост причина за смърт в индустриализираните страни (10). Това обуславя големия интерес към изследвания относно реакцията на ендогенни прогениторни клетки спрямо исхемична увреда в мозъка. Увеличена прогениторна пролиферация и невронална продукция след исхемия бе съобщена в модели при гризачи (11-14), но наличието на подобен процес в приматния мозък остава слабо изследвано. Използвайки приматен модел на мозъчна исхемия, ние показваме способност на прогениторите да преживяват поне три месеца след исхемия и да генерират нови неврони в хипокамп, неокортекс, стриатум, и bulbus olfactorius. За разлика от тези региони, неврогенеза не бе установена в хипокампалния СА1 сектор - най-чувствителния на исхемия мозъчен регион. Ние представяме данни за възможни молекулярни фактори, обуславящи това различие. Ние представяме данни за възможни регулаторни механизми, участващи в прогениторната биология. Това са както вътрешни за клетките фактори като ДНК свързващи транскрипционни фактори, така и външни, секреторни, молекули от групата на растежните фактори. Докато нашите резултати подкрепят данните от предишни сходни изследвания при гризачи, демонстриращи постисхемично увеличение на невронална продукция, ние отбелязваме и наличие на различия както във фенотипа, така и в молекулярния контрол на прогениторните клетки при маймуните. Внимателното изучаване и анализиране на подобни различия вероятно би имало положителен ефект върху ефективността на бъдещите заместителни клетъчни терапии при човешки неврологични заболявания. Данните за ендогенни прогениторни клетки, тяхната съдба и молекулярен контрол в мозък на възрастни примати ще разширят възможностите за терапевтичното приложение на такива клетки в борбата с мозъчните заболявания, характеризиращи се с невронална смърт. 5

8 2. Дели и задачи 2.1. Цели Изследване на дългосрочната съдба на прогениторни клетки в хипокампа на полово зрели маймуни. Изследване на краткосрочна и дългосрочната съдба на прогениторни клетки в неокортекс, стриатум и други теленцефални региони на полово зрели маймуни Изследване на краткосрочна и дългосрочната съдба на прогениторни клетки в SVZ на полово зрели маймуни. «Изследване на потенциални механизми за молекулярен контрол на прогениторни клетки в краен мозък при възрастни маймуни Задачи Извършване на експериментална мозъчна исхемия върху полово зрели маймуни. Интравенозно нжектиране на BrdU в маймуните на кратки (до 2 седмици) и дълги (до 3 месеца) интервали след исхемията. Фенотипизиране на BrdU-позитивните клетки на всеки отделен постисхемичен интервал. Определяне експресията на транскрипционни фактори от прогениторни клетки. Определяне експресията на сигнални молекули и техни рецептори от прогениторни клетки.

9 3. Материали и методи 3.1. Експериментални субекти Всички експериментални процедури бяха извършвани след одобрение и в съответствие с правила на Комисията по Етика на Института за експериментални животни на Медицинския факултет на Университета на Каназава, гр. Каназава, Япония. Субекти на изследване бяха японски маймуни (Macaca fuscata) - автономен за Япония вид. спадащи към т.нар. маймуни на Стария свят - най-близките до човека примати след големите човекоподобни маймуни. Животните (п = 29) бяха с тегло 6-15 кг към момента на експериментите, и на възраст от 14 дни след раждане (п = 1) до половозрели (п = 28) на възраст 6-15 години, което съответства на млада до средна човешка възраст Хирургични процедури Глобална мозъчна исхемия бе извършена на част от възрастните маймуни (п = 18), докато останалите от тях (п = 10) претърпяха симулирана (фалшива) исхемия. Всяка маймуна бе упоена в клетката и подложена на обща инхалационна анестезия. В условия на стерилност, гръдният кош бе отворен, меките тъкани в медиастинума бяха внимателно отпрепарирани, което позволи откриването в дълбочина на a.subclavia sinistra и truncus brachiocephalicus (Фиг. 3.1). Двата съда бяха притиснати с метални клипове Фиг Схема на артериалното дърво на Macaca fuscata, показваи/а позицията на кпампиране на съдовете, кръвоснабдяващи краниални структури (плътни черни линии). за 20 минути непосредствено над мястото им на излизане от аортата, след което кръвотокът бе възстановен. Централно артериално налягане и зеници бяха следени непрекъснато и отчитани на интервали от 2 минути по време на траенето на исхемията. Мозъчният кръвоток бе следен и отчитан чрез апарат за лазерен Доплер (Vasamedics, St. Paul, Minnesota, САЩ). След изтичането на 20те минути, клампите бяха освободени, целостта на гръдната клетка бе възстановена и маймуните бяха върнати в клетките. Симулираната исхемия бе извършена чрез отваряне на гръдната клетка без 7

10 притискане на съдове. Продължителността на анестезията бе еднаква с тази на исхемичните субекти. Неонаталната маймуна не бе оперирана BrdU протокол 5-бромо-2 -деоксиуридин (BrdU; Sigma Chemicals, StXouis, МО, САЩ) бе разтворен в стерилен физиологичен разтвор. Всички възрастни маймуни бяха инжектирани петкратно (1 инжекция на ден) със 100 mg/kg i.v. от този разтвор. Неонаталната маймуна бе инжектирана двукратно - в деня на раждане и на 14-ти ден след раждане с по 250 mg/kg i.v. Следователно, общата BrdU доза за всяка маймуна бе 500 mg/kg. Субектите бяха евтаназирани на различни интервали след BrdU (Фиг. 3.2). Фиг 3.2. Времева рамка на BrdU инжекции и B rd U инф узи я хирургия. Операция бе D5 D9 извършвана на ден 0. (А) В краткосрочната група лсивотни, субектите D23 z> D44 I бяха евтаназирани 2 часа след последната BrdU ишкекция. (Б) В дългосрочната група, BrdU бе инжектиран рачо след операция, а субектите бяха евтаназирани на 2/5/10 седмици след последната инжекция Според продължителността на преживяването им след BrdU, те се подразделят на две групи - краткосрочна (Фиг. 3.2А), субектите в която бяха жертвани 2 часа след последната BrdU инжекция, и дългосрочна (Фиг. 3.2Б), субектите в която бяха жертвани 2/5/10 седмици след BrdU. В краткосрочната група (и = 14), субектите бяха евтаназирани на ден 4 (и = 3), ден 9 (п = 4) и ден 15 (п - 4) след исхемия, или на ден 4 (и = 1) и ден 9 (п = 2) след симулирана исхемия. В дългосрочната група (п = 14), субектите бяха евтаназирани на ден 23 (и = 3), ден 44 {п = 3) и ден 79 (п = 2) след исхемия, или на ден 23 (и = 3) и ден 44 (и = 3) след симулирана исхемия. Неонаталната маймуна бе евтаназирана 2 часа след втората инжекция с BrdU. D Обработка на тъканите Мозъкът бе фиксиран чрез интракардиална перфузия посредством 4% параформалдехид във физиологичен разтвор, буфериран с фосфатен буфер (phosphate-buffered saline. PBS, ph 7.4). Целият мозък (вкл. bulbus

11 9 olfactorius) бе екстрахиран и подложен на постфиксация в параформалдехид, след което бе нарязан на резени с дебелина около 5 mm и прехвърлени в разтвор на 30% захароза и 0.1% натриев азид в PBS за криопротекция. Впоследствие, тъканни блокчета бяха замразени на -70 С. Целият bulbus olfactorius бе включен в ОСТ в рамките на едно блокче. Срези с дебелината 40 pm бяха серийно нарязани на криомикротом (Leica СМ3050). Bulbus olfactorius беше нарязан в хоризонталната равнина. Срезите бяха съхранявани в на -20 С в криопротекгивен буфер Имунохистохимични ощ етявания Всички оцветявания бяха извършвани чрез методиката на свободно плуващи срези, при която антитялото действа двустранно на среза. При пероксидазна имунохистохимия, оцветяванията бяха осъществени по индиректния пероксидазен метод, следвайки тристьпна процедура. Срезите бяха измити във физиологичен разтвор, буфериран с Tris реагент (trisbuffered saline, TBS, ph 7.4) c разтворен в него 0.1% Triton X-100 (TBS-T). Ендогенната пероксидаза бе блокирана в разтвор от 1% Н20 2 в TBS-T за 30 минути, последвана от промиване в TBS-T. Неспецифичното свързване на антигени бе подтиснато чрез 5-10% съответен нормален серум в TBS-T (TBS-TB). Първичните антитела бяха разредени в TBS-TB и срезите - поставени в така получените разтвори за часа на 2-8 С. Срезите бяха трикратно промити в TBS и TBS-T, и инкубирани в разтвор, съдържащ вторично антитяло, насочено срещу вида на съответното първично антитяло и конюгирано с биотин, за 2 часа. След ново измиване, срезите бяха потопени в комплекс авидин/пероксидаза (вторичното антитяло и комплекса авидин/пероксидаза бяха част от кит - ABC Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, СА, САЩ). Реакцията бе визуализирана с разтвор, съдържащ диаминобензидин (Sigma) и Н % Н20 2, 0.25 mg/ml диаминобензидин в TBS секунди. След това реакцията бе преустановена и срезите бяха поставени на предметни стъкла, бяха дехидратирани във възходяща редица алкохоли и ксилол и покрити с изкуствена смола (Entellan, Merck). Оцветяването за BrdU изисква ДНК в клетките да се денатурира преди инкубацията с първичното антитяло - това бе извършвано чрез нагряване на срезите на 65 С за 2 часа в разтвор на формамид/2хстандартен натриев цитрат, последвано от инкубация в 2N НС1 за 30 минути на 37 С. След това процедурата продължи с блокиране на ендогенната пероксидаза. Подобно на пероксидазната, флуоресцентната имунохистохимия бе осъществена по индиректна методика. Тя бе използвана за едновременно разкриване на 2 или 3 антигена на един и същи срез. При такива комбинирани оцветявания, съответните първични антитела бяха по правило видово различни. Използваните първични антитела могат да бъдат

12 класифицирани в три групи: клетъчно-специфични маркери (Таблица 3.1), транскрипционни фактори (Таблица 3.2), и сигнални молекули/рецептори (Таблица 3.3). Антитяло срещу Вид, изотип Разреж- Маркер за да не BrdU миши IgG 1:100 Синтез на ДНК плъши IgG 1:100 Ki67 миши IgG 1:50 Пролифериращи клетки phis1 заешки IgG 1:50 Митотични клетки Musashil плъши IgG 1:100 Мозъчни прекурсори, астроцити Nestin миши IgM 1:100 Мозъчни прекурсори, астроцити заешки IgG 1:400 (3-Tubulin, class Ш миши IgG 1:300 Невронални прекурсори заешки IgG 1:500 Doublecortin заешки IgG 1:300 Невронапни прекурсори TUC42 заешки IgG 1:300 Невронални прекурсори PSA-NCAM3 миши IgM 1:200 Невронални прекурсори NeuN4 миши IgG 1:100 Неврони GAD65/675 заешки IgG 1:400 GABAepr-ични неврони SI 00(3 миши IgG 1:500 Астроцити GFAP6 заешки IgG 1:200 Астроцити Ibal7 заешки IgG 1:800 Микроглия/макрофаги CD68 миши IgG 1:25 Микроглия/макрофаги Ham568 миши IgM 1:50 Активирани микроглия/макрофаги CD31 миши IgG 1:50 Ендотелни клетки CNP8 миши IgG 1:400 Олигодендроцити Активирана заешки IgG 1:50 Алоптоза каспаза-3 Таблица 3.1. Списък на антитела срещу клетъчно-селективни маркери и детайли за тях. 1 Phosphohistone НЗ, 2TOAD/Ulip/CRMP, 3Polysialylated neural cell adhesion molecule, 4Neuronal Nuclei, 5 Glutamic acid decarboxylase, 6Glial fibrillary acidic protein, 7Ionized calcium binding adapter molecule 1, 7Human alveolar macrophage 56 antigen, e2',3'-cyclic nucleotide 3 '-phosphodiesterase. Антителата бяха закупени от Chemicon, Temecula СА, САЩ; Becton Dickinson, San Jose, СА, САЩ; Harlan Sera-Lab, Loughborough, Англия; Sigma Chemical, S t Louis, МО, САЩ; DAKO, Carpinteria CA, САЩ. От сигналните молекули, се фокусирахме на такива, които са с ангиогенна и невротрофна активност, включително VEGF и неговите рецептори Fltl, Flkl и Nrp, Angl/2 техният рецептор Tie2, невротрофините NGF, BDNF, NT3 и GDNF, и техните рецептори. 10

13 Антитяло с/у В и д,изотип Разрей дане Рахб заешки IgG I; 400 Етх2 заешки IgG 1:300 Ngnl заешки IgG 1:1000 Ngn2 заешки IgG 1:1000 Ngn3 заешки IgG 1:100 Dlxl заешки IgG 1:1000 Dl\2 заешки IgG 1:200 Dlx5 заешки IgG 1:500 Oligl заешки IgG 1:1000 Olig2 заешки IgG 1:200 01ig3 заешки IgG 1:300 Soxl заешки IgG 1:200 Sox2 заешки IgG 1:200 Sox3 заешки IgG 1:200 Nkx2.2 заешки IgG 1:200 Islet 1 заешки IgG 1:200 Маркер за Ранни кортикални прогенитори Ранни кортикални прогенитори Невронални кортикални прогенитори Невронални кортикални прогенитори Невронални кортикални прогенитори Невронални стриатални прекурсори Невронални стриатални прекурсори Невронални стриатални прекурсори Олигодендрошшш прекурсори Вентрални теленцефални прекурсори; олигодендрошгтни прекурсори Дорзални гръбначномозъчни прекурсори Ранни прогенигори/стволови клетки Ранни прогенигори/стволови клетки Ранни прогенигори/стволови клетки Олигодендрошгтни прекурсори Комитирани стриатални постмитотични прогенитори и неврони Комитирани неокортикални постмитотични Tbrl кози IgG прогенитори и неврони^ _ Таблица 3.2. Списък на антитела срещу транасрипционни фактори и demaiciu за тях. Dlx, Dislalless-homeobox; Етх. Empty spiracles Iwmeobox; Jsll, Islet 1; Ngn, Neurogenirt; \'kx, Ntrenberg/Kim box; Olig. Oligodendrocyte lineage gene; Pax, Paireddiomeobox; Sox, Sry-related box; Tbrl, T-brain-I; Антителата бяха закупени от Chemicon. Covance, Richmond. СА. САЩ и Santa Cruz Biolech, Santa Cruz. СА. САЩ. Антитялото cpeujy OUg2 ни бе предоставено от д-р Хирохиде Такебаяши, Оказаки, Япония. Първични антитела бяха последователно визуализирани с вторични антитела, конюгирани за флуорохроми; Alexa Fluor 488, 546, 633 (Molecular Probes, Eugene, OR, СА1Д) или TRITC (Jackson Immunoresearch, West Grove. PA). Alexa Fluor 488 излъчва в зеления, Alexa Fluor 546 и TRITC - в червения, a Alexa Fluor в инфрачервения спектър. Съответните вторични антитела бяха прилагани според вида на първичното и всяко от тях бе свързано с различен флуорохром. След това срезите биваха промивани в TBS, монтирани върху предметни стъкла и включени във водоразтворим медиум (Vectashield, Vector Labs), съдържащ запазващи флуоресценцията реагенти. 11

14 Ендогенни прогенигорни клетки в приматен мозък Антитяло Вид, изотип Разреждане Доставчик (кат. #) срещу VEGF кози IgG 1:200 Santa Cruz; #sc-l 52 Fltl заешки IgG 1:100 Santa Cruz; #sc-9029 Flkl заешки IgG 1:50 Santa Cruz; #sc-504 Nrpl заешки IgG 1:200 Santa Cruz; #sc-5541 Kit заешки IgG 1:50 Calbiochem; #PC34 Ang I кози IgG 1:50 Santa Cruz; #sc-6319 Ang2 кози IgG 1:50 Santa Cruz; #sc-7016 Tie2 заешки IgG 1:100 Santa Cruz; #sc-324 Tiel заешки IgG 1:100 Santa Cruz; #sc-342 NGF заешки IgG 1:200 Santa Cruz; #sc-548 BDNF заешки IgG 1:200 Santa Cruz; #sc-546 NT3 кози IgG 1:200 Santa Cruz; #sc TrkA заешки IgG 1:200 Santa Cruz; #sc-118 TrkB заешки IgG 1:200 Santa Cruz, #sc-12 TrkC заешки IgG 1:200 Santa Cruz; #sc-l 17 p75ntr миши IgG 1:50 Dako; Ш3507 GDNF кози IgG 1:100 R&D Systems, #AF-212-NA GFRal заешки IgG 1:200 Santa Cruz; #sc Ret кози IgG 1:200 Santa Cruz, #sc-1290 Таблица 3.3. Списък на антитела cpeiiqi сигнални мстекули/рецептори и детайли за тях. Антителата бяха закупени am Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, СА. САЩ u R&D Systems, Minneapolis, MN, САЩ: VEGF, vascular endothelial grtnvth factor; Fit, fms-like tyrosine kinase; Flk, fetal liver kinase; Nrp, neuropilin; Ang, angiopoietin; Tie, tyrosine kinase with immunoglobulin-like and epidermal, growth factor-like domains; NGF, nerve growth factor: BDNF, brain-derived neurotrophic factor; NT3. neurotrophin-3; Trk, tropomyosin-related kinase; p75sri>, 75 kd pan-neurotrophic receptor; GDNF, glial cel! line-derived neurotrophic factor; GFRal, GDNF family receptor al; Ret. Rearranged during transfection.. - Специфичността на имунологичните реакции бе проверена чрез негативни и позитивни контроли. Негативни контроли включваха: (/) оцветяване на срези от маймуни, които не са инжектирани с BrdU: (п) пропускане на стъпките за ДНК денатурадия; (ш) пропускане на първично антитяло; (iv) пре-адсорбиране на първичните антитела с 10-кратно повисока концентрация на пептида, послужил при тяхното генериране, в случаите, в които такива блокиращи пептиди бяха налични от фирмата производител: anti-vegf, anti-nrpl, anti-ngf, anti-bdnf, anti-nt3, anti- TrkA. anti-trkb, anti-trkc, anti-angl, anti-ang2, anti-tiel, и anti-tie2. Всички така обработени контролни срези останаха имунонегативни. Позитивните контроли представляваха пролиферативни тъкани (напр. корнеален или чревен епител) от същите експериментални маймуни. 12

15 3.6. Визуализиране на клетки с veveda на ДНК и дегенерация За отчитане на ДНК увреди в клетките използвахме реакцията Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dutp nick end labeling (TUNEL), който прикачва към освободените от фрагментирането на ДНК краища белязани нуклеотиди. Срези бяха дехидратирани във възходяща редица етаноли, завършваща с 15-минутна инкубация в 100% етанол, последвана от рехидратация в низходяща редица етаноли до TBS. След това срезиге бяха третирани с протеиназа К (20pg/mL; 15 мин). След неколкократни измивания в TBS-T, срезите бяха уравновесени в работен буфер без ензим и нуклеотиди. като впоследствие бе добавен TdT ензима с белязани (с дигоксигенин) нуклеотиди в съотношение 15/85 (тези реагенти бяха част от комплект - ApopTag in situ cell death detection kit, Intergene, Purchase, NY, СА1Д) за 2 часа на 37 C. Инкорпорираният дигоксигенин бе визуализиран имунохистохимично. Като позитивна контрола на оцветяването, срези бяха инкубирани в деоксирибонуклеаза. а като негативна контрола бе пропуснат TdT ензимът от съответната стъпка. За комбинирано флуоресцентно оцветяване с различни маркери, първо бе осъществена TUNEL реакцията и след това имунохистохимичната реакция. Като маркер за дегенерация използвахме Fluoro-Jade - анионно производно на флуоресцина, което селективно се инкорпорира в клетки, претърпяващи дегенеративни промени. Срези бяха монтирани на предметни стъкла и изсушени на 37 С за 30 мин. Впоследствие, срезите бяха третирани с низходяща редица алкохоли до дестилирана вода и инкубирани в 0.05% КМп04 за 30 минути, последван 0.001% Fluoro-Jade В (Chemicon) в 0.1% оцетна киселина за 30 минути. Накрая, срезите бяха промити в дестилирана вода, изсушени, дехидратирани в ксилен и покрити. Fluoro-Jade се наблюдава под флуоресценция - има пикова възбудна дължина на вълната от 450 nm и пикова излъчвателна дължина на вълната от 530 шп. 3.7, Получаване на изображения и техен анализ Светлинномикроскопският анализ на имунопероксидазните срези бе осъществен чрез микроскоп, свързан към персонален компютър чрез дигитална камера. BrdU-позитивните (BrdLT) клетки бяха изчислявани на кодирани срези (серия от всеки 12та) през регионите на интерес, като BrdlT клетки бяха преброени върху компютърен екран в границите на дигитално генерирани рамки, поставени на случайно подбрани места в следните региони (Фиг. 3.3): 13

16 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк Фиг (А) Региони на интерес в темпоралния д.ял. IT, inferior temporal cortex; GPH, gyrus parahippocampalis; HPC, hippocampus; DGL, грануларен слой на gyrus dentatus; Sub, subiculum; LVi, долен рог на латералния вентрикул; SVZi, Sl-'Z около долния рог на латералния вентрикул; правоъгълници в СА1-3 - рамки за броене. (Б, В) Региони на интерес във фронталния дял, на коронален (Б) или хоризонтален (В) срез. LVa, преден рог на латералния вентрикул; SVZa, SVZ около предния рог на латералния вентрикул; S. стриатум; F, фронтален неокортекс. Посоки: D, дорзална; V, вентрапна; М, медиална; L, латерална; А, предна; Р, задна. 1. Cornu Ammonis (СА, hippocampus proprius) бе подразделен на сектори по класификацията на Lorente de No. Рамките на броене бяха поставени СА1-САЗ (Фиг. З.ЗА). 2. В gyrus dentatus, BrdtT клетки бяха преброени в stratum granulare и SGZ на цяло и броят на клетките бе разделен на площта. 3. В gyrus parahippocampalis, BrdU+ клетки бяха преброени в 3 рамки от 880 pm х 680 pm. Поради анатомичната и функционална им близост и поради липсата на различия по отношение гъстотата на BrdlT клетки между тях, gyrus parahippocampalis и regio entorhinalis ще бъдат общо означавани като regio parahippocampalis с дескриптивни цели в рамките на настоящето изследване. 4. В темпоралния неокортекс, BrdlT клетки бяха преброени в полета от 880 pm х 680 pm, в gyrus temporalis superior и в gyrus temporalis medius/gyrus temporalis inferior, под общото наименование Inferior Temporal Cortex (IT). 14

17 5. Във фронталния дял (Фиг. З.ЗБ,В), изследвахме SVZ около предния рог на латералния вентрикул (означавана от нас като SVZa), стриатума в близост до SVZa и префронталния неокортекс. BrdlH клетки бяха преброени в рамки както в темпоралния кортекс. SVZa бе изследвана в 5 аспекта: дорзален. стриатапен, септален, вентрален и преден (последният - само на хоризонтални срези). Използвахме рамки от 800pmx ЮОрт, приложени върху всеки от 5те SVZa аспекта. 6. В bulbus olfactorius и прилежащия му преден миграционен поток (rostral migratory steam, RMS) (пътят на прогениторите от SVZa към булбуса), ВпП-Г клетки бяха преброени на хоризонтални срези. Клетките, позитивни за NeuN, TUNEL и Fluoro-Jade, бяха количествено оценявани в полета от 800 pm х 500 pm (в СА1) или 800 pm х 1000 pm (кортекс и стриатум). Флуоресцентните срези бяха наблюдавани на флуоресцентен микроскоп, а образите бяха получени с лазерен сканиращ конфокален микроскоп (LSM 510, Carl Zeiss). Използвахме 3 лазера: аргонов, излъчващ с дължини на вълната в зеления и жълт спектри (457, 488 и 514 шп), и 2 хелиево-неонови, излъчващи в червения (543 nm) и инфрачервения (630 шп) спектри, респективно. Употребата на 2 или 3 различни дължини на вълната позволява едновременна детекция на сигнали от 2 (респ. 3) флуорохрома едновременно. Срезите бяха сканирани при стъпка от pm. Така получените компютърни образи бяха последователно подредени в поредици (image stacks), от който софтуерът на LSM изчислява и генерира ортогонални проекции в равнините хи у. Флуорохромите бяха зададени към следните канали на микроскопа: Alexa Fluor към зеления, Alexa Fluor 546 и TRITC - към червения, Alexa Fluor към синия. Поне по 100 BrdU+ клетки бяха фенотипно охарактеризирани за всеки клетъчно-селективен маркер, транскрипционен фактор или сигнална молекула/рецептор, чрез двойни оцветявания. Стойностите бяха осреднени за да се получи средна стойност за всяка молекула/експериментална група. Всички окончателни компютърни образи бяха експортирани в образен формат (.jpeg или.tiff) и подредени чрез Adobe Photoshop 5.0 (Adobe Systems, Mountain View, СА, СА1Д) Статистически анализ Количеството на BrdlT клетки беше оценено дензитометрично (клетки/m m ). Данните за всяка група животни бяха осреднени. Статистическата значимост на резултатите бе проверена с еднофакторен анализ на вариациите (one way ANOVA), последван от теста на Tukey- Kramer за множествени сравнения (Tukey-Kramer s post hoc) или чрез Г-test. За процентите използвахме непараметрични тестове (Mann-Whitney и Kruskal-Wallis). Разликите бяха считани за сигнификантни при Р <

18 4. Резултати 4.1. У вреда в мозъчни региони след исхемия Клампирането на съдовете, кръвоснабдяващи краниума, доведе до рязка редукция на мозъчния кръвоток - от ml/100g мозъчна тъкан/мин до ml/100g мозъчна тъкан/мин. След реперфузията мозъчния кръвоток се върна до предисхемичните му нива. В чувствителния на исхемия хипокампален сектор СА1. исхемията доведе до рязко повишаване на TUNEL+ клетки на 4 постисхемичен ден, след което броят им се върна на предисхемични нива (Фиг. 4.1 А). Подобен резултат бе отбелязан и по отношение на Fluoro-Jade+ клетки в СА1 (Фиг. 4.1Б). Двойни оцветявания с NeuN, както и морфологията на TUNEL+ и Fluoro-Jade+ клетки водеха към извода, че тези клетки са СА1 неврони. Освен в хипокамп, исхемията доведе до увеличаване на броя увредени клетки във фронтална кора и стриатум. Подобно на хипокампа, увеличението бе пиково на ден 4, и впоследствие сигнификантно намаля. Cont D4 D9 D15 Cont D4 D9 D15 Фиг (А) Статистически анализ на брой TUNEL1 клетки в рамки за броене в СА1 сектор. (Б) Статистически анализ на брой Fhioro-Jade- клетки в рамки за броене в СА1 сектор (***, Р<0.001 спрямо останалите времеви интервали). За разлика от СА1, в gyrus dentatus не бяха наблюдавани дегенеративни промени. Тези данни потвърждават избирателния характер на увредите след транзиторна глобална мозъчна исхемия. В СА1 сектора, броят на NeuN4- клетки бе значително редуциран, без да се наблюдава последващо увеличение при изследвания на попродължителни интервали след исхемия (Фиг. 4.2А). В СА2 не бе наблюдавано значимо намаление на броя NeuN* клетки (Фиг. 4.2Б). За разлика от хипокампалния СА1 сектор, на срези оцветени за NeuN в неокортекс не бе открита невронална загуба в степен да бъде видима под формата на голи полета на малко увеличение. На по-голямо увеличение, обаче, се откриваха клетки, показв ш дегенеративни промени. 16

19 Ендогенни прогениторни клетки в гтриматен мозък С D4 D9 D15 D23 D44 С D4 D9 D15 D23 D44 Фиг Статистически анализ на броя NeuN~ клетки в рамки за броене, разположени е проксимален СА1 (А) и в СА2 (Б), на контролна, и исхемични групи на ден 4/9/15/23/44. Обърнете внимание, че броят на NeubT клетки в СА 1 слеед исхемия не се увеличава с времето. ***, Р< В СА2 липсват статистически значими промени в броя на NeubT клетки. Взети заедно, данните от различни региони на мозъка след исхемия показват, че най-масивна е невроналната загуба в hippocampus proprius (найвече СА1 сектор), докато в кортекс и стриатум загубата е чувствително помалка. В gyrus dentatus и bulbus olfactorius дегенеративни промени и постисхемична клетъчна загуба напрактика липсват в нашия модел. Това означава, че постисхемичната прогениторна реакция в рамките на представения модел бива изследвана в контекст на умерена увреда (с изключение на СА1). Това трябва да се има предвид поради факта, че сигнали от средата могат да влияят (позитивно или негативно) на прогениторите. За сравнение, при моделите на фокален инсулт, в ядрото му се наблюдава тотална некроза Исхемия и прогениторни клетки в svrus dentatus Gyrus dentatus е регионът, кьдето постисхемична прогениторна пролиферация бе описана за първи път. В краткосрочната група след исхемия/brdu, BrdU+ клетки отбелязаха повишение на дни 9/15 след лезията. Поради това, маймуните от дългосрочната група субекти бяха инжектирани с BrdU между дни 5 и 9 след хирургичната интервенция, и впоследствие убити на различни интервали, за да се прецени количеството и фенотипа на BrdLT клетки. Тенденцията за по-високи нива на BrdU+ клетки се запази, като всяка от групите, евтаназирани на постисхемични дни 23 и 44 се представяше с видимо по-голям брой BrdLT клетки от съответните контроли с еднаква преживяемост след BrdU (Фиг. 4.3). 17

20 Фиг 4.3. Оцветяване за BrdU в gyrus dentatus на дългосрочната група след BrdU. Времевата рамка на инз/сектирането на BrdU и моментът на перфузия на маймуните от всяка експериментална група са представени вдясно от съответните репрезентативни микрографии. (-), негативна контрола - оцветяване за BrdU у маймуна, която не е била 1тжеюппрана с BrdU. Най-дол)1 вдясно е представена схема, показвспца позицията на зрителното поле в хипокампа. Мащабна скала = 200 рт. Видимите различия в количеството на BrdlT клетки между исхемични и контролни маймуни, както в краткосрочната, така и в дългосрочната група, бяха потвърдени с количествен анализ (Фиг. 4.4). Краткосрочна група ^ К01ТТр01а Дългосрочна група исхемия Фиг Статистически анализ на гъстота на B rdu клетки (на мм') в gyrus dentatus. **". Р<0.001 спрямо съответни контроли. 18

21 По-високи нива на BrdU+ клетки бяха отчетени и в исхемичната група с най-дълга преживяемост след BrdU (10 седмици) спрямо контролните субекти с по-кратка преживяемост (2 и 5 седмици след BrdU). Предвид този резултат, и тъй като в нормални условия броят на BrdU* клетки в gyrus dentatus намалява след 5 седмица след инжектирането, ние не проведохме изследвания с контролна група на 10та седмица след BrdU, съобразявайки се и с по-голямата етична загриженост, отдавана на експерименти с примати. Тъй като прогениторните клетки често формират агрегати in vivo, особено в прекурсорните ниши, ние изследвахме и клетъчните групирания (дефинирани като агрегат от 3 или повече клетки) в SGZ. С удължаване на преживяемостта след BrdU, ние очаквахме все по-малък процент BrdU+ клетки да се задържат в SGZ, докато все по-голяма част от тези клетки да биват откривани в грануларния слой. Тези очаквания не се сбъднаха. Дори и след преживяемост от 10 седмици след BrdU, нерядко бяха откривани агрегати в SGZ (Фиг. 4.5). * «"1SI % контрол» лен 9 ден 23 ден 44 Фиг Клетъчни агрегати от BrdU* клетки в SGZ. Микрографиите показват, че такива групирания са налични на всички постисхемични времеви точки. Мащабна скала = 20 рт В съответствие с тези данни, пропорцията BrdU+ клетки в gyrus dentatus, разпределени в грануларния слой или в SGZ, остана непроменена на различните времеви периоди след операция/brdu: около 70% в SGZ и около 30% в грануларния слой. Оцветявания за Ki67 и ph is потвърдиха увеличената пролиферация след иехемия, както и инкорпорацията на BrdU в пролифериращи клетки. Двойни оцветявания за BrdU и Musashil, маркер за неврални (недиференцирани) мозъчни прогенитори, показаха, че BrdU+ агрегати в gyrus dentatus на дългосрочна група са позитивни за този протеин (Фиг. 4.6; Таблица 4.1). Ден 9 Ден 23 Ден 44 Ден 79 Контрола Иехемия Контрола Иехемия Контрола Иехемия Контрола Иехемия Musashil 42 ± 6 45 ± 7 36 ± 6 47 ± 8 44 ± 8 49 ± 7 41 ± 7 Nestin 23 ±5 20 ± 5 25 ± 6 28 ± 5 30 ± 7 26 ± 4 33 ± 6 Таблица 4.1. Проценти на BrdU* клетки в gyrus dentatus, двойно позитивни за Musashil и Nestin на различни времеви интервали след иехемия. Статистически различия не бяха отчетени. 19

22 Фиг Двойно M usashil/brdu оцветяване в SGZ на ден 79 Клетъчният агрегат в е показан е разделяне на каналите (червен/зелен) и слят образ в (жълто). Мащабна скала = 5 рт Ние изследвахме за BrdU инкорпорация и маркери за комитирани невронални прекурсори, като (Mil-tubulin (Фиг. 4.7), TUC4, Hu, Doublecortin, pill-tubulin, PSA-NCAM (Таблица 4.2). Открихме двойно позитивни клетки изпращащи израстък в дълбочина на грануларния слой, както и към съседни, ембрионално генерирани, неврони, и осъществяващи морфологични контакти е тях (Фиг. 4.7; глави на стрелки). Фиг Двойно /ЗШ-tubulin/BrdU оцветяване в SGZ на ден 79. Двойно позитивна клетка в левия панел (стрелка) е показана с разделяне на канапите (червен/зелен) и ортогонапна проекция в оси х/у в десния пане7. Израстъци на същата клетка (глави на стрелки) изглеждат в непосредствена близост с такива на съседни (негативни за BrdU) неврони. Мащабна скала = 20 рт Количествен анализ на BrdU+ клетки, позитивни за маркери на невронални прекурсори, показа статистически значимо увеличение в дългосрочната група на преживяване след исхемня, както спрямо краткосрочната група, така и спрямо контролните субекти от дългосрочната група (Таблица 4.2).

23 Ден 9 Ден 23 Ден 44 Ден 79 Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Pill-Tubulin 0 4 ±0.3* 6 ± 2 8 ± 3** 12 ± 6 10 ± 5** 9± 2** TUC4 0 3 ± 0.2* 6 ± 2 9 ± 3** 7 ± 5 12 ± 5** 6 ± 2** Doublecortin 0 4 ±0.5* 7 ± 3 9 ± 5** 8 ± 4 9 ± 4*. 5 ± 1** Hu 0 1±0.5* 8 ± 3 7 ± 4** 10 ± 5 8 ± 3** 3 ± 2** PSA-NCAM 0 3 ± 0.8* 8 ± 4 10 ± 5** 8 ± 4 9 ±6** 6 ±2** Таблица 4.2. Проценти на B rdlt клетки в gyrus dentatus, двойно позитивни за маркери на невронални прогенитори на различни времеви интервали след исхемия. **. Р<0.01; *, Р<0.05. Наблюдаваното увеличение на процента BrdU+ клетки, двойно позитивни за невронални прогениторни маркери с увеличаване на преживяемостга след исхемия, е белег на матурация и ни провокира да изследваме и маркери за зрели неврони, NeuN и GAD (Glutamic acid decarboxylase, маркер за GABA-ергични неврони) (Фиг. 4.8). Фиг Двойни оцветявания за NeuN/BrdU на ден 79 и GAD/BrdU на ден 44. в gyrus dentatus. Двойно позитивни клетки са показани с разделяне на каналите (червен/зелен) и ортогонални проекции в оси х/у. Клетките са разположени в най-вътрешния (съседен на SGZ) слой грануларни неврони. Такива клетки се представиха със статистически значимо увеличение в дългосрочната група на преживяване след исхемия, както спрямо краткосрочната група, така и спрямо контролните субекти от дългосрочната група (Таблица 4.3). Ден 9 Ден 23 Ден 4 4 Ден 79 Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия NeuN о 2 ± 1 5 ± 2 6± 3* 5± 2* 7± 3* 8± 3* GAD 0 I ± ± 2 5 ±2* 5 ±2* 4 ±2» 7 ±4* Таблица 4.3. Проценти на B rdlt клетки в gyrus dentatus, двойно позитивни за зрели невронални маркери на различни времеви интервали след исхемия. *, Р<(> 05.

24 Ние изследвахме и фенотипа на оставащите, около 40%, BrdU клетки, чиято съдба не бе покрита от цитираните до този момент клетъчноселективни маркери. Повечето от тях се оказаха микроглиоцити, позитивни за маркера Ibal (Фиг. 4.9). Фиг. 4.9 Фенотип на BrdU* клетки в gyrus dentalus на дългосрочната група маймуни. Статистически значими различия не се наблюдават. За разлика от микроглиалните клетки, астроцитите в SGZ останаха негативни за BrdU Исхемия и прогениторни клетки в SVZi и СА 1 сектор SVZ по протежението на долния рог на латералния вентрикул (означавана от нас като SVZi) представлява интерес като прогениторна ниша поради анатомичната си близост с чувствителния на исхемия СА1 сектор (Фиг. З.ЗА). Пролиферацията на прогенитори се увеличава в краткосрочната група след BrdU, както вече сме докладвали. Изследване на дългосрочната съдба на BrdU* клетки в SVZi показа, че постисхемичните маймуни съдържат по-голям брой такива клетки от респективни контроли със същата преживяемост след BrdU (Фиг. 4.10). Фиг Статистически анализ на гъстота (А) и абсолютен брой (Б) BrdU* клетки в SVZi на дългосрочната група след BrdU. ***. Р<0.001.

25 Клетъчни групирания, позитивни за BrdU, бяха положително оцветени за маркерите Musashil и Nestin както в краткосрочна, така и в дългосрочна група субекти. За разлика тях, двойни оцветявания за BrdU и маркери за невронални прогенитори като демонстрираха ко-локализация само в краткосрочната група, но не и в дългосрочната група субекти (Фиг. 4.11). Фиг Двойни оцветявания за BrdU и Doublecorlin, и слят образ, в SVZi на краткосрочна (А) и дългосрочна (Б) групи животни. Докато в краткосрочната група са налице двойно позитивни клетки (стрелка на панел А), това не е така в дългосрочната група (стрелка на панел Б). Глава на стрелка на панел Б посочва Doublecorlin* кзетка. Мащабна скала = 20 /.on По този начин, BrdU бе инкорпориран от неврални прогенитори на всички изследвани времеви интервали в SVZi, докато в невронални прогенитори бе инкорпориран само в краткосрочната група животни (Таблица 4.4). Ден 9 Ден 23 Ден 44 Ден 79 Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Musashil 35 ±6 44 ±8 26 ±8 37 ± ± ±9 37 ± 8 Nestin 19 ± 5 20 ± 6 17 ± 6 31 ± 9 27 ± II 32± ± 9 Doublecorlin 0 3 ± 1* pill-tubulin 0 2± 1* Таблица 4.4 Проценти на BrdU* клетки в SVZi, двойно-позитивни за прогениторни маркери, на различни времеви интервали след исхемия. *. Р<0.05 спрямо контроли. В СА1 сектор на дългосрочна група маймуни, оцветяване за BrdU в показа многобройни позитивни клетки, равномерно разпределени в слоевете на хипокампа (Фиг. 4.12). Както в краткосрочна, така и в дългосрочна група, количеството BrdU+ клетки в исхемичните субекти бе по-голямо от това в съответни контроли (Фиг. 4.13). 23

26 исхемии Pyr j Rad I контрола Pyr j Rad I Фиг Оцветяване за BrdU в СА 1 сектор на дългосрочната група след BrdU, ден 44. Мащабна скала = 100 рт. В СА2-4, исхемията също доведе до увеличение на гъстотата BrdU+ клетки, но при по-ниски нива отколкото в СА1. Фиг Статистически анализ на гъстотата BrdU* клетки/.мм' в СА1. *, Р<0.05: **, Р<0.01; ***. Р<0.001 спрямо съответните контроли. Анализ на фенотипа на BrdU+ клетки в СА1 демонстрира предимно глиална пролиферация, микроглиална, и в по-малка степен астроглиална (Фиг. 4.14). Фиг Фенотип на BrdU* клетки в СА 1 сектор на дългосрочната група маймуни. Статистически значими различия не се наблюдават, lb a l маркира.иикроглия, S100/3 - астроглия. a CNP - олигодендрогчия. 24

27 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотък Експресия на BrdU в клетки, позитивни за маркери за зрели неврони (NeuN) или невронални прогениторн (pill-tubulin), не бяха открити (Фиг. 4.15). NeuN [3111-tub BrdU ^ BrdU \ *. -.. \ в / V ^" шш - \ шт Фиг Липса на двойно оцветени кпетки за BrdU и невронални маркери в постисхемичен СА 1 сектор. Двойно оцветяване за NeuN/BrdU и pili-iubulm BrdU на ден 44. Мащабна скаю = 20 рт Диференциален молекулярен контрол на прогениторни клетки esvziusg Z В хипокамп на гризачи, пирамидните неврони на СА1 сектора, които загиват след глобална исхемия, биват подменяни чрез неврогенеза от прогениторни клетки, намиращи се в съседна перивентрикуларна зона. В хипокампа на маймуните, съседна зона на СА1 сектора е SVZi (Фиг. З.ЗА). Имайки предвид контрастиращата разлика в способността за невронална продукция между gyrus dentatus и СА1 сектор, ние очаквахме, че може да съществуват различия между SGZ и SVZi в експресията на вътрешни за прогениторите молекули, напр. фактори на транскрипцията, като Етх2, Рахб и Ngn2. Рахб и Етх2 бяха избрани, защото и двете молекули се експресират от прогениторни клетки в нормалния хипокамп или след исхемия, при гризачи. Ngn2 е про-невронален транскрипционен фактор, зависим от Рахб за своята активация. Оцветявания за Етх2 или Рахб в gyrus dentatus позитивираха клетки в SGZ, и агрегати от BrdU+ клетки бяха двойно-позитивни както за Етх2 и Рахб (Фиг. 4.16). Процентът на ко-експресия с BrdU беше 28% за Етх2 и 36% за Рахб.

28 Ендогенни прогениторни клетки о прнматсн мотьк Emx2 BrdU Рахб BrdU r ----*. SGZ [ * SGZ 4 %% и. *? Em x2. BrdU BrdU Рахб * w % Фиг Транскригщионните фактори Етх2 и Рахб в SGZ. Двойни оцветявания с BrdU показват наличие на BrdU/Emx2 и BrdU/Рахб двойно-позитивни клетки (рамкираните клетъчни агрегати са показани с разделяне на каналите). Мащабна скала = 20 рт От своя страна, Ngn2 беше силно позитивен в SGZ и в по-малка степен в грануларния слой на gyrus dentatus (Фиг. 4.17). BrdU7Ngn2~ клетки съставляваха 17% от BrdU+ клетки на ден 9 след исхемията. Фиг Двойно Ngn2/BrdU оцветяване в SGZ, демонстриращо Ngn2*/BrdU* клетъчен дублет", показан с разделяне на каналите и триизмерни реконструкции. Мащабна скала = 10 рт. За разлика от SGZ, никой от Етх2, Рахб или Ngn2 не се ко-локализира с BrdU+клетки в SVZi. 26

29 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк 4.5. Ограничена невронална продукиия в постисхемичен стриатум и неокоутекс Подобно на изследванията ни в хипокампа, ние наблюдавахме пролиферацията в нормален и постисхемичен стриатум и фронтален кортекс. Исхемията доведе до рязко и сигнификантно увеличаване на количеството BrdU+ клетки (Фиг. 4.18А) в стриатума на дни 9 и 15 от краткосрочната група животни, както и на изследваните времеви интервали от дългосрочната група, спрямо съответните контроли (Фиг. 4.18Б). Фиг. 4.1 В (А) Оцветяване BrdU е стриатум на контролi и постисхемична (ден 9) груп Наблюдава се значителi разлика в количеството i BrdU* клетки меж ду контрол! и постисхемичен стриату. Мащабна скала = 50 рт (. Статистически анализ I количество B rdlt клетки 0 м и') в стриатум / краткосрочна и дългосроч1 групи маймуни. *, Р<0.05; ** Р<0.001 спрямо съответ! контроли. Подобни резултати бяха получени и във фронталния неокортекс и потвърдени чрез статистически анализ. Както в стриатума, така и в кората, BrdU+ клетки бяха равномерно разпръснати в паренхима без да се очертават зони с подчертано повишена гъстота на BrdlT клетки (Фиг. 4.18). Преобладаващото мнозинство (около 90%) BrdlT клетки бяха микроглия или астроглия (Таблица 4.5). Ден 9 Ден 23 Ден 44 Ден 79 Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Ibal 7 ± 3 79 ± 19* 6 ± 3 81 ± 15* 6± 3 80 ± 26* 78 ±21 sioop 0 12 ±6* 4 ± 2 11 ±6* 4 ± 3 10 ± 5* 11 ± 5 CNP 0 3± 1* 0.5 2± 1* 0.5 2± 1* 2 ± 1 NeuN ,3 ±0.4* ±0.5* 1± 0.5 Musashi 1s 5 ± 3 6± 1 4 ± 1 5 ± 2 4 ± 2 5 ± 3 5 ± 3 Таблица 4.5. Проценти на B rdlt клетки в стриатум и кортекс (осреднени), двойнопозитивни за клетъчно селективни маркери, на различни времеви интервали след исхемия. *, Р<0.05 спрямо контроли., Musashil*/GFAP~/SI00(T клетки, различни от пролифериращите астроцити, които също са позитивни за Musashil. Малка част от BrdU" клетки в стриатум и кортекс след исхемия бяха позитивни за олигодендроцитния маркер CNP (Фиг. 4.19; Таблица 4.5). 27

30 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мо*ьк Фиг Двойно оцветяване за BrdU (червен канал) и олигодендроцитния маркер CNP (зелен канал) в стриатум на постисхемичен ден 79. Мащабна скала = 5 рт. Специален интерес за нас представляваше изследването на възможността за de novo генерация на неврони в стриатум и неокортекс след исхемия, поради наличието на данни, показващи такава продукция в тези зони при нормални маймуни. Ние анализирахме двойни оцветявания за BrdU и NeuN, търсейки BrdUTNeuNT клетки с размер и морфология, сходни със съседни, ембрионално образувани, BrdU7NeuN+ неврони. Такива клетки бяха открити в неокортекс (Фиг. 4.20) и стриатум (Фиг. 4.21) на постисхемичните групи с дълго преживяване (Таблица 4.5). НФиг Двойно позитивна NeuN/BrdU клетка (в рамка) във фронтачен неокортекс на ден 23 след исхемия. Клетката се намира на границата на слоеве 11 и III на неокортекса. Мащабна скача = 20 рт. ЙуNeuN Слят шbrdu ВП I X 28

31 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк Фиг Двог позитивна NeuN/Br клетка в латера путамен на ден след исхемия. Съса BrdU~ неврон показан със стрелкс Като абсолютен брой, от 1200 изследвани BrdU+ клетки в кора и стриатум на маймуни от дългосрочната група след BrdU, 15 бяха NeuN/BrdU двойно-позитивни: 8 от 600 в неокортекс (2/200 на ден 23, 3/200 на ден 44, 3/200 на ден 79), и 7 от 600 в стриатум (2/200 на ден 23, 3/200 ден 44, 2/200 на ден 79). Двойните NeuN/BrdU оцветявания бяха подкрепени с трети маркер(и). Това са маркери за комитирани невронални прогенитори и постмитотични неврони в стриатум и неокортекс. За стриатум, изследвахме транскрипционният фактор Islet 1, а за неокортекс - транскрипционният фактор Tbrl. В допълнение на 1200 BrdU+ клетки, изследвани за NeuN/BrdU ко-локализация както вече бе обяснено, ние изследвахме още 300 BrdU+ клетки в неокортекс (по 100 за всяка от постисхемичните групи, евтаназирани на дни 23, 44 и 79), тройно оцветени за Tbrl /NeuN/BrdU, и други 300 BrdU+ клетки в стриатум, тройно оцветени за Islet 1/NeuN/BrdU. Внимателно обследване на триизмерни конфокални реконструкции на тройно оцветени срези доказа, че BrdU+/NeuN+ клетки са позитивни и за Tbrl (неокортекс), и Isletl (стриатум) (Фиг. 4.22). Фиг Тройно имунофлуоресцентно Tbrl /NeuN/BrdU оцветяване в неокортекс на ден 44 след исхемия. Тройно имунофлуоресцентно Isletl/NeuN/BrdU оцветяване в putamen на ден 44 след исхемия. Налице е ко-локализация на трите сигнала, потвърдена от триизмерни ортогоначни проекции в оси х/у. 29

32 Тройни оцветявания за NeuN/BrdU с GABA-ергичния маркер GAD демонстрираха, че новите неврони са вероятно интерневрони (Фиг. 4.23). П П GAD67 Н NeuN ^ ^ Н в г с Ш Фиг Тройно имунофлуоресцентно GAD/NeuN/BrdU оцветяване в putamen показва тройно позитивна клетка (в рамка) на ден 44 след исхемия. Налице е колокализация на трите сигнала, потвърдена от триизмерни ортогонални проекции в оси х/у. Тъй като инкорпориране на BrdU в неврони може да се осъществи непосредствено преди невроналната апоптоза, ние комбинирахме BrdU/TUNEL двойно оцветяване с имунохистохимия за NeuN. NeuN+/BrdU+ клетки, позитивни за TUNEL, не бяха открити (Фиг. 4.24). Фиг Тройно оцветяване NeuN/BrdU/TUNEL в неокортекс на постисхемичен ден 23. NeuN' /BrdU* клетка и NeuN* /TUNEL клетка са различни клетки. Мащабна скала = 50 рт Исхемия и прогениторни клетки в RMS и bulbus olfactorius Предният миграционен поток (RMS) е прекурсорен път на тангенциална миграция от субепендимната зона около предния рог на латералния вентрикул до bulbus olfactorius, след пристигането си в който прогениторните клетки се диференцират в грануларни или перигломеруларни неврони. Глобалната мозъчна исхемия не промени пролиферативната активност на прогениторните клетки, които се намират в tractus olfactorius и в бялото вещество в сърцевината на bulbus olfactoius - част от RMS - при субектите от краткосрочна група след BrdU. В дългосрочната група, обаче, количеството на пролифериращите клетки в RMS, отбеляза увеличение на ден 23 след исхемия, спрямо съответни контролни субекти: ± 25.1 спрямо 54.1 ± 9.3 BrdU+ клетки/mm2; Р < 30

33 0.05, Г-тест. Тъй като всички BrdU4 клетки в RMS бяха позитивни за (3111- tubulin, ние изследвахме възможността BrdU7(3III-tubulin+ клетки да бъдат пренасочвани към постисхемичен кортекс или стриатум, подобно на описания процес на пренасочване след исхемия при гризачи. За тази цел, ние наблюдавахме срези, оцветени за (ЗШ-tubulin, самостоятелно или в комбинация с BrdU, търсейки наличие на позитивни клетки, мигриращи към неокортекс или стриатум. Такива бяха в открити нормален постнатален мозък, но не и при възрастни индивиди, дори след исхемия (Фиг. 4.25). Фиг Оцветяване за pill-tubulin в постнатален (ден 14 след раждане) и възрастен след исхемия (ден 23) мозък на маймуна. В постнаталния мозък се виждат клетъчни агрегати в субкортикалното бяю вещество, един от които е увеличен в рамка и съдържа BrdU* клетка (глави на стрелки, pill-tubulin - зелен канал. BrdU - червен канал). Във възрастния мозък, субкортикални агрегати не се наблюдават. Sir., striatum; F. фронтален кортекс; WM. бяло мозъчно вещество. Мащабна скала = 400 рт Липсата на пренасочване на прогенитори извън RMS бе в съзвучие с данни, доказващи увеличено количество BrdU+ клетки в паренхима на bulbus olfactorius след исхемия, в сравнение със съответни контроли (59.5 ± 8.8 спрямо 33.1 ± 2.4 BrdU+ клетки/мм:; Р < 0.05, Г-тест). Фенотипен анализ на BrdU клетки показа данни за наличие на de novo генерирани неврони в грануларен или гломеруларен слой на булбуса (20% от BrdU' клетки на ден 44), без статистически значими различия между исхемични и контролни субекти. 31

34 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк 4.7. Исхемия и прогениторни клетки в SVZ около преден рог на латерален вентрикул SVZ около преден рог на латерален вентрикул ще бъде означавана от нас като SVZa, за разлика от SVZ около долен рог на латерален вентрикул, означена с SVZi. Пролифериращите клетки и техният фенотип в SVZa бяха изследвани в 5 локализации в рамките на SVZa (Фиг. 3.3). Исхемията доведе до увеличение на BrdU+ клетки в дорзална, стриатална, вентрална и предна, но не и в септална SVZa, в краткосрочната група (Фиг. 4.26, 4.27). Фиг BrdU имунопозитивни клетки в SVZa. краткосрочна група субекти. Исхемичните субекти са ден 9 след пезия. Мащабна скала = 50 рт. Посоки: D, дорзална, V. вентрална: М, медиална: L. латерална. Фиг Статистически анализ на BrdU имунооцветявания в петте аспекта на SVZa. в краткосрочна група субекти. *. Р<0.05 спрямо контроли: D. ден след интервенция. В дългосрочната група субекти, постисхемичните маймуни също съдържаха значително по-големи количества BrdU* клетки в сравнение с респективни контроли, в дорзална, стриатална и предна SVZa (Фиг. 4.28). Във вентрална SVZa, BrdU* клетки отбелязаха рязка редукция в своето количество, както при исхемични, така и при контролни маймуни от дългосрочна група. 32

35 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк Д ортлив SVZa _ контрола D23 D44 Стриатална SVZa D23 D44 D79 Прел на SVZa -о- контрола D23 D44 D79 Фиг BrdU имунопозитивни клетки в SVZa, дългосрочна група субекти. Исхемичните субекти са ден 23 (Г) и ден 44 (Б, Д) след лезия. (А, В) Контроли, ден 44 след мнима иехемия. BrdlT клетчни агрегати са показани с увеличение. Мащабна скала = 50 рт. Посоки: D. дорзална: V, вентрална: М, медиална: L, латерапна. Е, Статистически анализ на BrdU* клетки: *. Р<0.05, ***. Р<0.001 спрямо контроли. Сравняване на данните относно гъстотата на BrdU клетки на постисхемичен ден 9 разкри, че най-високи са стойностите във вентрална SVZa (125 клетки/рамка), следвана от предна SVZa (75 клетки/рамка), докато в стриатална и дорзална SVZa тази гъстота бе от порядъка на 50 клетки/рамка. Ние също така направихме оценка на пропорцията BrdU+ клетки, поели багрилото рано след иехемия и запазващи своята локализация в SVZa 5 седмици по-късно (ден 44 след хирургия), в контролни и иехемични субекти. Анализът показа сигнификантно завишени пропорции задържани клетки в постисхемична дорзална, стриатална и предна SVZa (около 50% от BrdU+ клетки), но не и във вентрална SVZa. Подобно други мозъчни региони, ние потвърдихме ко-локализация на BrdU с независими пролиферативни маркери, Ki67 и phis. Рано след иехемия, на ден 9, преобладаващото мнозинство BrdU+клетки в SVZa бяха позитивни за Ki67, докато в дългосрочната група след ко-локализация между BrdU и Ki67 бе рядка. Статистически анализ на процента BrdU+ клетки, двойно позитивни за Ki67 в SVZa, доказа сигнификантна редукция на пропорцията двойно оцветени клетки в дългосрочна група след BrdU (Фиг. 4.29). 33

36 Фиг Статистически анализ на процента B r d lf клетки, позитивни за Ki67, на ден 9 и ден 44 след исхемия, в SVZa. *, Р<0.05. D9 D44 Фенотипният анализ на BrdU+ клетки, демонстрира, че в краткосрочната група след BrdU преобладаващото мнозинство от тях бяха Musashil+ (Фиг. 4.30, Таблица 4.6). В дългосрочната група, мнозинството BrdU+ клетки бяха позитивни за невронални маркери, като pill-tubulin (Фиг. 4.31, Таблица 4.6). Ден 9 Ден 23 Ден 44 Ден 79 Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Контрола Исхемия Musashil 75 ± ± ± 5 11 ±5 12 ± 5 12 ± 6 10 ±5 pill-tubulin 8 ± 3 10± 5 71 ±21 69 ±20 73 ± ±22 80 ±21 Ibal 2 ± 1 4± 1* 2 ± 1 5 ±2* 4 ± 2 6 ± 3 5 ± 3 Таблица 4.6. Проценти на BrdU* клетки в SVZa (осреднени за дорзална, стриатална, вентрална и предна SVZa), двойно-позитивни за клетъчно селективни маркери, на различни времеви интервали след исхемия. *. Р<0.05 спрямо съответни контроли. Фиг Тройно имунофлуоресцентно оцветяване за BrdU/Musashi 1 /Nestin в стриатална SVZa на ден 9 след исхемия. Видни е тройно позитивен агрегат. Мащабна скала = 10 рт. Тъй като открихме, че BrdU+ клетки в SVZa задържаха локализацията си в тази прогениторна ниша, и част от тях са Ki67+, ние изследвахме дали задържаните BrdU7Ki67* клетки са с фенотип на неврални (Musashil+) или невронални (pill-tubulin+) прогенитори. Тройни Musashil/pi II-tubulin/Ki67 оцветявания в дългосрочна група маймуни показаха, че задържаните в SVZa BrdU+/Ki67+ клетки с Musashil \ но не и с pill-tubulin+ фенотип (Фиг. 4.32). 34

37 Фиг Двойно имунофлуоресцентно оцветяване за BrdU/pill-tubulin във вентрална SVZa на ден 44 след исхемия. Почти всички BrdU* клетки са позитивни и за /3111-tubulin (стрелки). Мащабна скала = 20 рт. Фиг Тройно оцветяване за (3lll-tubulin/Ki67/Musashil (M sil) в стриатална SVZa на ден 44 след исхемия. Двойно позитивна Ki67/Musashil клетка е показана с глава на стрелка, a pill-tubulin /Ki6 Т клетка е показана със стрелка. Мащабна скала = 10 рт. Звезда, лумен на предния вентрикул Експресия на транскрипиионни фактори в SVZa прогенитори След представянето на данни за възможни механизми на регулация на SGZ прогенитори, ще разгледаме вероятни фактори, регулиращи прогениторни клетки в SVZa. Те могат да бъдат класифицирани като външни (секреторни, напр. растежни фактори) или вътрешни (транскрипиионни фактори) за прогениторните клетки. Алгоритъмът, по който ние проследихме експресия на транскрипиионни фактори в SVZa 35

38 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк прогенитори, включваше характеризирането на прогениторите чрез фенотипизирането им посредством наличие на комбинирана експресия на (/') BrdU/Ki67 от една страна, и (н) pill-tubulin или Musashil, от друга страна (Фиг. 4.33). Хирургия Пролиферативни маркери Прогениторни маркери Неврални M usashil Невронални 0tll-tubulin Транскрипционни фактори Специфични за ранни ембрионални прогенитори Рах6, Етх2, Sox Специфични за регионално- и клетъчно-рестриктираии прогенитори Ngn, Dlx, Olig Фиг Схематично представяне на алгоритъма на изследване на експресията на транскрипционни фактори в SVZa прогенитори. Инфузията на BrdU меж ду дни 5 и 9 е представена със сива ивица, и спрямо нея групите маймуни се разграничават като краткосрочна и дългосрочна групи (дни 23 и 44 не са показани за по-голяма простота) Тъй като Ki67 оцветява пролифериращите клетки към момента на перфузия на мозъка, в краткосрочната група Ki67 и BrdU показват висок процент ко-локализация. докато в дългосрочната група процентът на ко-локализация е нисък. В краткосрочната група BrdU* клетки са предимно M usashil, докато в дългосрочната са предимно /ЗШ-tubulin Всеки от така получаващите се прогениторни фенотипове бе изследван за експресия на транскрипционни фактори: (i) характерни за ранни прекурсори/стволови клетки или (И) характерни за по-ограничени в потенциала си за клетъчна продукция прекурсори. Двойни оцветявания за BrdU и маркери за ранни прогенитори/стволови клетки (Рахб, Етх2 и Sox 1-3) показа експресия на тези транскрипционни фактори от агрегирани BrdU+ прекурсори в SVZa (Фиг. 4.34). 36

39 Фиг Двойно оцветяване за Emx2/BrdU в стриатална SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивен агрегат е демонстриран чрез ортогонални проекции в осите х/у (вдясно/отгоре на оста z). Мащабна скала = 20 /ат. Звезда, лумен на предния вентрикул. Оцветяването е представително и за Рахб. Около 80% от BrdU+ клетки в краткосрочната група и около 50% от BrdU+ клетки в дългосрочната група бяха позитивни за Рахб и Етх2, без значими различия между контролни и исхемични субекти, както и между процентите на Рахб и Етх2 (Фиг. 4.35). Абсолютният брой Pax6+/BrdU+ и Emx2+/BrdU+ клетки, обаче, отбеляза значимо увеличение след исхемия, както в краткосрочна, така и в дългосрочна група след BrdU (Фиг. 4.35). Процент ко-локалнзацня Брой клетки Рахб/BrdU Emx2/BrdU Рахб/BrdU Emx2/BrdU Фиг Пропорции двойно оцветени за Рахб/BrdU и Emx2/BrdU клетки в SVZa. в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. Липсват статистически значими различия между контролни и исхемични субекти. Абсолютен брой двойно оцветени за Рахб/BrdU и Emx2/BrdU клетки в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. *. Р<0.05 спрямо съответни контроли. Оцветявания за Soxl-З и BrdU в краткосрочната група показаха резултати, сходни с тези за Рахб и Ешх2, но в дългосрочна група процентът ко- локализация на Sox2 и Sox3 с BrdU бе значително редуциран (Фиг. 4.36). 37

40 38 Процент ко-локали>ация Брой клетки Soxl/BrdU Sox2/BrdU Sox3/BrdU Sox1/BrdU Sox2/BrdU Sox3/BrdU liiii illaii lln -iili Уь. iili Фиг. 4.J6 Пропорции двойно оцветени за Soxl/BrdU, Sox2/BrdU и Sox3/BrdU клетки в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. Липсват статистически значими различия меж ду контролни и иехемични субекти. Наблюдава се намаление на процента двойно оцветени Sox2/BrdU и Sox3/BrdU в дългосрочна група след BrdU, докато този процент при Soxl/BrdU клетки остава без сигнификантна промяна. Абсолютен брой двойно оцветени за Soxl/BrdU, Sox2/BrdU и Sox3/BrdU клетки в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. *. Р<0.05 спрямо съответни контроли. Изчисления на абсолютния брой Soxl7BrdU+, Sox2+/BrdU+ и Sox3+/BrdLT клетки, показа статистически значимо увеличение на тези клетки след иехемия (Фиг. 4.36). Факторите Рахб, Emx2, Sox2 и Sox3 бяха позитивни в неврални (Musashil+) прогенитори (Фиг. 4.37, 4.39), докато Soxl - в невронални прекурсори (Фиг. 4.38, 4.39). Sox3/Musashil (Msil в стриатална SVZt Фиг Двойт оцветяване зс на ден 9 ела иехемия. Звезда лумен на предни> вентрикул. Микро графията е пред ставителна и з< Рахб, Етх2 и Sox2. Фиг Двойно о 11ветяване за Sox 1'(31II-tubulin в SVZa на ден 44 след иехемия. Soxl и (3111-lubulin се локализират едни и същи клетки (c.npzrya). Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скача = 10 рт.

41 39 Soxl* Фиг Фенотип (в %) на Шклетки, позитивни за Sox2,3, Рахб и Етх2 от една страна, и Soxl от друга, в SVZa. За разлика от фенотипа на клетките, позитивни за Рахб, D9 D23 D44 D79 Етх2, Sox2 и Sox3, при Soxl е налице ко-локапизация изклю- Hpu-tubuiin чително с /ЗШ-tubulin. MueashM Поради наличието на, макар и не много, BrdU+ клетки, съдържащи Рахб, Emx2, Sox2 и Sox3 в дългосрочната група на преживяемост, ние изследвахме тяхната експресията в задържаните в SVZa BrdU+/Ki67+ клетки чрез тройни имунофлуоресцентни оцветявания (Фиг. 4.40). Фиг Тройно Pax6/BrdU/Ki67 оцветял в SVZa на постисхемиче ден 79. Рахб /B r d lf /Ki6 клетки, стрелки; Рахб~/B r d lf 7Ki67* клет глави на стрепки. Maufat скала = 20 рт. Звезда, лумен на предния eeumpi кул. Микрографията е представителна и за Ет и Sox 2,3. В съответствие с експресията им в задържани BrdU+/Ki67+ клетки, Рахб, Emx2, Sox2/3 бяха позитивни и в задържани в SVZa BrdU+/Musashil + клетки. В същото време, BrdU+/Ki67+ клетки в SVZa на дългосрочна група маймуни останаха негативни за Soxl, което съответства на колокализацията между Soxl и (3111-tubulin (Фиг. 4.38) и липсата на колокализация между (ЗШ-tubulin и BrdU/Ki67 (Фиг. 4.32). Дорзалните теленцефални маркери Ngnl и Ngn2 също се експресираха в SVZa, но докато Ngnl+/BrdU+ клетки бяха честа находка (60-70% на ден 9, 35-40% на ден 44), Ngn2+/BrdlT клетки почти не се срещаха (Фиг ). '

42 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк Фиг Двойно оцветяване за Ngnl/BrdU в SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивен агрегат е представен с триизмерни реконструкции. Двойно оцветяване за Ngn2/BrdU в SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивна Ngn2/BrdU клетка (стрелка) е рядка находка. Вижда се и Ngn2 /B rdlt клетка (глава на стрелка). Мащабна скала = 10 рт. Процент ко-локалитация % Ngn1/BrdU о/о Ngn2/BrdU Брой клетки Ngn1/BrdU Ngn2/BrdU лен 9 лен 44 лен 9 ден 44 лен 9 ден 44 ден 9 ден 44 Контрола Контрола Исхемия Исхемия Фиг Пропорции двойно оцветени за Ngnl/BrdU и Ngn2/BrdU клетки в SVZa. в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. Абсолютен брой двойно оцветени за Ngnl/BrdU и Ngn2/BrdU клетки в SVZa. в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. *. Р<0.05 спрямо съответни контроли. Факторът на транскрипция Ngn3, трети член на Ngn фамилията, не показа експресия в SVZa. Ngnl и Musashil демонстрираха висок процент коекспресия (Фиг. 4.43), докато по-малка част от N gnl+ клетки показаха коекспресия с pill-tubulin, но този процент се увеличаваше с удължаване на преживяемостта (Фиг. 4.44). Фиг Двойно оцветяване за N gnl и Musashil (M sil) в на ден 9 след исхемия. Мащабна скача = 20 /.on. Звезда, лумен на предния вентрикул. 40

43 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк 09 D D Други I 0111-tubulin Musashil Фиг Фенотип на клетки, позитивни за Ngnl и Ngnl в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. Липсват статистически значими различия меж ду контролни и исхемични субекти. За разлика от Ngnl, значително по-малка част от Ngn2+ клетки проявяваха ко-локализация с Musashil и само единични Ngn2+ клетки експресираха (3111-tubulin, докато мнозинството Ngn2+ клетки не бяха нито с MusashiT, нито с pill-tubulin+ фенотип (Фиг. 4.44). Двойни оцветявания за Ngnl и Ki67 в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU демонстрираха, че NgnU клетки са Ki67+ в SVZa на ден 9, но не и на ден 44. Вентралните теленцефални маркери Dlx 1,2,5, които се експресират преференциално в стриатални ембрионални прогенитори, също бяха открити в SVZa на изследвани маймуни. Двойни оцветявания с BrdU в SVZa разкриха контрастиращи резултати. Dlxl+/BrdU+ и Dlx57BrdU+ клетки бяха честа находка (Фиг. 4.45, 4.46), докато Dlx2+/BrdU+ клетки почти не се срещаха (< 2% от BrdU+клетки). Фиг Двойно имунофлуоресцентно оцветяване за Dlx!/BrdU в SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивен DIxl/BrdU агрегат (стрелки) е представен с триизмерни реконструкции. Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скача = 20 рт. 41

44 Процент ко-локализаиия D lx1/b rdll Dlx5/BrdU Dlx1/BrdU Брой клетки DIxS/BrdU лен 9 ден 44 лен 9 ден 44 Контрола Контрола И осм ия "М а е м и я Фиг Пропорции двойно оцветени за D lxl/brdu и DIxS/BrdU клетки в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. Липсват статистически значими различия меж ду контролни и исхемични субекти. Абсолютен брой (клетки/рамка на броене) двойно оцветени за D lxl/brdu и D lx5/brdu клетки в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. *, Р<0.05 спрямо съответни контроли. Преобладаващият процент Dlxl + и Dlx5+клетки проявяваха ко-локализация с Musashil (Фиг. 4.47), като процентът им прогресивно намаляваше с удължаването на преживяемостта след BrdU (Фиг. 4.49). Успоредно с това, нарастваше процентът на DlxlVpiII-tubulirf и Dlx5+/pill-tubulin+ клетки (Фиг. 4.48). Фиг Двойно оцветяване за D lxl/m usashil (M sil) в стриатална SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивни клетки са показани със стрелка. Мащабна скала = 10 рт. Фиг Тройно оцветяване за DlxS/BrdU/(Miltub ul in в стриатазна SVZa на ден 44 след исхемия. Мащабна скала = 20 рт. Звезда, лумен на предния вентрикул. Клетки, които са Dlx2+/Musashil+, бяха наблюдавани рядко, а Dlx2+/pill-tubulin+ или Dlx2+/Doublecortin+ клетки не бяха наблюдавани. Така, огромното мнозинство Dlx2* клетки бяха с неустановен фенотип. Коекспресия на Ki67 и Dlxl,2,5 не бе наблюдавана на дългосрочните времеви интервали. 42

45 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк D h l* Друга Щ p ill-tub ulin Dl*5* D9 D D79 Фиг Фечотип на клетки, позитивни за D lxl и Dlx5 в SVZa. Липсват статистически значими различия меж ду контролни и исхемични субекти. Musashil Друга фамилия вентрални теленцефални маркери, Olig 1,2,3, също се експресираше в SVZa. Ко-локализация на Olig 1 и 0lig3 с BrdU бе честа в краткосрочната група на преживяемост (Фиг. 4.50), но рядка в дългосрочната група (Фиг. 4.51). Фиг Двойно позитивен O ligl/b rdil агрегат на ден 9 след исхемия е представен в увеличение и с триизмерни реконструкции. Микрографията е представителна и за Olig3. Мащабна скача = 10 рт. Процент ко-локалнзация Брой клетки % O ligl/brdil Olig3/BrdU Olig1/BrdU Olig3/BrdU ден 9 ден 44 ден 9 ден 44 о ден 9 Контрола Фиг Пропорции двойно оцветени за O ligl/brdu и Olig3/BrdU клетки в SVZa. в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. Липсват статистически значими различия между контролни и исхемични субекти. Абсолютен брой двойно оцветени за O ligl/brdu и Olig3/BrdU клетки в SVZa, в краткосрочна и дългосрочна групи след BrdU. *. Р<0.05 спрямо съответни контроли. За разлика от Oligl/З, транскрипционният фактор Olig2 рядко се експресираше от BrdU+ клетки (под 1% от BrdU* клетки), както в краткосрочна, така и в дългосрочна група след BrdU. Двойни оцветявания с фенотипни маркери разкриха ко-локализация с Musashil за Oligl и в по- 43

46 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк малка степен, Olig3 (Фиг. 4.52). Двойни оцветявания е pill-tubulin показаха ко-локапизация с Olig3, но не е Oligl или 01ig2 (Фиг. 4.53). Фиг Двойно оцветяване за O ligl и Musashil (M sil) в SVZa на ден 9 след исхемия. Мащабна скала = 10 рт Звезда, лумен на предния вентрикул. Фиг Двойно оцветяване за Olig3/piHlubulin в SVZa на ден 79 след исхемия. Видим е двойно позитивен агрегат. Транскрипционните фактори Oligl и 01ig3 се локализираха в Ю67* клетки на ден 9, докато на дългосрочни времеви интервали ко-локапизация с Ki67* бе наблюдавана само при Oligl. Почти всички 01ig2+ клетки останаха с неидентифициран фенотип Експресия на секретоуни фактори и техни реиептори в SVZa прогенитори Освен вътрешни за клетките регулиращи фактори, като транскрипционните, ние проследихме и експресията на външни (секреторни) фактори и техни рецептори в герминативната зона SVZa. Обща характеристика за повечето от тях, е участието им в процеса на ангиогенеза. В последните години бяха публикувани данни, подкрепящи взаимовръзка между процесите на неврогенеза и ангиогенеза. Нервни и съдови клетки не само реципрочно повлияват растежа си по паракринни механизми, но също така използват общи сигнали, например nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), и vascular endothelial growth factor (VEGF). В настоящата секция, ние ще представим данни за експресията, на протеиново ниво, на ангиогенни и/или невротрофни 44

47 сигнални молекули и техните рецептори в прогениторната ниша SVZa, като по този начин предлагаме структурни данни за наличие на възможни взаимодействия лиганд/рецептор между клетъчните конституенти на тази герминативна зона. Първи от списъка със сигнални молекули, изследвахме VEGF и неговите рецептори ffns-like tyrosine kinase-1 (Fltl), fetal liver kinase-1 (Flkl) и neuropilin-1 (Nrpl). Оцветяване за Fltl в SVZa разкри наличие на силен позитивен сигнал в дорзален, стриатален и вентрален аспекти на SVZa, но внимателно обследване на двойни Fltl/BrdU оцветявания демонстрира наличие на двойно-позитивни клетки в стриатапна и вентрална SVZa, докато в дорзапна SVZa такива клетки почти не се наблюдаваха (Фиг. 4.54). Фиг Двойно имунофлуо-ресцентно оцветяване за F ltl/brdu в стриатална SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивен агрегат, показан със стрелки, е представен в увеличение и с триизмерни реконструкции в дясната част на микрографията. Мащабна скала = 20 рт. BrdU+ клетки в рамките от Fltl+/BrdU+ агрегати изявяваха морфологични белези на скоро протекли митози и в съзвучие с тези резултати бе доказано, че абсолютният брой Fltl+/BrdU+ клетки в SVZa се е увеличил на ден 9 след исхемия спрямо контроли (Фиг. 4.55), което също е белег, че тези клетки пролиферират след увредата. Фиг Брой Fill /BrdU клетки в SVZa, в контролна и исхемична (ден 9) групи. **, Р<0.01. За разлика от Fltl, експресията в SVZa на други два рецептора на VEGF, отговорни за неговото действие в ЦНС Flkl и Nrpl бе ограничена до съдовата стена (Фиг. 4.56). 45

48 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк Фиг Оцветявания за Flkl и N rpl в SVZa на ден 9 след исхемия. Експресията и на двата рецептора е ограничена до съдовата стена. Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скала = 50 рт. Много от Fit 1+ клетки експресираха S100P и прогениторният маркер Nestin (Фиг. 4.57), докато с невроналния маркер pill-tubulin ко-локализация бе рядко демонстрирана (Фиг. 4.58). Фиг Двойно оцветяване за Fill и Nestin в SVZa на ден 9 след исхемия. (А) Панорамен изглед. (Б) Увеличен образ на рамкираното поле от (А). Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна сказа = 50 рт. Фснотип на F ill* клетки S10OP Nestin pill-tub. Фиг Пропорция (в %) на F ltl' клетки, експресиращи S /ООД. Nestin. и ДШ-tubulin спрямо всички Fltl клетки в SVZa. Няма сигнификантни различия меж ду контролни и иехемични субекти. **, Р<0.01 спрямо Fltl*/ДШ-tubulin* клетки. Двойни оцветявания за Fltl неговият лиганд VEGF демонстрираха, че значителна част от VEGF клетки експресираха Fltl (Фиг. 4.60). VEGF бе локализиран в S 100р клетки, но не и в pill-tubulin* клетки (Фиг. 4.59, 4.60). 46

49 Ендогенни прогениторни клетки в приматен мотьк Фиг Тройно оцветяване за VEGF, SlOOp и pill-tubulin в SVZa на ден 9 след исхемия. (А) Панорамен изглед. (Б) Увеличен образ на рамкираното поле от (А) с разделяне на каналите. Имунореактивността за VEGF ко-локализира с тази за S100P. но не и с pill-tubulin. Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скала = 10 рт. VEGF бе позитивен в BrdU+ клетки предимно във вентрална SVZa (Фиг. 4.60). Фенотпп на VEGF* клетки Фиг Пропорция (в %) на VEGF* клетки, експресиращи SlOOp, Fill и BrdU спрямо всички VEGF* клетки в SVZa. Няма сигнификантни различия меж ду контролни и исх&иични субекти. **, Р<0.01 спрямо VEGF*/BrdU* клетки. Имунохистохимично оцветяване за хемопоетичния рецептор Kit показа множество субепендимни клетки в SVZa, организирани в агрегати или като еденични клетки, които, обаче, бяха различни от субепендимните прогениторни клетъчни агрегати. Kit демонстрира ко-локализация преди всичко с S100P (Фиг. 4.61), в по-малка степен с BrdU (Фиг. 4.62) и Fltl (Фиг. 4.63), но не с pill-tubulin. Фиг Оцветяване за Kit и S100Р в SVZa на ден 23 след исхемия. Двойно-позитивни клетки са посочени със стрелки. K it'/s 100p - с глава на стрелка. Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скала = 20 рт 47

50 Фиг Оцветяване за Kit (зелен канал) и BrdU (червен канал) в SVZa на ден 9 след исхемия. Двойно позитивна клетка е посочена със стрелка и представена с триизмерни ортогонални проекции. Мащабна скала = 5 рт Фенотип па Kit* клетки J_ ГИ S100 ) FK1 BrdU Фиг Пропорция (в %) на Kit" кчетки, експресиращи SlOOp, Fill и BrdU спрямо всички Kit клетки в SVZa. Няма сигнификантни различия меж ду контролни и исхемични субекти. ***. Р<0.001 спрямо K it*/fltl* и KiF /BrdlT клетки. Измежду невротрофините, първи изследвахме NGF. NGF бе експресиран в S100(3+ клетки (Фиг. 4.64), а двойни оцветявания с VEGF също демонстрираха ко-локализация (Фиг. 4.65), за разлика от двойни оцветявания с BrdU. Фиг (А) Двойно оцветяване за NGF (зелен канап) и SlOOp (червен канап) в SVZa. (Б) Регионът в рамка от (А) е представен с разделяне на канапите. Двойно позитивна клетка (стрелки). Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скала = 10 рт. Данните за експресията и фенотипната изява на BDNF в SVZa бяха напрактика идентични с тези за NGF (Фиг. 4.65). 48

51 NCF BDNF Фиг Фенотип (в %) на NGF и BDNF клетки. Няма сигнификантни различия меж ду контролни и исхемични субекти. **. Р<0.01 спрямо останалите маркери. Високоафинитетните рецептори на NGF и BDNF, респективно TrkA и TrkB, показаха сходна картина по отношение ко-локализация с S100P и VEGF. В същото време, TrkA и TrkB се представиха с различия по отношение експресията им в клетки, позитивни за BrdU или pill-tubulin. TrkB бе експресиран от BrdlT агрегати, но не от pill-tubulin+ клетки (Фиг. 4.66А, 4.67). Обратно, TrkA прояви ко-локализация pill-tubulin, но не с BrdU (Фиг. 4.66Б, 4.67). Общият рецептор за невротрофини p75ntr (75 kd pan-neurotrophic receptor) бе локализан единствено в съдовата стена. Фиг (А) Двойно оцветяване за TrkB (зелен канал) и BrdU (червен канал) в SVZa на ден 9. (Б) Двойно оцветяване за TrkA (зелен канал) и pill-tubulin (червен канал) в SVZa на ден 44 след исхемия. Мащабна скала = 5 рт (А), 10 рт (Б). TrkA TrkB Фиг Фенотип (в %) на TrkA+ и TrkB* клетки. Няма сигнификантни различия меж ду контролни и исхемични субекти. **. Р<0.01 спрямо останалите маркери. Сигналните системи на други два невротрофни фактора, neurotrophin (NT)-3 и glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), споделяха сходни характеристики на експресия в SVZa. NT3 и неговият високоафинитетен рецептор - ТгкС - бяха силно позитивни в епендимните клетки, като NT3 бе позитивен и в S100p+ субепендимни клетки (Фиг. 4.68). NT3 и ТгкС бяха локализирани в клетки, позитивни за VEGF, но не и за BrdU. 44

52 50 Фиг (А) Двойно оцветяване за TrkC и NT3 в SVZa на ден 9 след исхемия. Налице е силна двойна позитивност в епендимния слой. а субепендимна двойно позитивна клетка (стрелка) е увеличена в рамка (червен канап, долен десен ъгъл). (Б) Двойно оцветяване за SIOOp (зелен канал) и NT3 (червен канал) в SVZa на ден 9 след исхемия. Субепендимни двойно позитивни клетки са показани със стр&пки. Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скала = 20 рт. GDNF и неговият високоафинитетен рецептор GFRal (GDNF family receptor a l) бяха разпределени на съседни клетки в SVZa, като GDNF бе преференциално експресиран от епендимните клетки, докато GFRal - в субепендимната зона (Фиг. 4.69А). Клетки, включително периваскуларни такива, които бяха позитивни за GFRal, експресираха S100P и VEGF (Фиг. 4.69Б; стрелки). Фиг (А) Двойно оцветяване за GFRal и GDNF в SVZa на ден 9 след исхемия. GDNF имунореактивност (глави на стрелки) е предимно в епендимния слой. докато тази за GFRal - в субепендимния (стрепки). Виждат се и двойно оцветени кръвоносни съдове. (Б) Тройно оцветяване за GFRal (зелен канап), VEGF (червен канап) и SIOOp (син канап) в SVZa. Субепендимна и перивасуларна двойно позитивни клетки са показани със стрелки. Звезда, лумен на предния вентрикул Мащабна скапа = 20 рт. Ret (Rearranged during transfection), трансмембранният тирозинкиназен рецептор на GDNF, който взаимодейства с GFRal при сигналната трансдукция на GDNF, не бе експресиран в SVZa (Фиг. 4.70). Липса на имунопозитивност бе открита и при осъществяване на негативни контролни оцветявания, при които бе пропуснато първично антитяло (т.е. бе приложено само вторично), или първичните антитела бяха пре-адсорбирани с 10-кратно по-висока концентрация на пептида, послужил за генерирането на антитялото.

53 Фиг Оцветяване за Ret в SVZa. Липсва позитивен сигнал. Звезда, лумен на предния вентрикул. Мащабна скала = 50 рт. 5. Обсъждане Настоящето изследване предоставя първите детайлни данни за количеството и дългосрочната съдба на прогениторни клетки в няколко зони на краен мозък на възрастни примати след мозъчна иехемия. Ние също така представяме данни за възможни молекулярни механизми, участващи в прогениторната регулация в постисхемичния приматен мозък. Нашите резултати показаха способността на прогениторите да преживяват дългосрочно след иехемия и да генерират неврони в грануларния слой на gyrus dentatus. В същото време, прогениторите в SVZi и прилежащия СА1 сектор не показаха способност за невронална продукция, подсказвайки наличието на интрахипокампални различия в контрола на прекурсорната пролиферация и диференциация. Ние изследвахме прекурсорната биология и в нови, неизследвани досега зони на мозъка, след иехемия при примати: SVZa, фронтален неокортекс, стриатум. Резултатите ни показват, че SVZa е зоната с най-голяма концентрация на прогенитори във възрастния мозък. Ние забелязахме различия както във фенотипа, така и в молекулярния контрол на прогениторните клетки при маймуните, в сравнение с предишни сходни изследвания при гризачи. Възможно е внимателно изучаване и анализиране на подобни различия да има положителен ефект върху ефективността на бъдещите невро-заместващи терапии за човешки неврологични заболявания. Прогениторните клетки представляваха особен интерес за нас поради потенциала им за замяна на загинали мозъчни клетки. Ние доказахме, че иехемия увеличава количество на de novo генерирани клетки, включително прогенитори, в регионите на интерес (Фиг. 5.1). 51

54 Фиг Схематично представяне на разпределението и гъстотата на B rd lf клетки в контролен и исхемичен темпорален и фронтален дял. Невронален фенотип включва в себе си невронални прогенитори и зрели неврони. За наименованията на регионите влс. Фиг В герминативните зони (SGZ и SVZ), много от BrdU" клетки бяха позитивни за маркерите Musashil nranestin, и същевременно негативни за астроцитните маркери GFAP или SlOOp. Така описаните BrdU7Musashil+/GFAP~ и BrdU7Nestin+/GFAP~ клетки най-вероятно представляват недиференнирани мозъчни (неврални) прогенитори в мозъка на възрастни маймуни. Макар процентът BrdlT клетки, позитивни за Musashil/Nestin, да не показа сигнификантни различия между контролни и исхемични субекти, по-големият абсолютен брой BrdU* клетки след исхемия определя и значимо постисхемично увеличение в количеството на прогениторните клетки. Наред с постисхемичното увеличение на прекурсорните клетки, един друг неописан досега феномен бе наблюдаван от нас в герминативните зони SGZ и SVZa - значителна пропорция от BrdU* клетки запазиха локализацията си в тези зони без да мигрират, както запазиха и белези за недиференциран фенотип, в дългосрочната група субекти. Тези задържани в герминативните зона BrdU+ клетки проявяваха белези за незрялост, типични за BrdlT клетки от краткосрочната група - формиране на агрегати и експресия на прогениторния маркер Musashil. Съществуването на такива клетки може да бъде обяснено с високата доза BrdU, която намалява възможността BrdU да се разреди под установимото чрез имунохистохимия ниво посредством клетъчно делене; със способност на стволови и/или прогениторни клетки в мозъка на маймуни да излизат и след това повторно да влизат в активен клетъчен цикъл; с липса на сигнали, индуциращи миграция и/или диференциация, или като алтернатива, на по-силно действие на сигнал, поддържащ недиференциран прогениторен фенотип. Това биха могли да бъдат външни сигнали от средата, заобикаляща прогениторите (напр. растежни фактори или невротрансмитери) или вътрешни за самите клетки сигнали като транскрипционни фактори. Тяхната идентификация вероятно би била в полза на по-успешното манипулиране на приматните SGZ прогенитори. 52

55 Данните за регулация на прогениторни клетки в приматен мозък, особено след патологичен процес като исхемия, са оскъдни. Ние представихме резултати за два тила сигнали - вътрешни за клетките (транскрипционни фактори) и външни такива (растежни фактори). Изследването върху факторите на транскрипция бе обусловено от доста обширните вече познания за тяхното участие в ембрионалната неврогенеза и от възможността поне част от механизмите, които я управляват, да участват в регулация на прогенитори и във възрастния мозък. Исхемията доведе до увеличаване на абсолютния брой прогенитори, експресиращи протеините Рахб, Emx2, Soxl-3, Ngnl, Dlxl,5, 01igl,3 и Nkx2.2 в SVZa на маймуни, в краткосрочната група (Фиг. 5.2А). В дългосрочната група, бе наблюдавана сегрегация на транскрипционните фактори в мозъчни (неврални) или невронални прогенитори (Фиг. 5.2Б), което подсказва, че е възможно специфични комбинации от транскрипционни фактори да дефинират специфичен прогениторен фенотип, подобно на ситуацията в развиващия се мозък. Нашите резултати подсказват възможни кандидати за подтискащи диференциацията фактори - такива са Рахб, Етх2 и Sox2,3, поради тяхната наличност в задържани BrdU+/Ki677Musashil+ прекурсори в SVZa на дългосрочна група субекти (Фиг. 5.2Б). А Краткосрочна група Б Дългосрочна група Мозъчно прогенитори BrdU*. К16Г, Msl1* Мозъчни прогенитори Hoeu BrdU* Ki67* Msi1* Задържани BrdU* KI67* Msi1* Невронални Прогенитори BrdU Ю6Г pill-tub* DCX* Рахб* Emx2* Sox1/2/3* Ngn1/2* Dlx1/2/6* Nkx2.2* Ollg1/3* Рахб* Emx2* Sox1/2/3* Ngn1/2* Dlx1/2/6* Nkx2.2* Olig1/3* Pax6*t Emx2* Sox2* Sox3* O lig l* Sox1* Ngn1* Dlx1/6* Nkx2.2 Olig2* Фиг Схематично резюме на експресията на транскрипционни фактори в SVZa прогенитори, при маймуни от краткосрочна (А) и дългосрочна (Б) групи на прео1сиеяемост. Задържаните прогенитори е активен клетъчен цикъл (K i6t) преференциално експресираха маркери за стеолови клетки (Етх2. Рахб, Sox2.3), докато задържаните прогенитори излезли от активен клетъчен цикъл (Ki67~) преференциално експресираха маркери за no-диференцирани ембрионални прогенитори (Soxl, Dlxl,5, Ngnl, Nkx2.2). 53

56 Молекулярните сигнали, предопределящи междувидови различия в неврогенезата са неизвестни към момента. Ние бихме искали да отбележим две важни разлики, които отбелягахме между нашите резултати и предишни данни при гризачи, по отношение на експресията на транскришшонни фактори от прогениторни клетки. Първо, Рахб бе съобщен с предимна локализация в невронални прогенитори в SVZa на гризачи, докато при маймуни Рахб бе позитивен най-вече в мозъчни (неврални) прогенитори. Второ, в SVZa на гризачи факторите Dlx2 и 01ig2 оцветяват междинни прекурсори, които са с висока пролиферативна активност, докато в нашите експерименти ние почти не отбелягахме наличие на BrdU7Dlx2T или BrdU+/01ig2+ клетки. Това показва, че SVZa нишата при възрастни маймуни или не съдържа интермедиерни прекурсори, или че тези клетки не експресират Dlx2 и 01ig2. Детайлно ултраструктурно характеризиране на клетъчната композиция на SVZa при маймуни по начина, направен вече при гризачи, е необходим за да бъде потвърдена или отхвърлена тази хипотеза. Ние идентифицирахме 5 основни клетъчни типа в SVZa на маймуни, от които поне два са прогениторни (неврални прогенитори и невронални прогенитори), както и епендимни и съдови клетки, и изключително интересният фенотип на т.нар. SVZa астроцити (Фиг. 5.3). Ние характеризирахме растежните фактори и рецептори за всеки един от тези клетъчни типове (Фиг. 5.3). Фиг Схематично резюме на експресията на растежни фактори и техни рецептори в прогениторната нима SVZa на маймуни. Прогениторншпе фенотипове (неврален и невронален). както и възможният прогениторен фенотип на SVZa астроцити, са представени на сив фон. 54

57 Експресията на тези фактори говори в полза на теза, че включването на съдова сигнална мрежа в прогениторна регулация е феномен, консервиран между видовете. В същото време, ние отбелягахме и различия между примати, и други бозайници. Едно от основните открития на настоящата работа бе експресията на рецептора на VEGF - Fltl - от прогениторни клетки, за разлика от SVZa при гризачи, където се експресира друг рецептор за VEGF - Flkl. Нашите резултати, обаче, показаха постисхемично увеличение на абсолютния брой FltlVBrdlT в SVZa на маймуни на ранни времеви интервали след исхемия, докато Fltl не бе открит в задържаните прекурсори в SVZa. Тази селективна експресия в активно пролифериращи прекурсори предполага, че Fltl вероятно участва в регулация на пролиферация, а не диференциация. Освен това, ние отбелягахме и различия в количеството на прогенитори, експресираши Fltl, между дорзална, стриатална и вентрална SVZa, подсказващо наличието на различни молекулярни механизми, регулиращи прогенитори в различни аспекти на SVZa. Различията в експресията на Fltl или Flkl от прекурсори при примати или гризачи може да е поне отчасти отговорна за междувидовите различия в биологията на прогениторни клетки в мозъка. Нашите данни предоставят морфологична подкрепа за едно възможно взаимодействие между невротрофин(и) и VEGF в прогениторната ниша. Ние доказахме, че TrkA+ и ТгкЕГ клетки експресират VEGF и Fltl" клетки експресират NGF и BDNF, което отваря възможност за съществуване на авто/паракринна регулация между NGF и VEGF, или между BDNF и VEGF. Резултатите ни, свързани с GDNF и NT3, говорят в полза на теза, че субепендимни клетъчни компоненти на SVZa ниша са вероятно под влияние от епендимни клетки, чрез NT3 и/или GDNF. Епендимните клетки експресират NT3 и GDNF, докато SVZa астроцити и кръвоносни съдове експресират техните рецептори TrkC и GFRal, респективно. Пролифериращи (BrdU4) прекурсори експресираха 3 рецептора, при значително различаващи се проценти ко-локализация: Fltl (над 30% от прогениторите), TrkB (около 10%) и Kit (<5%). Тези данни предпоставят, че BrdtT прекурсори са хетерогенна група клетки, съставена от няколко подфенотипа. Бъдещи експерименти чрез клетъчно сортиране на тези субфенотипове на базата на мембраната експресия на специфичен рецептор, биха спомогнали да се определи точната роля и важност на всяка една от тези молекули в общата картина на регулаторни механизми в прогениторната ниша при възрастни маймуни. На фона на предимно глиогенната реакция на исхемия в мозъка на маймуни, ние наблюдавахме и данни за формиране на нови неврони (Таблица 5.1). 55

58 Регион Gyrus dentatus Cornu Ammonis SVZa Неоко ртекс/стр и ату м Фенотип 45% - Мозъчни прогенитори 30% - Микроглия 12% - Невронални прогенитори 8% - Неврони 5% - Други 80% - Микроглия 15% - Астроцити 3% - Оли годе ндроцити 2% - Други 75% - Невронални прогенитори 10% - Мозъчни прогенитори 5% - Микроглия 10% - Други 80% - Микроглия 10% - Астроцити 5% - Паренхимни прогенитори* 3% - Олигодендроиити 1% - Неврони 1% - Други Таблица 5.1. Проценти на BrdLr клетки (обеднени), двойно позитивни за клетъчно селективни маркери в регионите на интерес, в - дългосрочна група след исхемия. *M usash,r/gfap-/s100tr клетки, различни от пролифериращите астроцити в паренхима, които също са позитивни за Musashtl. B gyrus dentatus, новите клетки с невронален фенотип се намираха в дълбоките, съседни на SGZ, слоеве грануларни неврони. За отбелязване е фактът, че ние открихме данни за установяване на морфологични контакти между нови (BrdlT) неврони и стари (BrdlT, създадени в ембрионалния период) грануларни клетки. Новообразувани грануларни неврони експресираха GABA-ергичен трансмитерен фенотип, който е характерен за част от грануларните клетки. Разгледани заедно, представените резултати подкрепят тезата за узряване на новообразувани грануларни клетки в gyrus dentatus на маймуни, както и за тяхната интеграция в съществуващи невронни мрежи. За разлика от gyrus dentatus, в хипокампалния СА1 сектор, кьдето се наблюдаваше значителна невронална загуба, последвана от високи нива на пролиферация. de novo образувани клетки с невронален фенотип не бяха открити. Ние открихме различия в експресията на определени транскрипционни фактори между прогенитори SGZ и съседната на СА1 прекурсорна ниша SVZi. Докато прогениторните клетки в SGZ експресираха про-невроналните фактори Рахб, Етх2 и Ngn2, същите клетки в SVZi не експресираха нито един от факторите. Различията в експресията на про-невронални транскрипционни фактори между SGZ и SVZi прогенитори може да е свързана с различната способност за невронална продукция между DG или СА1, както и с различната способност за неврогенеза между гризачи и примати. В неокортекс и стриатум, около 1% (28 от 2200) от BrdlT клетки в тези региони проявиха ко-експресия с невроналният маркер NeuN. Тези предполагаеми нови неврони преживяха в продължение на поне 70 дни след края на BrdU инфузия (79 дни след исхемия). през което време се запазиха като стабилна, макар и малка, пропорция от всички BrdlT клетки. Три 56

59 групи данни, представени от нас, говорят в полза на това, че NeuN"7BrdlT клетки са нови неврони в неокортекс и стриатум на маймуни: (/') ние наблюдавахме NeuNT/BrdLT клетки, които бяха морфологично неразличими от съседни, ембрионално създадени NeuN+/BrdLT неврони; (if) NeuN+/BrdlT клетки експресираха транскрипдионни фактори, които са специфични за неокортикални, респ. стриатални, зрели неврони; (ш) NeuN'VBrdlT клетки експресираха ензима GAD, и следователно най-вероятно представляват GABA-ергични интерневрони, което е в съзвучие с тяхната преференциална локализация в слоеве II-IV на неокортекс. Всички двойни и тройни оцветявания бяха изследвани чрез лазерна конфокална микроскопия, като триизмерни реконструкции потвърдиха ко-локализацията на сигналите в една и съща и клетка, изключвайки възможността BrdU+ сателитни глиални клетки насложени над неврони да бъдат фалшиво интерпретирани като de novo генерирани неврони. Липсата на ко-локализация между TUNEL и BrdU, от своя страна, е индикатор за отсъствие на аберантна синтеза на ДНК, доловима имунохистохимично. в апоптотични неврони след исхемия. Наличието на нови, образувани след исхемията. неврони в стриатум и кортекс поставя въпроса за произхода на прогениторните клетки, генерирали тези неврони. Един от възможните източници е SVZa, но ние доказахме липса на пренасочване на прогенитори от тази зона или миграционния път RMS към исхемичния мозъчен паренхим. Като алтернативно обяснение, според нас е възможно новите неврони да произлизат от паренхимни прогенитори, т.е. локални прогенитори извън герминативните ниши. В стриатум и кортекс, ние идентифицирахме, че около 5% от BrdU+ клетки са с фенотип BrdU+/Musashil+/GFAP (Таблица 5.1), който е идентичен с прекурсорния фенотип в SVZa и SGZ. Тези клетки не формираха агрегати в специфична ниша, а бяха разпръснати в мозъчния паренхим на изследваните области. Това ги прави пространствено близки до de novo генерираните неврони и глия в паренхима Нашите in vivo резултати, заедно с данни на други изследователи за in vitro изолация на прогенитори от кортекс на хора изискват бъдещо по-задълбочено изследване на хипотезата за клетъчна продукция от паренхимни прогенитори във възрастния приматен мозък. Два са основните подходи за терапевтично приложение на мозъчни стволови/прогениторни клетки при неврологични заболявалия при хора. При първият подход, към който имат отношение и нашите настоящи изследвания, ендогенни прогенитори биват мобилизирани в региони на увреда, кьдето те се диференцират и заместват загинали клетки. При вторият подход, прогенитори, които са били изолирани и пропагирани in vitro, биват трансплантирани в региони на увреда, кьдето те се диференцират и заместват загинали клетки. Прилагането на приматни модели на мозъчна исхемия при маймуни, като филогенетично по-близки до хората, обаче, показа наличието на различия с гризачите по отношение 57

60 на количествения и качествен състав и молекулярна регулация на ендогенни прогениторни клетки. Увеличаването на познанията относно механизмите, контролиращи спецификацията на ендогенните прогениторни клетки в мозъка на възрастни примати в експериментален модел, ще улесни планирането и осъществяването на бъдещи научни трудове, целящи създаване на по-ефикасни подходи за лечебно приложение на стволови/ прогениторни клетки при хора. Тези подходи ще трябва да отчетат и възрастовите промени в капацитета на мозъка да генерира и поддържа преживяването на такива ендогенни клетки, предвид значително поголямата честота на мозъчни инциденти при по-възрастното население. Идентификацията на междувидови, възрастови и регионални различия в регулацията на неврогенезата изисква значителни фундаментални научни усиля. Нашите резултати подкрепят гледната точка, че използването на животински приматни модели е важен компонент от тези усилия. 6. Изводи 1. Глобалната мозъчна исхемия при възрастни маймуни значимо повишава броя, но не и диференциацията, на прекурсорни клетки в хипокамп (SGZ и SVZi), SVZa, RMS, bulbus olfactorius, неокортекс и стриатум. 2. Исхемията индуцира ограничена като обем, но персистираща във времето, неврогенеза в иначе не-неврогенни региони, като неокортекс и стриатум. 3. В прогениторните ниши SGZ и SVZa, прекурсорни клетки задържат своята локализация и не проявяват белези на диференциация в продължение на месеци. Исхемията засилва този феномен. 4. Исхемията води до увеличена неврогенеза в bulbus olfactorius на дългосрочни времеви интервали. 5. Невропильт на неокортекс и стриатум, но не и на СА1 сектор на хипокампа, вероятно съдържа локални прогениторни клетки. 6. Исхемията не е в състояние, без външно въздействие, да индуцира неврогенеза в хипокампалния СА1 сектор - най-чувствителния на исхемия мозъчен регион. 58

61 7. Прекурсорни клетки в не-неврогенната прогениторна зона SVZi и в неврогенната зона SGZ, проявяват различия по отношение експресията на про-невронални транскрипционни фактори. 8. Прекурсорни клетки в SVZa експресират типово-характерни комбинации от транскрипционни фактори, първоначално открити заради ролята си в ембрионалната неврогенеза. 9. Прекурсорни клетки в SVZa експресират типово-характерни комбинации от растежни фактори и техни рецептори, повечето от които имат роля и в процесите на ангиогенеза. Този факт подсказва връзка между ангиогенеза и неврогенеза при приматите. 7. Справка за приносите на дисертационния труд 1. За първи път се проследява in vivo във времето прогениторната пролиферация и диференциация в краен мозък на възрастни примати след исхемия. 2. За първи път се доказва наличие на неврогенеза в неокортекс и стриатум след мозъчна увреда при примати. 3. Демонстрира се увеличена неврогенеза в bulbus olfactorius след исхемия при примати. 4. Приведени са оригинални данни за задържане на локализацията и диференциацията на прогенитори в прогениторни зони на възрастен мозък при бозайници след увреда. 5. Оригинално е доказването на различия в експресията на транскрипционни фактори между субрегиони на една и съща мозъчна структура (хипокамп): SVZi и SGZ. 6. Документира се експресията на ембрионално регулирани транскрипционни фактори в прогениторни клетки при примати. 7. Документира се комплексната експресия на констелация от растежни фактори и техни рецептори в прогениторни клетки при примати. 8. Представят се оригинални in vivo данни при примати, подсказващи възможността за съществуване на локални прогениторни клетки в неокортекс и стриатум. 59

62 8. Публикации във връзка с докторантурата Статии (и техни цитирания): 1 Tontchev АВ, Yamashima Т. Ischemic delayed neuronal death: role of the cysteine proteases calpain and cathepsms. Neuropathology 1999; 19: Цитирана от: 1) Ottens AJC et al. Mass Spectrora Rev 2006, 25: ) Xing H et al. J Neurophysiol 2004; 92: ) Baba A etal. J Neurocytol 2002; 31: Yamashima T, Zhao L, Wang XD, Tsukada T, Tonchev AB. Neuroprotective effects of pyridoxal against ischemia in monkeys. Nutr Neurosci 2001, 4: Цитирана от: 1) Kandzari DE et al. Expert Opinion on Investigational Drugs 2005; 14: ) Wang CX et al Journal of Neurosurgery 2005; 103: ) McGinnis WR et al. Alternative Therapies in Health and Medicine 2004; 10: ) Hwang IK et al Neuroscience 2004; 128: ) Berman O et al Computers & Operations Research 2004; 31: ) Syntichaki P et al. Nature Reviews Neuroscience 2003; 4: Zhao L, Yamashima T, Wang XD, Tonchev AB, Yamashita J, Kakiuchi T, Nishiyama S, Kuhara S, Takahashi K, Tsukada H. PET imaging of ischemic neuronal death in the hippocampus of living monkeys. Hippocampus 2002; 12: Цитирана от: 1) Eckelman WC et al. Curr Pharm Des 2006; 12: ) Yamashima T, CeU Calcium 2004; 36: WangXD, Kashii S, Zhao L, Tonchev AB, Katsuki H, AkaikeA, HondaY, YamashitaJ, Yamashima T. Vitamin B6 protects primate retinal neurons from ischemic injury. Brain Res 2002: 940, Цитирана от: 1) Wang CX et al. J Neurosurg 2005; 103: , 2) Lin YP et al Neuroreport 2004; 15: ) Osborne NN et al. Progress in Retinal and Eye Research 2004; 23: ) Syntichaki P et al. Nature Reviews Neuroscience 2003; 4: Yoshida M, Yamashima T, Zhao L, Tsuchiya K, Kohda Y, Tonchev AB, Matsuda M, Kominami E. Primate neurons show different vulnerability to transient ischemia and response to cathepsin inhibition. Acta Neuropathol 2002: 104; Цитирана от: 1) Martinez-Vargas M et a l Neurosci Lett 2006; 400: ) Artal-Sanz M et al. J CeU Biol 2006; 173: ) Wang J et al. Neurocritical Care 2005; ) Syntichaki P et al Current Biology 2005, 15: ) Olsson T et al. Neuroscience 2004; 128: ) Aimone JB et al. Experimental Neurology 2004; 189: ) Yamashima T CeU Calcium 2004; 36: ) Takuma K et al Progress in Neurobiology 2004, 72: ) Kitao Y et al. Journal of Neuroscience 2004; 24: ) Padosch SA et al. Cutt Opin Anaesthesiol 2003; 16: ) Samara C et al. Ageing Research Reviews 2003; 2: ) Syntichaki P et al. Nature Reviews Neuroscience 2003; 4: ) Lu A G et al. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 2003, 23:

63 6. Popivanova В, Koike К, Tonchev АВ, Ishida Y, Kondo Т, Ogawa S, Mukaida N, Inoue M, Yamashima T. Accumulation of microglial cells expressing ELR motif positive CXC chemokines and their receptor CXCR2 in monkey hippocampus after ischemia-reperfusion. Brain Res 2003: 970; Цитирана от: 1) Valles A et al. Neurobiol Dis 2006; 22: ) Sun J et al. International Journal of Pathology and Clinical Medicine 2006, ) Block et al Progress in Neurobiology 200S. 76: ) Fox C et al. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 2005; 25: ) Maheshwari A et al. Fetal and Pediatric Pathology 2004; 23: ) Ambrosini E et al Neurochemical Research 2004; 29: Yamashima T, Tonchev AB, Tsukada T, Saido TC, Imajoh-Ohmi S, Momoi T, Kominami E. Sustained calpain activation associated with lysosomal rupture executes necrosis of the postischemic CA1 neurons in primates. Hippocampus 2003: 13; Цитирана от: 1) Festjens N et al Biochim Biophys Acta 2006, 1757: ) Zhang A et al. Neurosignals , 15: ) Yap YW et al. J Neurochem 2006; 98: ) Artal-Sanz M et al. J Cell Biol 2006; 173: ) Orrenius S et al. Chem Res Toxicol. 2006; 19: ) Yap YW et al. J Neurochem : ) Ottens AK et al Mass Spectrom Rev 2006; 25: ) Jiang H et al Cell Death and Differentiation 2006; 13: ) Strachan GD et al. Journal of Cellular Biochemistry 2005; 96: ) Doonan F et al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2005; 46: ) Vandenabeele Petal Cell Death and Differentiation 2005, 12: ) Artal-Sanz M et al. FEBS Letters 2005, 579: ) ZhuC etal. Cell Death and Differentiation 2005; 12: ) Yamashima T. Cell Calcium 2004; 36: ) Liebetrau M et al Thrombosis Research 2003, 112: Тончев АБ Количество и фенотип на пролифериращи клетки в постисхемичния мозък на възрастни маймуни. Дисертация (доктор по медицина). Защитена на г., 133 с. 9 Tonchev АВ, Yamashima Т, Zhao L, Okano HJ, Okano H. Proliferation of neural and neuronal progenitors after global brain ischemia in young adult macaque monkeys Mol Cell Nevrosci 2003: 23; Цитирана от: 1) Chopp M et al Stroke 2007; 3 8: ) Sugaya K et al. Panminerva Med 2006, ) Macas J et al J Neurosci 2006, ) Koketsu D et al. Exp Neurol 2006; 199: ) Ngwenya LB et al. J Comp Neurol 2006; 498: ) Kornilova M et al. Exp Neurol 2006; 199: ) Feldmann RE et al. International Journal of Legal Medicine 2006: 120; ) Rizk P et al. Neuropsychopharmacology 2006,31: Popa-Wagner A et al. Current Neurovascular Research 2006; 3:3. 10) Taupin P Current Neurovascular Research 2006, ) Tande D et al Brain 2006, 129: ) Bedard A et al. Experimental Brain Research 2006; 170: ) Lichtenwalner RJ et al Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 2006, ) Kawada H et al. Circulation : ) PforteC etal Neuroscience 2005; 136: ) Layton MG et al. Journal of Molecular Neuroscience 2005; 27: ) Bauer S etal Journal of Cell Biology 2005; 171:

64 18) RaedtRetal Acta Neurologies Belgica 2005,105: ) Lu G et al. Journal of Molecular Neuroscience 2005; 27: ) Zhu LL et al Brain Research 2005,1055: ) Zhang RL et al. Neuroscientist 2005,11: ) Crespel A et al. Neurobiology ofdisease 2005,19; ) Zhu LL et al. Molecular Neurobiology 2005; 31: ) Gotts JE et al. Journal of Comparative Neurology 2005; 488: ) Gotts JE et al Experimental Neurology 2005, 194: ) Collombet JM et al. Toxicology 2005; 210: ) Gotts JE et al Journal of Neuroscience Research 2005; 80: ) Iwanami A et al Journal of Neuroscience Research 2005; 80: ) Agrawal S et al Trends in Biotechnology 2005; 23: ) Takagi Y et al. Journal of Clinical Investigation 2005; 115 : ) Krathwohl MD et al. Journal of Infectious Diseases 2004, 190: ) Picard-Riera N et al. Journal of Neuroscience Research 2004, 76: ) Doyle AM et al. Developmental Dynamics 2004; 229: ) Ekdahl CT et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: Tonchev АБ, Yamashima T, Zhao L, Okano H. Differential proliferative response in the postischemic hippocampus, temporal cortex and olfactory bulb of young adult macaque monkeys. Glia 2003: 42; Цитирана от: 1) Kotani S et al. Neurosci Res 2006; 56: ) Leker RR Pathophysiol Haemost Thromb 2006; 35: ) Henrich-Noack P et al Brain Res 2006; 1070: ) Kawada H et al. Circulation 2006; 113: ) Pforte C et al Neuroscience 2005; 136: ) Bauer S etal. Journal of Cell Biology 2005; ) Nagel S et al. Brain Research 2005; ) Gebicke-Haerter PJ Journal ofneuroscience Research 2005, ) Crespel A et al Neurobiology ofdisease 2005, 19; ) Leker RR et al. Current Neurovascular Research 2004; 1: ) Iwanami A et al. Journal ofneuroscience Research 2005, 80: ) Colodner KJ et al. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 2005, 64: ) Horie N et al FEBS Letters 2004, 571: ) Calza L et al Progress in Brain Research 2004, 146: Tonchev AB. Are there functional progenitor cells in the adult brain parenchyma? Biomed Rev ; Yamashima T, Tonchev AB. Vachkov IH, Popivanova BK, Seki T, Sawamoto K, Okano H. Vascular adventitia generates neuronal progenitors in the monkey hippocampus after ischemia. Hippocampus 2004: 14; Цитирана от: 1) Yagita Y et al Neurosci Lett , 409: ) YasuharaTetal Frontiers in Bioscience 2006; 11: ) Feldmann RE et al International Journal of Legal Medicine ; ) Lichtenwalner RJ et al. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 2006; 26: ) Ngwenya LB et al Journal of Histochemistry & Cytochemistry : ) Torsney E et al Trends in Cardiovascular Medicine 2005, 15: ) Heine VM et al European Journal of Neuroscience 2005; 21: Takahashi N, Tonchev AB, Koike K, Murakami K, Yamada K, Yamashima T, Inoue M Expression of estrogen receptor-p in the postischemic monkey hippocampus. Neuroscience Letters 2004: 369, Цитирана от: 1) McCarty MF Med Hypotheses 2006, 67: ) Mhyre AJ etal Endocrinology 2006, 147:

65 3) Milner ТА et al Journal of Comparative Neurology 2005; ) Hu S et al. Journal of Neurobiology 2005; 64; ) Miller NR et al. Endocrinology 2005; 146: ) Garcia-Ovejero D et al. Brain Research Review's 2005; 48: ) Cordey M et al. Brain Research 2005; 1045: Tonchev AB, Yamashima T, Sawamoto K, Okano H. Enhanced proliferation of progenitor cells in the subventricular zone and limited neuronal production in the striatum and neocortex of adult macaque monkeys after global cerebral ischemia. JN eu rosci Res 2005: 81; Цитирана от: 1) Suzulu S et al. J Comp Neurol 2007; 500: ) Taupin PT Ann Acad Med Singapore 2006; 35: ) Macas J et al. J Neurosci 2006; 26: ) Ninomiya M et al. Neurosci Lett 2006; 403: ) Komitova M et al. Exp Neurol 2006, 199: Tonchev AB. Neurogenesis in adult mammalian hippocampus after ischemia: rodent versus primate models. Biomed Re~v 2005: 16; Tonchev AB, Yamashima T. Differential neurogenic potential of progenitor cells in dentate gyrus and CA1 sector of the postischemic adult monkey hippocampus. Exp Neurol 2006; 198: Tonchev AB, Yamashima T, Sawamoto K, Okano H Transcription factor protein expression patterns by neural or neuronal progenitor cells of adult monkey subventricular zone. Neuroscience 2006: 139; Tonchev AB, Stankulov IS, Ghenev PI, Pavlov PS, Chaldakov GN, Yamashima T. Identification of putative progenitor cells in the anterior subventricular zone of the adult human brain. C R Bidg Acad Sci 2006: 59; Yamashima T, Popivanova BK, Guo J, Kotani S, Wakayama T, Iseki S, Sawamoto K, Okano H, Fujii C, Mukaida N, Tonchev AB Implication of down syndrome cell adhesion molecule" in the hippocampal neurogenesis of ischemic monkeys. Hippocampus Tonchev AB, Yamashima T, Guo J, Chaldakov GN, Takakura N. Expression of angiogenic and neurotrophic factors in the progenitor cell niche of adult monkey subventricular zone Neuroscience 2007, 144: Общ импакт фактор - 43,4; индивидуален - 9,6. Общо цитирания

66 Доклади: 1. Tonchev АВ, Zhao L, Yamashima Т. Upregulation of cell proliferation and neurogenesis in the postischemic hippocampal formation of young adult primates. Japanese Hippocampal Sympozium, 1-2 Nov, 2001, Gunma, Japan. 2. Yamashima T, Tonchev AB. Upregulation of progenitor cell proliferation in the postischemic brain of adult monkeys. Japanese Society of Neurosurgery Annual Congress, 3-10 Oct, 2002, Matsumoto. Japan. 3. Tonchev AB, Yamashima T, Okano H, Chaldakov N. Proliferation of brain progenitor cells after global ischemia in adult macaque monkeys. XVI National Congress of Anatomy with International Participation, 5-7 юни 2003, София. 4 Tonchev AB, Yamashima T, Okano H. Brain progenitor cell proliferation after ischemia in monkeys. Kanazawa Neuroscience Symposium, Каназава, Япония, октомври Tonchev AB, Yamashima T, Okano H, Chaldakov GN. Upregulation of brain progenitor cell proliferation after global ischemia in adult macaque monkeys. Конгрес по Клинична Анатомия, Варна, октомври 2004, Варна. 6. Tonchev AB, Yamashima T, Okano H, Chaldakov GN. Sustained survival of adult generated neurons in the striatum and neocortex after global cerebral ischemia to adult monkeys. Ill Национален конгрес на Българското Дружество по Невронаука. 3-4 юни, 2005, София. 7. Тончев А. Почетна лекция но повод удостояване с наградата на името на професор Димитър Каданов Разпределение и фенотил на пролиферираши клетки в постисхемичния мозък на възрастни маймуни. XIV национален конгрес по анатомия, юни, 2005, Хисаря. 8. Тончев А, Ямашима Т, Станкулов И, Чалдъков Г. Преживяване на прогениторни клетки в субеентрикулната зона на възрастния приматен мозък след увреда XIV национален конгрес по анатомия, юни, 2005, Хисаря. 9. Tonchev AB, Yamashima Т, Chaldakov GN. Molecular control of progenitor cells in adult monkey subventricular zone. The 29lh Balkan Medical Week септември 2006, Златни Пясъци, Варна 10 Тончев А, Чалдъков Г, Станкулов И, Павлов П, Тенев П, Ямаишма Т, Окано X. Ендогенни прогениторни клетки в приматния мозък при възрастни клетъчна биология и клинични перспективи. Юбилейна научна сесия 45 Години Медицински Университет-Варна, октомври, 2006, Варна. 64

67 9. Библиография 1. Okano Н. Neural stem cells: progression of basic research and perspective for clinical application Keio J Med 51: Ramon y Cajal S Degeneration and regeneration of the nervous system (Day RM, translator, from the 1913 Spanish edition). London: Oxford UP. 3. Reynolds BA, Weiss S Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science 255: Lois C, Alvarez-Buylla A Proliferating subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia. Proc Natl Acad Sci USA 90: Garcia-Verdugo JM, Doetsch F, Wichterle H, Lim DA, Alvarez-Buylla A Architecture and cell types of the adult subventricular zone: in search of the stem cells. J Neurobiol 36: Gage FH Mammalian neural stem cells. Science 287: Gould E, Gross CG Neurogenesis in adult mammals: some progress and problems. JNeurosci 22: Bjorklund A, Lindvall O Cell replacement therapies for central nervous system disorders. Nat Neurosci 3: Lindvall O, Kokaia Z Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441: Dimagi U, Iadecola C, Moskowitz MA Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 22: Liu J, Solway K, Messing RO, Sharp FR Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci 18: Nakatomi H, Kuriu T, Okabe S, Yamamoto S, Hatano O, Kawahara N, Tamura A, Kirino T, Nakafuku M Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell 110: Jin K, Minami M, Lan JQ, Mao X, Batteur S, Simon RP, Greenberg DA Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA 98: Arvidsson A, Collin T, Kirik D, Kokaia Z, Lindvall O Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 8:

68 10. Summary Anton В. Tonchev, MD, PhD Division of Cell Biology, Department of Forensic Medicine, Medical University of Varna. Varna, Bulgaria Long-term fate and molecular control of endogenous progenitor cells in adult primate telencephalon DSc thesis, presented at the Specialized Scientific Council of Morphology, Higher Certifying Committee, Sofia, Bulgaria Reviewers: Michail S. Davidoff, MD, DSc, Institute of Anatomy, Hamburg University, Hamburg, Germany Nikolai E. Lazarov, MD, DSc, Department of Anatomy and Histology, Medical Faculty, Thracian University, Stara Zagora, Bulgaria Kamen G. Usunoff, MD, DSc, Department of Anatomy and Histology, Medical University of Sofia, Sofia, Bulgaria We performed transient global cerebral ischemia to adult macaque monkeys by reversibly stopping the blood flow to the brain We labeled de novo generated cells in postischemic animals as well as in sham-operated controls by infusing the DNA synthesis indicator bromodeoxyuridine (BrdU), and subsequently investigated the distribution and phenotype of BrdU-labeled cells in several telencephalic regions at various time points after ischemia. The ischemic insult significantly increased the number of proliferating cells in the hippocampus, subventricular zone, neocortex and striatum, but had no such effect in the parahippocampal region. In the olfactory bulb, ischemia did not change the proliferating cell levels in the first two postischemic weeks, but did increase these levels at long-term survival time periods. The majority newly generated cells outside the germinative centers were of glial phenotype, while neurons comprised only 1% of these cells. Notably, no new neurons were observed in the hippocampal CA1 sector, the region exhibiting the highest vulnerability to ischemia. Within the germinative centers, most BrdU-labeled cells were of progenitor phenotype and a large proportion of these precursors sustained their existence in the niche for months after ischemia Within the brain parenchyma, cells with a progenitor phenotype were identified, and these might be responsible for the limited parenchymal neurogenesis as well as for the oligodendrogliogenes and astrogliogenesis in striatum and neocortex. We further showed that progenitor cells in the anterior subventricular zone (SVZa) express developmentally regulated transcription factors including Pax6, Emx2, Soxl-3, Ngnl, Dlxl,5 and Oligl,3 and these transcription factor proteins were segregated in either neural or neuronal precursors. Cells of the SVZa precursor niche expressed a panel of angiogenic and/or neurotrophic factors and their receptors, including VEGF and its receptor Fill, neurotrophic factors such as NGF, BDNF and GDNF, and their receptors. The presented data provide a molecular phenotypic analysis of cell types comprising adult monkey SVZa, and suggest that a 66

69 Ендогенни прогениторнн клетки в приматен мозък complex network of cell-intrinsic and cell-extrinsic signals may regulate neurogenesis in the adult primate brain. Grant sponsors: Research was supported by Grant-in-Aid for Strategic Promotion System for Brain Science (SPSBS) from the Ministry of Education, Culture. Sports. Science and Technology of Japan. Key words: neurogenesis, neural progenitor cell, brain ischemia, adult primate Correspondence to: Anton B. Tonchev, Division of Cell Biology', Department of Forensic Medicine, Medical University of Varna, Varna 9002, Bulgaria Web: wwxv.nutrigenomics-bg.com : 67

70 11. Благодарности Експериментите по настоящата дисертация бяха осъществени чрез финансовата подкрепа на Министерствата на образованието и науката на Япония, и България. На моя приятел и учител доц. Георги Чалдъков дължа разбирането за високите критерии и морала в науката. На доц. Тецумори Ямашима съм задължен за опита да се преодоляват трудностите чрез спокойна упоритост. Д-р Лианг Жао и К. Такано ми съдействаха при извършването на експериментите с животни. Киоко Уада и Ейко Сакагучи ми оказаха секретарска помощ. Проф. Нобуюки Такакура (Каназава, Япония) ми помогна в осъзнаването на връзките между ангиогенеза и неврогенеза. Проф. Хидеюки Окано (Токио. Япония) предостави ценни идеи по някои от протоколите и при изготвянето на ръкописи на публикации във връзка с дисертацията. Благодаря на колегите от Катедрата по съдебна медицина, деонтологмя и клетъчна биология в МУ-Варна доц. Радойнова, д-р Панайотова, д-р Бурулянова и д-р Доков за приятелската атмосфера и подкрепата. Доц. Петър Генев и д-р Иван Станкулов получават признателността ми за нестихващите идеи. с които ме зареждат. Д-р Иван Вачков и д-р Веселка Николова бяха на точното място в точния момент, когато имах нужда. Благодаря на сестра ми Ивелина. майка ми Юлияна и баща ми Божидар, за любовта им. С нея съм силен. 68