А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

Размер: px
Започни от страница:

Download "А В Т О Р Е Ф Е Р А Т"

Препис

1 В О Е Н Н О М Е Д И Ц И Н С К А А К А Д Е М И Я Катедра Медицина на бедствените ситуации АХМЕД НЕДЖАТ НЕДЖИБ, дх Оксимни реактиватори на холинестеразата координационна способност и реактивиращ потенциал А В Т О Р Е Ф Е Р А Т на дисертационен труд за присъждане на образователна и научна степен ДОКТОР Област на висше образование: 7. Здравеопазване и спорт Професионално направление: 7.1 Медицина Научна специалност: Военна токсикология Научни ръководители: проф. Иван Съмналиев, дмн проф. Ивайла Панчева, дх СОФИЯ 2021 г.

2 В О Е Н Н О М Е Д И Ц И Н С К А А К А Д Е М И Я Катедра Медицина на бедствените ситуации АХМЕД НЕДЖАТ НЕДЖИБ, дх Оксимни реактиватори на холинестеразата координационна способност и реактивиращ потенциал А В Т О Р Е Ф Е Р А Т на дисертационен труд за присъждане на образователна и научна степен ДОКТОР Област на висше образование: 7. Здравеопазване и спорт Професионално направление: 7.1 Медицина Научна специалност: Военна токсикология Научни ръководители: проф. Иван Съмналиев, дмн проф. Ивайла Панчева, дх Рецензенти: доц. Димо Димов, дм доц. Юлиан Загранярски, дх Научно жури: проф. Магдалена Кондева-Бурдина, дф проф. Огнян Петров, дх доц. Димо Димов, дм доц. Иван Попиванов, дм доц. Юлиан Загранярски, дх СОФИЯ 2021 г

3 Дисертационният труд съдържа общо 103 страници, онагледен е с 47 фигури и 12 таблици, а цитираните литературни източници са 130. Докторантът работи в Секция по военна токсикология към катедра Медицина на бедствените ситуации на МБАЛ-София при ВМА. Дисертационният труд е обсъден, приет и насочен за защита пред научно жури от разширен Катедрен съвет при катедра Медицина на бедствените ситуации към МБАЛ-София при ВМА на г. Защитата на дисертационния труд ще се състои на г., от ч. в Аулата на ВМА, гр. София ул. Св. Г. Софийски 3 на открито заседание на научно жури. Материалите по защитата са публикувани на интернет страницата на ВМА. Ахмед Неджиб, дх - 2 -

4 Съдържание ВЪВЕДЕНИЕ ИЗВОДИ ОТ ЛИТЕРАТУРНИЯ ОБЗОР ЦЕЛ И ЗАДАЧИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА ЧАСТ РЕАКТИВИ, РАЗТВОРИТЕЛИ И МАТЕРИАЛИ ИЗПОЛЗВАНА АПАРАТУРА МЕТОДИ И ПРОЦЕДУРИ Спектрофотометрично изследване на реакционната система Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L Стабилност на комплексните видове при реални условия (условни стабилитетни константи (β')) Определяне на чистотата на MPT и PO посредством газ-хроматографски анализ Приготвяне на разтвори на необходимите веществата за in vitro експериментално определяне на ензимна активност Процедура за инхибиране и реактивиране на холинестеразна активност в условия in vitro Определяне на активността на BuChE Метод на Елман за определяне на AChE активност Изчисляване на степента на инхибиране и реактивиране на ензимната активност РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНА ОЦЕНКА НА КООРДИНАЦИОННАТА СПОСОБНОСТ НА КВАТЕРНЕРНИ МОНО- И БИС-ПИРИДИНИЕВИ АЛДОКСИМИ СТАБИЛНОСТ НА НОВОПОЛУЧЕНИТЕ КОМПЛЕКСИ (УСЛОВНИ СТАБИЛИТЕТНИ КОНСТАНТИ (Β')) РЕАКТИВИРАЩ ПОТЕНЦИАЛ НА НОВОСИНТЕЗИРАНИТЕ СЪЕДИНЕНИЯ СПРЯМО ИНХИБИРАНИ ЕРИТРОЦИТНА/МОЗЪЧНА ACHE И BUCHE ИЗВОДИ ПРИНОСИ НАУЧНИ ПУБЛИКАЦИИ И УЧАСТИЯ В НАУЧНИ ФОРУМИ

5 Използвани съкращения ХБОВ Химични бойни отровни вещества ФОС Фосфорорганични съединения GA Табун GB Зарин GD Зоман GF Циклозарин ACh Ацетилхолин ChE Холинестераза AChE Ацетилхолинестераза BuChE Бутирилхолинестераза Ch Холин ВМА Военномедицинска академия RBC-AChE Еритроцитна ацетилхолинестераза MPT Метилпаратион PO Параоксон RChE Реактиватор на холинестеразата НИЛВТ Научно-изследователска лаборатория по Военна токсикология β Стабилитетна константа β Условна стабилитетна константа ATChI Ацетилтиохолин йодид DTNB 5,5 -дитио-бис(2-нитробензоена киселина) PBS Физиологичен разтвор с фосфатен буфер GC-FID Газова хроматография с пламъчно-йонизационен детектор FiNAl Fishing Net Algorithm brain-ache Мозъчна ацетилхолинестераза - 4 -

6 Въведение Третата декада на новото столетие настъпи, носейки със себе си повсеместна тревога, безпокойство и страх от развилнялата се пандемия, причинена от COVID-19. Оказа се, че Човечеството, независимо от върховите технологични постижения, е изключително уязвимо и неподготвено за такъв развой на събитията. Това поставя на дневен ред много остро въпроса за своевременната и адекватната реакция в национален и глобален мащаб при възникване на огнища с биологични агенти един от елементите на оръжията за масово унищожение. С не по-малка тревога световната общественост посрещна новината за използване на химични бойни отровни вещества (ХБОВ) в хода на гражданската война в Сирия, която отне живота на хиляди и осакати още повече напълно невинни цивилни жители, включително деца. В продължение на 2-3 години последваха нови подобни антихуманни действия, които ясно показаха, че заплахата от употреба на химични агенти в локални конфликти или при терористични актове все още е налице. Особено внимание следва да се обърне на факта, че сред използваните агенти има представител на най-токсичните ХБОВ, каквито са нервните агенти. Става дума за зарин, чиято употреба е доказана от утвърдени международни химикотоксикологични лаборатории. Шокираща за света бе и употребата на най-новата генерация нервни агенти Новичок, отличаващи се със свръхтоксичност, като средство за терор в английския град Солсбъри през 2018 г. Тези събития дадоха повод за преоценка на ефективността на утвърдения медикаментозен подход за профилактика и терапия на острите интоксикации с нервни агенти. Един от неговите основни компоненти се явават реактиваторите на холинестеразата, които са класически пример за етиологично лечение на една интоксикация. Оказва се, че съществуват определени ограничаващи фактори, което дава основание за интензивни научни изследвания в тази област с цел оптимизиране на антидотната терапия. За постигане на тази задача се използват редица съвременни методи, които позволяват синтезирането на нови обещаващи съединения. Един от възможните подходи за получаването на нови холинестеразни реактиватори е обект на настоящия дисертационен труд

7 Изводи от литературния обзор 1. Поради своите физични и химични свойства, нервните агенти се явяват най-токсичните представители на химичните бойни отровни вещества. По тази причина те се разглеждат като потенциален източник на заплаха за цивилното население при евентуален терористичен акт. 2. Независимо от значителните успехи в антидотната терапия на интоксикациите с ФОС, в частност използването на реактиватори на холинестеразата, все още има нерешени проблеми. Един от тях е отсъствието на универсален реактиватор, който да е ефективен срещу всички представители на тези агенти. 3. Това е причината за провеждането на интензивни научни изследвания, насочени към синтезиране и проучване на нови и перспективни съединения, в качеството им на реактиватори на холинестераата. Един от възможните подходи за получаване на нови такива е комплексообразуване на оксимни съединения с метални йони

8 Цел и задачи Цел Основна цел на настоящия дисертационен труд е изследване на комплексообразувателната способност на серия оксимни реактиватори на холинестеразата с двузарядните метални йони на паладий и платина и оценяване на реактивиращия потенциал на новополучените комплексни частици в условия in vitro. Задачи За изпълнение на поставената цел бе необходимо решаването на следните задачи: 1. Изследване на способността на алдоксимните реактиватори 2-PAM, ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Обидоксим и ВТ-07-4М да взаимодействат с двузарядните метални йони на паладий (Pd(II)) и платина (Pt(II)). 2. Определяне на стабилността на новополучените комплекси. 3. Изследване на реактивиращия потенциал на новосинтезираните съединения спрямо инхибирани от фосфорорганичните инсектициди метилпаратион (MPT) и параоксон (PO) мозъчна AChE, еритроцитна AChE и BuChE и в опити in vitro

9 Експериментална част Реактиви, разтворители и материали Лигандите 2-PAM (HL +, HLI) и ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Обидоксим и ВТ-07-4М (H2L 2+, H2LX2, X = Cl, Br ) са синтезирани в Научноизследователската Лаборатория по Военна Токсикология (ВМА- София). Метилпаратион (MPT) е предоставен от същата лаборатория. (NH4)2PdCl4, (NH4)2PtCl4, NaOH, H3PO4 Na2CO3, NaCl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, KHCO3, Triton X-100, параоксон (PO), ацетилтиохолин йодид (ATChI), 5,5'-дитиобис(2-нитробензоена киселина) (DTNB) и абс. EtOH са закупени от Sigma-Aldrich (Германия). Буферът на Britton-Robinson (ph 7.4) е приготвен непосредствено преди експериментите от фосфорна, борна и оцетна киселини в крайна концентрация M на всяка една от тях. Стойността на ph е коригирана с необходимото количество NaOH ( M). Фосфатният буфер (ph 6 с обща концентрация 0.6 M и ph 8 с обща концентрация 0.1 М) е приготвен непосредствено преди експериментите, като стойността на ph е коригирана с необходимото количество NaOH и/или H3PO4. Всички реактиви и разтворители са с квалификация чза. В експериментите е използвана дейонизирана вода (18.2 MΩ.cm). Цяла кръв (от здрави доброволци) във вакуумна епруветка, съдържаща гел сепаратор (жълта капачка), се центруфугира при rpm за 3 min. Отделеният серум се използва за определяне на BuChE. Цяла кръв (от здрави доброволци) във вакуумна епруветка, съдържаща хепарин като антикоагулант (зелена капачка), се центруфугира при rpm за 3 min. Отделената плазма се премахва и към еритроцитната маса се прибавя PBS (phosphate buffer saline, ph 7.4) до възстановяване на първоначалния обем. Получената проба се хомогенизира внимателно (без използване на vortex миксер) и отново се - 8 -

10 центрофугира при rpm за 3 min. Процедурата се повтаря до получаването на бистра прозрачна супернатанта. Последната се премахва и еритроцитната маса се хемолизира, като към 1.00 ml от нея се прибавят 9.00 ml 2.5% Triton X-100. Полученият хемолизат е използван като източник на еритроцитна AChE (RBC-AChE). Отпрепариран мозък от мъжки плъх порода Wistar (достигнал полова зрялост, с тегло g) е предоставен от Института по невробиология на БАН. От него е приготвен 10% (w/v) мозъчен хомогенат с помощта на механичен тъканен хомогенизатор, като към 1.65 g плъши мозък е прибавена ml дейонизирана H2O. До експеримента тази проба е съхранявана при температури от 16 до 20. Непосредствено преди работа от 10% (w/v) мозъчен хомогенат се приготвя 2% мозъчен хомогенат чрез разреждане с дейонизирана H2O. Така полученият 2% мозъчен хомогенат е използван като източник на мозъчна AChE в опитите in vitro. Използвана апаратура Спектралните промени в реакционните системи Pd(II)/Pt(II) 2- PAM, ВТ-07, ВТ-08, Обидоксим и ВТ-07-4М са проследени чрез Shimadzu UV-1800 спектрофотометър. Спектрофотометричното поведение в реакционната система Pd(II) TMB-4 е регистрирано с помощта на Thermo Scientific Genesys 10S UV-Vis спектрофотометър. Измерването на холинестеразната активност е осъществено с Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics BA-88A (полуавтоматичен биохимичен анализатор). Определянето на чистотата на инсектицидите MPT и PO е извършено с Agilent 6890N газ-хроматограф с пламъчно-йонизационен детектор (GC-FID)

11 Методи и процедури Спектрофотометрично изследване на реакционната система Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L 2+ След приготвяне на изходните разтвори с концентрация M на реагентите (метална сол и лиганди) в съответния буферен разтвор, комплексообразувателните процеси в системите Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L 2+ са проследени спектрофотометрично в интервала от 220 до 500 nm при различни реакционни условия (ph, молно съотношение на реагентите и време на протичане на реакцията) както следва: 1. За сиcтемите Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L 2+ (HL PAM; H2L 2+ - ВТ-07, ВТ-08, Обидоксим и ВТ-07-4М): ph 7.4 (буфер на Britton-Robinson), молно съотношение метал-лиганд от 1-10 до Спектрите са регистрирани непосредствено след смесване на реагентите и на 24 -ти, 48 -ми, 72 -ри и 168 -ми час; 2. За системата Pd(II) TMB-4: при ph 6 (фосфатен буфер 0.6 M), молно съотношение метален йон-лиганд от 1-10 до 10-1, регистрация на 0 - ев и 24 -ти час. Спектрите на лигандите при съответната киселинност на разтвора са регистрирани срещу базова линия на съответния буферен разтвор, а тези на оксиматните частици (анионна форма на лигандите) при алкални условия (излишък от Na2CO3 в твърдо състояние). Всички спектри на комплексните частици са регистрирани при съответната концентрация на металните(ii) соли като базова линия. Крайната концентрация на лигандите при всички реакционни условия е постоянна ( M). Стабилност на комплексните видове при реални условия (условни стабилитетни константи (β')) Условните стабилитетни константи (β') на новополучените комплексни частици, регистрирани при различна стойност на ph (6.0, 7.4) и време на реакция (0 -ев и 24 -ти час) са изчислени с помощта на уравнение 1 (Ур. 1), което се основава на следната реакция:

12 n Pd 2+ /Pt 2+ + HL + /H 2 L 2+ комплекс β = C комплекс n C Pd 2+ /Pt 2+ C H 2L 2+ /HL + (Ур. 1) В хода на експериментите възникна основен проблем, който е свързан с факта, че равновесието не се измества напълно в посока на правата реакция (т.е към комплексната форма). Поради тази причина класическите методи за обработка на експерименталните данни не могат да бъдат използвани за количествена оценка на комплексообраувателния процес, тъй като индивидуалните спектри на образуваните комплексни частици са неизвестни. Затова бе приложен Fishing Net Algorithm (FiNAl), специално разработен за количествен анализ на подобен вид системи. При прилагането на този подход са получени молните части на нереагиралите (x H2 L 2+ /HL +) и комплексообразуваните (x комплекс) оксимни видове във всеки разтвор, като е взето предвид първоначалното рн-зависимо превръщане на оксимните частици в оксиматни аниони (x L ). Както се вижда от уравненията по-долу (Ур. 2 и Ур. 3), молните части могат лесно да бъдат получени от общата концентрация на лиганда: 0 C H2 L 2+ /HL + = C H2 L 2+ /HL + + C ; C = C L + C комплекс (Ур. 2) 1 = x H2 L 2+ /HL + + x ; x = x L + x комплекс (Ур. 3), 0 където C H2 L 2+ /HL + е общата концентрация на лиганда, докато C H2 L 2+ /HL +, C L и C комплекс са равновесните концентрации на свободния нереагирал лиганд, първоначално формирания оксимат и на образувалия се комплекс при съответните експериментални условия

13 Молните части на комплексните частици са изчислени от общата молна част на оксиматните аниони x (Ур. 4): x комплекс = x x L (Ур. 4) Вследствие на тази трансформация уравнението за β' придобива следния вид (Ур. 5): β = x комплекс x H 2L 2+ /HL + 1 n (Ур. 5) C Pd 2+ /Pt 2+ представено при логаритмични условия (Ур. 6): lgβ = lg x комплекс n lg C x Pd 2+ H 2L 2+ /HL + /Pt2+ (Ур. 6), където броят на координираните метални йони (Pd 2+ /Pt 2+ ) (n) и стойностите на β' са пресметнати посредством графичното изобразяване на зависимостта lg x комплекс x H 2L 2+ /HL + от lg C Pd 2+ /Pt 2+. Определяне на чистотата на MPT и PO посредством газ-хроматографски анализ От инсектиците MPT (Mw = g/mol, ρ = 1.36 g/cm 3 ) и PO (Mw = g/mol, ρ = g/cm 3 ) са приготвени разтвори с приблизителна концентрация М в абс. EtOH. Определянето на тяхната чистота е извършено по метода на газовата хроматография с пламъчнойонизационен детектор (GC-FID) чрез абсолютна нормировка. Хроматографските условия, при които е анализиран всеки един от разтворите, са както следва: капилярна колона HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane (30.0 m, 320 µm вътрешен диаметър и 0.25 µm дебелина на филма), носещ газ хелий с поток 2.0 ml/min, температура на инжектора 250 C,

14 режим на работа без делене на потока (splitless) и температурна програма първоначална температура от 40 със задържане за 1 min, следвано от покачване с 10 /min до 280 и задържане за 5 min. Количеството на инжектираната проба е 1.0 µl. Приготвяне на разтвори на необходимите веществата за in vitro експериментално определяне на ензимна активност Изходните разтвори на металните соли и лигандите са приготвени в концентрации M (буфер на Britton-Robinson M с ph 7.4; само в системата с TMB-4 във фосфатен буфер с ph 6.0). Чрез смесване на подходящи съотношения от тях са получени съответните комплексни видове, необходими за целите на in vitro анализа, при постоянна концентрация на лигандите ( M). Изследваните комплексни видове са представени в Таблица 1. Инхибирането на холинестеразната активност в условия in vitro е извършено посредством пестицидите MPT и PO. От съответния изходен разтвор на всеки от двата инхибитора в абс. EtOH (PO М; MPT М) са приготвени, чрез разреждане в дейонизирана вода, серия от разтвори с различни концентрации, както следва: - при PO от до М; - при MPT от до М

15 Таблица 1. Реакционни системи Pd(II)/Pt(II) H2L 2+ /HL +, използвани за целите на in vitro изследванията Лиганд (L) Молно съотношение Pd(II):L Време за получаване на комплекса [h] 2-PAM BT BT TMB Обидоксим BT-07-4M Лиганд (L) Молно съотношение Pt(II):L Време за получаване на комплекса [h] 2-PAM BT BT Обидоксим BT-07-4M Процедура за инхибиране и реактивиране на холинестеразна активност в условия in vitro Контролна проба (100% ензимна активност): Към 200 µl 2% мозъчен хомогенат/хемолизат/серум се прибавят 50 µl дейонизирана H2O (краен обем 250 µl). Пробата се хомогенизира на vortex и се инкубира при 37 за 30 min. След изтичане на времето се поставя на ледена баня до момента на измерване на съответната ензимна активност

16 Инхибиране на ензимната активност: Към 200 µl 2% мозъчен хомогенат/хемолизат/серум се прибавят 25 µl инхибитор (от серията разредени разтвори) и 25 µl дейонизирана H2O (краен обем 250 µl). Пробата се хомогенизира на vortex и се инкубира при 37 за 30 min, след което се поставя на ледена баня до момента на измерване на съответната ензимна активност. Реактивиране на ензимната активност: Към 200 µl 2% мозъчен хомогенат/хемолизат/серум се прибавят 25 µl инхибитор в установената инхибираща концентрация, при която се достигат 55-65% инхибиране на 30 -тата min. Пробата се хомогенизира на vortex и се инкубира при 37 за 30 min. След изтичане на времето за инхибиране към пробата се добавят 25 µl RChE/метална сол/комплекс (краен обем 250 µl). Следва отново хомогенизиране и инкубиране при 37 за 30 min. След изтичане на времето за реактивиране пробата се поставя на ледена баня до момента на измерване на съответната ензимна активност. Всички експерименти са проведени трикратно. Определяне на активността на BuChE Активността на BuChE в серум се измерва чрез използването на готов кит (Chema Diagnostica) съгласно инструкциите на производителя. Определянето се извършва по кинетичен колориметричен метод, като концентрацията на ензима е обратно пропорционална на цветния преход (Фигура 1). Реакцията с участието на бутирилтиохолин се инициира чрез добавяне на следните проби: - серум, съдържащ само ензим (контролна проба); - серум, съдържащ пестицид (инхибирана ензимна активност); - серум, съдържаща пестицид и добавен впоследствие реактиватор (реактивирана ензимна активност). Полученият разтвор се темперира при 37 ºC в продължение на 90 s, след което започва отчитането на промяната на абсорбцията при 405 nm за

17 единица време до 3 min от реакцията. По зададения в инструкциите на производителя фактор се изчислява ензимната активност в U/L. бутирилтиохолин BuChE бутанова киселина тиохолин червена кръвна сол [Fe(CN) 6 ] 3- +e - [Fe(CN) 6 ] 4- жълта кръвна сол Фигура 1. Схематично представяне на реакцията за измерване на активността на BuChE Метод на Елман за определяне на AChE активност Определянето на мозъчна ацетилхолинестераза (brain-ache) и еритроцитна ацетилхолинестераза (RBC-AChE) е извършено по класическия метод на Елман. Под действието на ензима AChE субстратът на реакцията ацетилтиохолин йодид (ATChI) хидролизира до получаване на тиохолин, който реагира с реактива на Елман 5,5'-дитиобис(2- нитробензоена киселина) (DTNB) до образуване на цветно съединение с λmax = 420 nm. Концентрацията на двата ензима е право пропорционална на цветния преход (Фигура 2). Пробата за измерване се приготвя чрез смесване на следните реактиви: 650 µl 0.1 M фосфатен буфер ph 8.0, 50 µl 0.01 M DTNB и 10 µl M ATChI, към които се прибавят 25 µl от 2% мозъчен хомогенат или 5 µl от съответната проба хемолизат (т.е. контролна проба, проба с инхибирана ензимна активност, проба с реактивирана ензимна активност). Полученият разтвор се темперира при 37 ºC в продължение на 60 s, след което започва отчитането на промяната на абсорбцията при 420 nm за единица време до 4 min от реакцията. Полученият числен резултат за ензимната активност е представен в AU/min

18 AChE ацетилтиохолин оцетна киселина тиохолин DTNB Фигура 2. Схематично представяне на реакцията за измерване на активността на AChE Изчисляване на степента на инхибиране и реактивиране на ензимната активност Инхибиращият ефект на използваните инсектициди MPT и PO се изчислява съгласно Ур. 7: % Инхибиране = ( ЕА контрола EA инхибитор ЕА контрола ) 100 (Ур. 7), където: EAконтрола е ензимната активност на контролната проба; EАинхибитор е ензимната активност на инхибираната проба. Реактивиращият ефект на използваните лиганди и комплексни съединения се изчислява по Ур. 8: % Реактивиране = (1 ЕА контрола EA реактиватор ЕА контрола ЕА инхибитор ) 100 (Ур. 8), където: EAконтрола е ензимната активност на контролната проба; EАинхибитор е ензимната активност на инхибираната проба; EАреактиватор е ензимната активност на реактивираната проба

19 Резултати и обсъждане Експерименталната част на настоящия дисертационен труд е насочена към проучване на комплексообразуващите свойства на оксимните реактиватори 2-PAM (HL + ) и ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Обидоксим, ВТ-07-4М, (H2L 2+ ) спрямо йоните на Pd(II) и Pt(II). Химичните формули на прицелните оксими (Фигура 3) показват ясно, че избраните съединения се различават по своята структура. 2-PAM е представител на моно-пиридиниевите алдоксимни реактиватори на холинестеразата, като пиридиниевият азотен атом е свързан с метилова група, а оксимната група се намира на втора позиция в хетероароматното ядро. Останалите лиганди са симетрични бис-пиридиниеви диалдоксими, т.е. съставени са от два хетероароматни цикъла, свързани с метиленов или оксиметиленов мост и заместени с по една оксимна група на втора или на четвърта позиция. При Обидоксим мостът е оксиметиленов, а оксимните групи са на четвърта позиция и в двата пръстена. При TMB-4 и ВТ-07 двата хетероцикъла са свързани с пропилметиленов мост, а двете оксимни групи са съответно на четвърто (ТMB-4) и на второ място (BT-07) и в двете хетероядра. ВТ-07-4М и ВТ-08 съдържат бутилметиленов мост, като алдоксимните групи са заместени на четвърта (BT-07-4M) и на втора (BT- 08) позиция. Кватернизирането на пиридиниевия тип азотен атом в химичната структура на тези съединения обуславя техния положителен заряд. Това би затруднило взаимодействието с положително заредени метални йони, и съответно изолирането на евентуално новополучените частици в твърдо състояние. От друга страна, обаче, наличието на оксимна група в химичната структура на алдоксимите създава възможност за комплексообразуване и предполага, че тези реактиватори на холинестеразата могат да действат като потенциални лиганди, способни да координират метални йони

20 2-PAM ВТ-07 (K005) ВТ-08 (K033) TMB-4 Обидоксим ВТ-07-4М (K074) Фигура 3. Структурни формули на оксимни RChE

21 Спектрофотометрична оценка на координационната способност на кватернерни моно- и бис-пиридиниеви алдоксими Понастоящем електронната (UV-Vis) спектроскопия е найподходящият метод за мониториране на комплексообразувателните реакции, когато лигандите поглъщат в ултравиолетовата и/или видимата област на електромагнитния спектър, по няколко причини: 1. Методът е приложим при относително ниски концентрации на изследваните вещества, което избягва усложнения, свързани с явления като асоцииране, агрегиране и др.; 2. Измерванията са възможни в различни разтворители (вкл. вода); 3. Математическият апарат за изследване на комплексообразувателни процеси е добре дефиниран от закона на Буге-Ламбер-Беер; Абсорбционните спектри на алдоксимните съединения при ph 7.4 (буфер на Britton-Robinson) в интервала от 220 до 500 nm, са представени на Фигури 4 и 5 (плътни линии). Само при TMB-4 е използван фосфатен буфер с ph 6.0. От молекулните спектри на лигандите ясно се вижда, че 2-PAM, BT- 07 и BT-08 поглъщат максимално в диапазона nm, докато Обидоксим, TMB-4 и BT-07-4M в интервала nm. Тези резултати показват, че положението на оксимните групи, т.е. смяната на 2 -ра с 4 -та позиция в кватернерния пиридиниев пръстен, предизвиква хипсохромно отместване на абсорбционния максимум. При рн 7.4 се извършва частично превръщане на оксимите в оксимат, видимо от по-слабо интензивната абсорбционна ивица в интервала nm, което е в съгласие с публикуваните по-рано данни. При ph 6.0 TMB-4 съществува само в оксимната си форма

22 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 Absorbance [A] 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 2-PAM ВТ-07 ВТ-08 0,2 0,1 0, λ [nm] Фигура 4. UV-Vis абсорбционни спектри на 2-PAM, ВТ-07 и ВТ-08 (плътна линия при ph 7.4; пунктир при алкални условия) Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 Обидоксим 0,8 0,7 TMB-4 0,6 ВТ-07-4М 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Фигура 5. UV-Vis абсорбционни спектри на Обидоксим, ВТ-07-4М и TMB- 4 (плътна линия при ph 7.4/6.0; пунктир при алкални условия) Абсорбционните ивици, представени с плътни линии в горепосочените фигури, илюстрират протонирата форма (HL + /H2L 2+ ) на лигандите и тяхното частично превръщане в оксимат при ph 7.4. В присъствието на излишък от Na2CO3 се извършва депротониране на лигандите, което предизвиква максимално поглъщане на оксиматния анион в интервала nm (прекъснати линии във Фигури 4-5)

23 Absorbance [A] Абсорбционният максимум, отговарящ на йонизирането на оксимната група, е резултат от протичащите π- π* преходи в ароматната система. Време-зависимите промени, които настъпват в лигандите при ph 7.4/6.0 и в алкални условия, са регистрирани в рамките на една седмица след тяхното разтваряне (при TMB-4 на 0 -ев и 24 -ти час) с цел проследяване стабилността на съединенията при конкретните условия. Данните са представени на Фигури Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 Обидоксим 0,8 0,7 TMB-4 0,6 ВТ-07-4М 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Фигура 6. Време-зависими абсорбционни спектри на 2-PAM (плътна линия ph 7.4, пунктир алкални условия) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ч 24 ч 48 ч 72 ч 168 ч 0, λ [nm] Фигура 7. Време-зависими абсорбционни спектри на ВТ-07 (плътна линия ph 7.4, пунктир алкални условия)

24 1,2 Absorbance [A] 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ч 24 ч 48 ч 72 ч 168 ч 0, λ [nm] Фигура 8. Време-зависими абсорбционни спектри на ВТ-08 (плътна линия ph 7.4, пунктир алкални условия) Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 0 ч 1,3 1,2 24 ч 1,1 1,0 48 ч 0,9 0,8 72 ч 0,7 0,6 168 ч 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Фигура 9. Време-зависими абсорбционни спектри на Обидоксим (плътна линия ph 7.4, пунктир алкални условия)

25 Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 0 ч 1,3 1,2 24 ч 1,1 1,0 48 ч 0,9 0,8 72 ч 0,7 0,6 168 ч 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Фигура 10. Време-зависими абсорбционни спектри на ВТ-07-4М (плътна линия ph 7.4, пунктир алкални условия) 0,9 0,8 0,7 Absorbance [A] 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0 ч 24 ч 0,1 0, λ [nm] Фигура 11. Време-зависими абсорбционни спектри на TMB-4 (плътна линия ph 6.0, пунктир алкални условия) Експерименталните резултати показват, че при някои от изследваните съединения с течение на времето се наблюдава хипохромен ефект за абсорбционните максимуми, отнесени както към протонираната (оксимна), така и към депротонираната (оксиматна) форма на лигандите. Този факт е показателен за известна нестабилност на реактиваторите в разтвор и вероятно е свързан с протичането на деградационен процес. От анализа на спектралните данни може да се заключи, че най-съществени

26 промени се наблюдават при ВТ-07 и ВТ-08 (особено в анионната им форма), които са бис-пиридиниеви алдоксими и съдържат оксимни групи на второ място в хетероядрата. При останалите изследвани реактиватори приносът на разпадния процес е незначителен. В хода на експериментите е установено, че добавянето на йони на Pd(II)/Pt(II) към разтвори на оксимите предизвиква тяхното спонтанно депротониране, като този процес зависи от молното съотношение метален(ii) йон-лиганд в изследваната система. Нарастващите количества метален(ii) йон обуславят намаляване на абсорбционния максимум на ивицата, отговаряща за оксимната група в интервала nm, и нарастване на този в диапазона nm. Процесът е независим от киселиността на разтвора на 0 -ев час (ph 6.0 за ТBM-4 и ph 7.4 за останалите оксими), но с течение на времето отново се наблюдават хипохромни отмествания и промени в спектралните характеристики, които предполагат протичането на съпътстващи странични (вероятно деградационни) процеси. Промените в реакционната смес, съдържаща Pd(II) йони и Обидоксим в молни съотношения метален(ii) йон-лиганд от 1-10 до 10-1, регистрирани при ph 7.4 в интервала 0 -ев ми час, са представени на Фигура 12. От анализа на спектралните данни може да се отбележи, че реакцията между Pd(II) и изследваните лиганди протича бързо и се осъществява непосредствено след смесване на реагентите. Депротонирането на оксимите в присъствието на паладиеви(ii) йони е съпътствано и от тяхното координиране, т.к. спектрите на реактиваторите под действие на Na2CO3 (оксиматна форма) се различават от тези, наблюдавани в системите Pd(II)-HL + /H2L 2+, дори и при значителен излишък на металните йони. Последните са хипо- и батохромно отместени, като тази спектрална характеристика предполага участие на оксиматната(-ите) група(-и) в допълнително взаимодействие, дължащо се на наличието на Pd(II) йони. На Фигура 13 са представени абсорбционните

27 спектри на Обидоксим в оксимната и оксиматната му форми, както и в присъствие на Pd(II) йони. 1,2 1,1 0 h Absorbance [A] 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 изобестична точка ,1 1,0 24 h 0, λ [nm] 1,1 48 h 1,0 Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,1 0, λ [nm] 1,1 72 h 1,0 0, λ [nm] 1,1 168 h 1,0 Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,1 0,0 0, λ [nm] λ [nm] Фигура 12. Време-зависими UV-Vis спектри на системата Pd(II)- Обидоксим при нарастващи молни отношения метален(ii) йон лиганд

28 Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 1 0,8 2 0,7 3 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Фигура 13. UV-Vis спектри на Обидоксим два: оксимна форма (1), оксиматна форма (2) и в присъствие на Pd(II) йони (3), молно съотношение метален(ii) йон-лиганд = 2-1, 0 -ев час Стабилността на получените нови комплексни видове е времезависима, като скоростта на протичащите странични процеси е свързана значително с молното отношение Pd(II)-лиганд и вида на оксима (моноили бис-). Данните показват, че позицията на оксимната група (2 -ра, 4 -та ) и произходът на моста не повлияват съществено промените в изследваните системи. Така, при реакционната система Pd(II)-2-PAM (моно-пиридиниев алдоксим с една оксимна група на втора позиция в ароматното ядро) протичането на странични реакции се наблюдава още на 24 -тия час. При бис-алдоксимите ВТ-07 и ВТ-08 (2 -ра позиция на оксимните групи) и техните аналози TMB-4, Обидоксим и ВТ-07-4М (4 -та позиция на оксимните групи) промените в спектралните характеристики започват по-късно и са забележими на 48 -мия час. При всички случаи излишъкът на паладиеви(ii) йони потенцира нежеланите процеси, но при недостиг на метални йони или стехиометрично отношение Pd(II)-лиганд = 1:1 промените са незначителни и стабилността на комплексните видове се запазва през целия изследван едноседмичен период

29 От координационна гледна точка интерес представлява сравнението на ефектите на паладиевия(ii) йон с тези на структурния му аналог платина(ii), ето защо бяха проведени подобни едноседмични изследвания върху способността на оксимите 2-PAM, ВТ-07, ВТ-08, Обидоксим и ВТ-07-4М да взаимодействат с йоните на Pt(II). Представителни спектрални криви на реакционната система, съдържаща Pt(II) и Обидоксим (ph 7.4, молни отношения Pt(II)-лиганд от 1-10 до 10-1), регистрирани във времевия интервал 0 -ев ми час, са показани на Фигура 14. Absorbance [A] 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Absorbance [A] 1,3 0 h 1,2 1,1 1, , , , , , , , , ,1 0, λ [nm] 24 h Absorbance [A] 1,2 48 h 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, , λ [nm] 1,1 72 h 1,0 0, λ [nm] 1,1 168 h 1,0 Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,1 0,0 0, λ [nm] λ [nm] Фигура 14. Време-зависими спектрални промени в системата Pt(II)- Обидоксим при нарастващи молни отношения метален йон(ii) лиганд

30 Както йоните на Pd(II), така и тези на Pt(II) предизвикват депротониране на изследваните алдоксими, но взаимодействието протича с по-ниска скорост и се наблюдава образуване на комплексни частици едва на 24 -тия час след смесване на реагентите. За разлика от бавното установяване на равновесния процес, следващото протичане на страничните реакции е ускорено (в сравнение с Pd(II)-съдържащите системи), като отново най-значителни промени се наблюдават при излишък на йоните на платина(ii). В заключение, спектрофотометрично е изследвана способността на серия реактиватори на холинестеразата да взаимодействат с йони на паладий(ii) и платина(ii): - Реакцията протича по-бързо в присъствие на Pd(II) в сравнение с Pt(II), но и при двата метални йона се наблюдава депротониране и координиране на оксимните лиганди под формата на оксимати; - Новообразуваните комплексни частици се характеризират със спектрална ивица, която търпи хипо- и батохромно отместване в сравнение с некоординираната оксиматна форма на алдоксимите; - Наличието на изобестична точка при всички изследвани системи е показателно за установяването на химично равновесие, което не се изтегля напълно към крайните продукти. Поради тази причина индивидуалните спектрални характеристики на новополучените комплексни видове са неизвестни; - Положителният заряд на изходните кватернерни алдоксими се запазва в координационните съединения на Pd(II) и Pt(II), като до момента не са намерени подходящи реакционни условия за изолиране на комплексните видове в твърдо състояние; - Както в спектрите на свободните лиганди, така и в тези на системите, съдържащи метален(ii) йон и реактиватор, се наблюдават време-зависими промени, дължащи се на протичането на странични процеси. Последните са свързани с вида на реактиватора (моно- или бис-алдоксим) и количеството на Pd(II)/Pt(II) йони в разтвора, но не се повлияват значително от позицията на оксимните групи и произхода на моста, свързващ бис-пиридиниевите съединения

31 Стабилност на новополучените комплекси (условни стабилитетни константи (β')) На база проведените спектрофотометрични изследвания, комплексообразувателният процес, който протича, може да бъде изразен чрез следното химично уравнение: n Pd 2+ /Pt 2+ + HL + /H 2 L 2+ комплекс, където HL + е 2-PAM, H2L 2+ ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Обидоксим и ВТ-07-4М. Степента, в която са асоциирани комплексообразувателят (Pd(II)/Pt(II)) и лигандите (HL + /H2L 2+ ), характеризира стабилността на получената комплексна частица. Равновесната константа, показваща доколко процесът е изтеглен в посока на правата реакция, служи като количествена мярка за тази стабилност. Тя се нарича обща стабилитетна константа и се бележи с β. Стойността ѝ може да бъде изчислена по Ур. 1 (от експерименталната част), но при идеални условия. В реалните експерименти повечето от комплексообразувателните процеси са равновесни, но и съпътствани от странични реакции. В този случай се въвежда условната стабилитетна константа (β'), която отчита конкретните условия, при които протича изучаваният комплексообразувателен процес. Определянето на стабилността на комплексните съединения намира приложение в области като химия, наука за околната среда, токсикология, военна токсикология, криминалистика, катализа, качество и консервиране на храните и т.н. За целите на токсикологията, и по-конкретно на военната токсикология, определянето на стойностите на β' на целевите координационни съединения, обект на настоящата дисертация, е от изключително важно значение за евентуалното им приложение в антидотната терапия при отравяне с ФОС. В хода на експериментите бе установено, че равновесието в системите метален(ii) йон оксим не се изтегля напълно към комплексната форма, дори и при голям излишък на Pd(II)/Pt(II). Поради тази причина индивидуалните спектри на образуваните комплексни частици са

32 неизвестни и класическите методи за обработка на спектралните данни не са приложими за количествена оценка на комплексообразувателния процес. За да се избегне това затруднение, бе използвана процедурата Fishing Net Algorithm (FiNAl), специално разработена за количествен анализ на подобен вид системи. В резултат от прилагането на този подход са изчислени молните части на нереагиралите лиганди (x H2 L 2+ /HL +) и комплексообразуваните оксиматни (x комплекс ) видове във всеки разтвор. Отчетено е и първоначалното рн-зависимо превръщане на оксимите в оксиматни аниони (x L ). Трябва да се отбележи, че протичането на време-зависимите странични реакции затруднява прилагането на FiNAl и налага ограничения при изчисляване на съответните молни части на комплексите, което от своя страна намалява броя спектрални данни, използвани при обработката. Отчитането на съпътстващите процеси доведе до избор на следния набор от данни, представен в Таблица 2. Математическият апарат за изчисляване стойностите на молните части и условните стабилитетни константи на новополучените координационни съединения е представен подробно в раздел Експериментална част на дисертационния труд. Съгласно Ур. 6, построяването на логаритмична зависимост на x комплекс x реактиватор от концентрацията на металния(ii) йон позволява извеждането на линейното уравнение y = ax + b, където а отразява броя комплексообразуватели, включени в състава на комплекса, b стойността на условната стабилитетна константа

33 Таблица 2. Спектрални данни, използвани в процедурата FiNAl Молно съотношение Система Pd(II)-лиганд Pd(II)-лиганд Времеви интервал 2-PAM ев час ВТ ев час ВТ ев час TMB ев час Обидоксим ев час, 24 -ти час ВТ-07-4М ев час, 24 -ти час Система Pt(II)-лиганд Молно съотношение Pt(II)-лиганд Времеви интервал 2-PAM ти час ВТ-07 1: ти час ВТ-08 1: ти час Обидоксим ти час ВТ-07-4М 1: ти час На Фигура 15 са показани представителни графики на тази зависимост за системата Pd(II)-Обидоксим, получени непосредствено след смесване на реагентите и на 24 -ти час. 1,1 1,5 0,8 1,2 0,5 0,2 y = 1,47x + 6,52 R² = 0,9874 0,9 0,6 y = 1,97x + 9,34 R² = 0,9927 lg -0,1-5,5-5,3-5,1-4,9-4,7-4,5-4,3-4,1-3,9-3,7-0,4 lg 0,3 0,0-5,5-5,3-5,1-4,9-4,7-4,5-4,3-4,1-0,3-0,7-0,6-1,0-0,9-1,3-1,2-1,6-1,5 Фигура 15. Графичнa зависимост на lg(xкомплекс/x H2 L 2+) от lgc Pd2+ за системата Pd(II)-Обидоксим на 0 -ев (ляво) и 24 -ти (дясно) час

34 Обработката на експерименталните данни показва, че в изследваните Pd(II)-съдържащи системи бис-алдоксимите могат да участват в два типа комплексни частици със състав [PdHL] 3+ и/или [Pd2L] 4+, който зависи от позицията на оксимната група в структурата на реактиватора. Лигандите BT-07 и BT-08, съдържащи оксимни групи на 2 -ра позиция, координират два паладиеви катиона, образувайки само комплексни видове със състав [Pd2L] 4+. Обидоксим и ВТ-07-4М, притежаващи по две оксимни групи на четвърта позиция в пиридиниевите цикли, взаимодействат до получаването на два вида комплексни частици със състав [PdHL] 3+ (0 -ев час) и [Pd2L] 4+ (24 -ти час), докато реакцията с TMB- 4 протича с формирането само на [PdHL] 3+. Моно-алдоксимът 2-PAM координира един Pd(II) йон, при което се получава комплекс със състав [PdL] 2+. Свързването на йоните на платина(ii) протича по-бавно в сравнение с Pd(II), като бис-оксимите образуват само един вид комплексни частици със състав [PtHL] 3+ в рамките на 24 часа след смесване на реагентите. Не се наблюдава съществуването на частици със състав [Pt2L] 4+ при нито един от изследваните бис-пиридиниеви лиганди, най-вероятно поради протичащите по-бързо странични реакции, отколкото в случая на Pd(II)- съдържащите реакционни системи. Данните за изчислените условни стабилитетни константи на наблюдаваните частици са обобщени в Таблица 3. В научната литература съществува много ограничена информация относно способността на холинестеразните реактиватори да образуват комплексни съединения. В рамките на настоящия дисертационен труд за първи път са изследвани протичащите процеси между кватернерни алдоксими и двузарядните метални йони на паладий и платина

35 Таблица 3. Стойности на logβ' на реакционните системи Pd(II)/Pt(II)-HL + /H2L 2+ Система Pd(II)-лиганд Комплексна частица logβ' R 2 2-PAM [PdL] BT-07 [Pd2L] BT-08 [Pd2L] TMB-4 [PdHL] Обидоксим BT-07-4M [PdHL] [Pd2L] [PdHL] [Pd2L] Система Pt(II)-лиганд Комплексна частица logβ' R 2 2-PAM [PtL] BT-07 [PtHL] BT-08 [PtHL] Обидоксим [PtHL] BT-07-4M [PtHL] Установено е, че моно- и бис-пиридиниевите алдоксими 2-PAM, BT- 07, BT-08, TMB-4, Обидоксим и BT-07-4M, в присъствието на йони на Pd(II) или Pt(II), участват в сложен равновесен процес, при който се получават положително заредени комплексни видове. Изчислените условни стабилитетни константи ( ) предполагат образуването на стабилни в разтвор частици, но към настоящия етап от изследванията не са намерени специфични условия за тяхното привеждане в твърда фаза. От наличните досега експериментални данни е силно спекулативно да се предложи точен начин на свързване на изследваните лиганди със съответния метален(ii) йон. Получените резултати са добра отправна точка в търсенето на различни подходи, които да позволят изолиране на съединенията в чист вид и с определен състав, което от своя страна ще даде възможност за тяхното структурно характеризиране

36 В заключение, взаимодействието на моно- и бис-кватернерните пиридиниеви алдоксими 2-PAM, BT-07, BT-08, Обидоксим и BT-07-4M с йони на Pd(II) при ph 7.4 и на ТМВ-4 при ph 6.0 води до формирането на частици, съдържащи един и/или два метални(ii) йона в зависимост от химичната структура на лигандите (т.е. позицията на оксимните групи) и времето за протичане на реакцията. За разлика от Pd(II)-съдържащите системи, комплексообразувателният процес между 2-PAM, BT-07, BT-08, Обидоксим и BT-07-4M и катионите на Pt(II) при ph 7.4 протича по-бавно с наблюдаването само на моноядрени комплексни видове. Новополучените частици, особено тези, съдържащи два метални(ii) центъра, притежават значителна стабилност в разтвор. Реактивиращ потенциал на новосинтезираните съединения спрямо инхибирани еритроцитна/мозъчна AChE и BuChE Част от изследваните в дисертационния труд реактиватори на холинестеразата са утвърдени антидоти на ФОС в цивилната клинична практика или във военната токсикология (2-РАМ, TMB-4 и Обидоксим). Свързването им под формата на Pd(II)/Pt(II)-съдържащи частици изисква оценка на ефекта, който металният(ii) йон би оказал върху техния реактивиращ потенциал. За целта са проведени in vitro изследвания с ензимите ацетил- (AChE) и бутирил- (BuChE) холинестераза, инхибирани от фосфорорганичните пестициди метилпаратион (MPT) и параоксон (PO). Последните намират широко приложение в експерименталната токсикология, включително в качеството си на сурогатни (заместващи) съединения на нервните агенти. Първоначално е определена чистотата на използваните пестициди. Анализът е извършен чрез газова хроматография с пламъчнойонизационен детектор (GC-FID). Количеството ФОС е изчислено по

37 метода на абсолютната нормировка; получените хроматограми са представени на Фигури pa pa time Фигура 16. Хроматограма на препарата, съдържащ метилпаратион time Фигура 17. Хроматограма на параоксон В резултат на извършеното изследване е установено, че чистотата на MPT е 65.3%, докато тази на PO е 93.4%. При последващите опити in vitro във всички използвани разтвори концентрацията на даденото фосфорорганично съединение е преизчислена спрямо тези получени данни

38 Основен етап в in vitro изследванията е определянето на концентрацията на ФОС, необходима за 60-80% инхибиране на холинестеразите, което е свързано със състояние на тежка интоксикация, но с възможност за реактивация на ензимите. За целта е изследвана инхибиращата способност на серия от разтвори на използваните пестициди с концентрация от М до М (РО) и от М до М (MPT). В експериментите с мозъчна AChE е установено, че MPT ( М) и РО ( М) предизвикват 77.75% и 71.49% инхибиране на ензима. Активността на еритроцитната AChE (RBC-AсhE) е повлияна от MPT ( М) със 72.96% и със 76.54% от РО ( M). Пестицидите инхибират BuChE с 65.00% ( M MPT) и 68.96% ( M РО). Получените данни представляват основа за оценяване на реактивиращия потенциал на алдоксимите и техните комплекси с Pd(II) и Pt(II) йони, като в следващите експерименти са използвани посочените концентрации на ФОС. Крайната концентрация на лигандите във всички изследвани системи е М. Източник на новополучените съединения представляват реакционните системи метален(ii) йон лиганд, приготвени непосредствено преди експеримента или 24 часа по-рано, в зависимост от наблюдаваните комплексни видове. Резултатите относно реактивирането на инхибираните ензими AChE и BuChE са представени в Таблици 4-6. Класическите алдоксими (2-PAM, TMB-4 и Обидоксим) са успешни реактиватори на мозъчната AChE, инхибирана от PO (40-60% реактивация), но притежават незначителен ефект върху действието на MPT (4-6%). Реактивиращата способност на изследваните комплекси на тези оксими с Pd(II) йони значително намалява в сравнение с тази на некоординираните лиганди. Въпреки това, при инхибирана с PO мозъчна AChE, активността на [PdL] 2+ (2-PAM) и [PdHL] 3+ (ТМВ-4, Обидоксим) надвишава 10%, което показва техния потенциал в тази насока. По отношение на комплексните съединения на 2-PAM и Обидоксим с йони на

39 Pt(II), получените данни са много близки до активността на изходните лиганди, но тук трябва да се отбележи повишената ефективност на Pt(II)- съдържащия Обидоксим срещу действието на MPT, която значително надвишава реактивацията на некоординирания оксим. Таблица 4. Реактивиращ потенциал (в %) на оксимните RChE и техните Pd(II)/Pt(II) съединения спрямо инхибирана мозъчна AChE RChE, инхибитор Оксим Комплексно съединение, съдържащо n йони на Pd(II)/Pt(II) n = 1 Pd(II) n = 2 Pd(II) n = 1 Pt(II) 2-PAM, MPT 4.02 ± ± ± 0.68 ВТ-07, MPT ± ± ± 0.93 ВТ-08, MPT ± ± ± 0.68 TMB-4, MPT 6.41 ± ± Обидоксим, MPT 6.56 ± ± ± ± 0.26 ВТ-07-4М, MPT ± ± ± ± PAM, PO ± ± ± 1.38 ВТ-07, PO ± ± ± 1.86 ВТ-08, PO ± ± ± 1.62 TMB-4, PO ± ± Обидоксим, PO ± ± ± ± 0.92 ВТ-07-4М, PO ± ± ± ± 1.84 По-новите оксимни реактиватори ВТ-07, ВТ-08 и ВТ-07-4М също осигуряват висока степен на реактивация (40-60%) на инхибирана с PO мозъчна AСhE, но за разлика от класическите реактиватори, проявяват и повишена активност спрямо ефектите на МРТ (16-25%). Реактивиращата способност на [PdHL] 3+ (ВТ-07-4М) и [Pd2L] 4+ (ВТ-07, ВТ-08 и ВТ-07-4М) е

40 съществено понижена в сравнение с тази на лигандите и при двата инхибиращи пестицида. Срещу действието на параоксон само активността на комплекса на ВТ-08 с Pd(II) ([Pd2L] 4+ ) надхвърля 10%, което показва известен реактивиращ потенциал. Платиновите(II) производни на ВТ-07, ВТ-08 и ВТ-07-4М ([PtHL] 3+ ) осигуряват значително възстановяване на ензимната активност при инхибиране с PO (53-66%), като дори комплексът на ВТ-07 с Pt(II) надвишава реактивацията на некоординирания лиганд с 10%. В случая, когато инхибиторът е метилпаратион, се отчита задоволителна степен на ефективност, която е най-висока при Pt(II)- съдържащите оксими ВТ-07-4М и ВТ-08. Реактивиращият ефект на класическите антидоти и техните комплекси върху инхибирана с ФОС еритроцитна AChE (Таблица 5) следва тенденциите, наблюдавани при мозъчна AСhE. Тук трябва да се отбележи, че приложени в еквимолни концентрации, утвърдените в практиката оксими по-слабо възстановяват RBC-AChE (16-48%) в сравнение с brain-ache (40-60%) при интоксикация с РО, и на практика са неефективни срещу MPT. Комплексите на 2-PAM ([PdL] + ), TMB-4 ([PdHL] 3+ ) и Обидоксим ([Pd2L] 4+ ) отново проявяват слабо действие и при двата използвани пестицида, но присъствието на йони на Pt(II) значително усилва ефекта на изходния Обидоксим при инхибиранa с параоксон RBC- AChE. Сред оксимите от ново поколение най-изразен ефект върху действието на РО при инхибирана RBC-AChE показват ВТ-08 и ВТ-07-4М ( 60%), докато третият представител ВТ-07 проявява значително намален реактивиращ потенциал в сравнение с този при мозъчна AChE. Паладиевите(II) производни на ВТ-08 ([Pd2L] 4+ ) и ВТ-07-4М ([PdHL] 3+ ) притежават реактивираща активност, по-висока от 35%, но все пак съществено редуцирана спрямо тази на изходните лиганди

41 Таблица 5. Реактивиращ потенциал (в %) на оксимните RChE и техните Pd(II)/Pt(II) съединения спрямо инхибирана RBC-AChE RChE, инхибитор Оксим Комплексно съединение, съдържащо n йони на Pd(II)/Pt(II) n = 1 Pd(II) n = 2 Pd(II) n = 1 Pt(II) 2-PAM, MPT 1.89 ± ± ± 1.04 ВТ-07, MPT ± ± ± 0.60 ВТ-08, MPT ± ± ± 0.77 TMB-4, MPT 0.40 ± ± Обидоксим, MPT 0.35 ± ± ± ± 0.68 ВТ-07-4М, MPT ± ± ± ± PAM, PO ± ± ± 1.24 ВТ-07, PO ± ± ± 1.17 ВТ-08, PO ± ± ± 1.09 TMB-4, PO ± ± Обидоксим, PO ± ± ± ± 0.31 ВТ-07-4М, PO ± ± ± ± 1.63 Комплексообразуването с Pt(II) намалява потенциала на ВТ-08, докато ефектът на металните(ii) йони е благоприятен в системата Pt(II)- ВТ-07-4М, където се наблюдава 10% нарастване на реактивиращата способност. Изключение правят комплексите на ВТ-07 ([Pd2L] 4+ и [PtHL] 3+ ), които са напълно неспособни да неутрализират действието на параоксон. Макар и ефективни в случая на инхибирана с MPT RBC-AChE, оксимите ВТ-07, ВТ-08 и ВТ-07-4М са с по-слабо изразено действие (12-13%) в сравнение с ефекта им при мозъчна АChE. Комплексообразуването с йоните на Pd(II) и Pt(II) запазва свойствата на реактиваторите, като измерената активност варира в рамките на 10-15%

42 Както бе дискутирано в литературния обзор, ензимът бутирилхолинестераза (BuChE) може да взаимодейства с антихолинестеразни съединения, което го превръща в естествена бариера за нервни агенти и фосфорорганични пестициди. Освен това е изказано и предположението, че AChE реактиватори, използвани за лечение на интоксикации с ФОС, могат да възстановяват и активността на инхибирана BuChE. С цел проверка на тази хипотеза, реактивиращият потенциал на изследваните оксими и техните метални(ii) производни е оценен в условия in vitro срещу инхибирана с РО и МРТ BuChE (Таблица 6). Получените резултатите показват, че всички оксими (класически и от по-новата генерация), както и техните комплекси с йоните на Pd(II) и Pt(II), практически са неспособни да реактивират BuChE, блокирана от параоксон. Различна е ситуцията при инхибитора метилпаратион, където се наблюдава активност, макар и в незадоволителни граници (2-10%). Тук трябва се обърне внимание на системата [Pd2L] 4+ в случая на алдоксима ВТ-08, при която е регистириран два пъти по-висок потенциал в сравнение с този на свободния (некоординиран) лиганд. Представените данни потвърждават, че серумната холинестераза е естествена бариера пред високотоксичните ФОС, като се свързва достатъчно здраво с тях и по този начин частично (поне) неутрализира техния ефект (т.е. изпълнява ролята на нативен скавенджър). Силно понижената реактивираща способност, вкл. и на утвърдените в практиката антидоти на ФОС, вероятно се дължи на бързи и необратими промени в структурата на ензима под действие на инхибиторите, които не позволяват възстановяване на холинестеразната активност. Макар, че механизмът на инактивиране на BuChE не е изучен в детайли, процесът на ензимно стареене би могъл да има съществен принос в предполагаемите причини за наблюдаваната ниска реактивация на бутирилхолинестеразата

43 Таблица 6. Реактивиращ потенциал (в %) на оксимните RChE и техните Pd(II)/Pt(II) съединения спрямо инхибирана BuChE RChE, инхибитор Оксим Комплексно съединение, съдържащо n йони на Pd(II)/Pt(II) n = 1 Pd(II) n = 2 Pd(II) n = 1 Pt(II) 2-PAM, MPT 4.14 ± ± ± 0.76 ВТ-07, MPT 6.41 ± ± ± 1.76 ВТ-08, MPT 4.70 ± ± ± 0.88 TMB-4, MPT 3.07 ± ± ± Обидоксим, MPT 5.88 ± ± ± ± 0.68 ВТ-07-4М, MPT 2.52 ± ± ± ± PAM, PO ± ± ± 1.61 ВТ-07, PO ± ± ± 1.55 ВТ-08, PO ± ± ± 0.45 TMB-4, PO ± ± Обидоксим, PO ± ± ± ± 0.76 ВТ-07-4М, PO ± ± ± ± 1.35 В контекста на получените резултати следва да се отбележи, че част от изследваните съединения (вкл. и от новополучените комплексни частици) притежават значителен реактивиращ потенциал, особено при инхибирана с параоксон мозъчна AChE. В научната литература е възприето, че оксимни съединения, демонстрирали в опити in vitro реактивация, по-висока от 10%, следва да бъдат подложени на допълнителни изследвания за антидотна ефективност. Ето защо, данните в настоящия дисертационен труд могат да послужат за отправна точка на нови експерименти, и знанията относно свойствата на RChE и техните модификации да бъдат разширени и надградени

44 Както вече бе отбелязано, при оценяване на реактивиращия потенциал на оксимни RChE, приложени самостоятелно или под формата на комплексни съединения, следва да се вземат под внимание два важни фактора, а именно каква е структурата на използвания инхибитор от една страна, и от друга какво представлява оксимният реактиватор. По отношение на първия случай типичен пример е реактивирането на табун-инхибирана AChE табунът съдържа в молекулата си една цианидна група, за която е доказано, че силно затруднява ориентацията на оксима, а оттам и успешната атака на оксиматния анион спрямо фосфорилирания ензим. Друг пример за ролята на химичната структура на инхибитора е промяната, която настъпва в холинестеразата, инактивирана от зоман. Последният притежава способността да участва в много бързо протичаща реакция, водеща до монодеалкилиране на фосфорния остатък в комплекса инхибитор-ензим (зоман-ache), след което способността на реактиваторите да възстановят ензимната активност е практически нулева. В този случай определящият етап е т.нар. процес на стареене на инхибирания ензим, при което настъпващите структурни промени са необратими. Другият важен фактор, а именно химичната структура на оксимния реактиватор, е от съществено значение за успешното атакуване на инхибирания активен център на холинестеразата. Например, инхибирана с табун AChE успешно се реактивира от симетрични биспиридиниеви оксими, съдържащи метиленов или метиленоксиметиленов мост и оксимни групи, разположени на 4 -та позиция в пиридиниевите ядра. Резултатите от предходни изследвания, проведени във ВМА, ясно показват, че прилагането на ВТ-07-4М постига висока степен на реактивация на инхибирана от табун мозъчна AСhE, и то значително подобра в сравнение с Обидоксим

45 На този етап от in vitro изследванията относно реактивиращия потенциал на изследваните алдоксими и техните Pd(II)/Pt(II) производни, може да се направят следните обобщения: - Утвърдените в практиката алдоксими 2-РАМ, ТМВ-4 и Обидоксим са много добри реактиватори на инхибирана с параоксон мозъчна AChE (40-60%) и умерено ефективни при еритроцитна AChE (15-45%). Интоксикацията с метилпаратион не се повлиява съществено от използваните антидоти и при двата вида AChE. Класическите оксими, на практика, не възстановяват активността на BuChE, инхибирана с изследваните моделни ФОС PO и MPT. - Представителите на новото поколение реактиватори BT-07, BT-08 и BT-07-4M повлияват значително действието на инхибитора параоксон, и в по-ниска степен това на метилпаратион. Тези ефекти са силно изразени при инхибирана мозъчна AChE, относителни добри при инактивирана еритроцитна AChE, и слаби при BuChE. - Като цяло, активността на Pd(II)/Pt(II)-съдържащите алдоксими е занижена в сравнение с тази на изходните лиганди. Това вероятно може да се обясни с факта, че протича взаимодействие между металните(ii) йони и образуваните оксимати, което е достатъчно стабилно и блокира действието на реактиваторите. - От друга страна, повишеният потенциал на определени метал(ii)- съдържащи системи за възстановяване на холинестеразната активност, показва, че изследваните процеси зависят от редица фактори, чието влияние е комплексно и предстои да бъде допълнително оценено. - Сред изследваните производни на прицелните алдоксими следва да се отбележат тези, при които се наблюдава потенцирана активност спрямо тази на некоординираните лиганди, а именно [PtHL] 3+ при инхибирана с MPT (ВТ-07) или РО (Обидоксим) мозъчна AChE, и при инактивирана с РО RBC-AChE (Обидоксим и ВТ-07-4М)

46 Изводи 1. Класическите реактиватори на холинестеразата (2-PAM. TMB-4, Обидоксим) и тези от по-нова генерация (BT-07, BT-08, BT-07-4M) взаимодействат с йони на паладий(ii) и платина(ii) във водни разтвори до получаването на комплексни съединения. 2. Новите производни на бис-алдоксимите съдържат един или два метални(ii) центъра в зависимост от позицията на оксимните групи в симетричните кватернерни пиридиниеви съединения. 3. Спектрофотометрично комплексообразувателният процес е изследван в разтвор и е оценена стабилността на координационните частици при конкретните реакционни условия. Комплексите, съдържащи два метални центъра, притежават по-висока стабилност от тези с един комплексообразувателен йон. 4. Активността на некоординираните оксими и техните Pd(II)/Pt(II)- съдържащи модификации е изследвана срещу AChE и BuChE, инхибирани с фосфорорганичните пестициди метилпаратион и параоксон. 5. В in vitro експерименти е доказано, че алдоксимите са ефективни в най-значима степен при инхибиране с параоксон, и по-слабо с метилпаратион. 6. Новите комплексни съединения, като цяло запазват реактивиращия потенциал на изходните оксими. Координирането на йоните на Pt(II) към ВТ-07, Обидоксим и ВТ- 07-4М потенцира ефекта на лигандите при инхибитор параоксон на модела на инактивирана мозъчна AChE. 7. Получените резултати са солидна база за продължаване на изследователската работа. Изследваните прицелни координационни съединения могат да намерят място в клиничната практика при отравяне с ФОС

47 Приноси Резултатите, получени в настоящия дисертационен труд, са с оригинален характер. В хода на експерименталната работа за първи път: 1. са изследвани спектрофотометрично реакционните системи оксим йони на Pt(II), и тези, съдържащи Pd(II) и ВТ-07, ВТ-08, ВТ-07-4М; 2. е приложена изчислителната процедура Fishing Net Algorithm за оценка на стабилността на комплекси на реактиваторите на холинестеразата; 3. в условия in vitro е определен реактивиращият потенциал на метал(ii)-производни на класическите етиологични антидоти на ФОС и аналозите им от по-нова генерация, което дава практическа насоченост на дисертационния труд

48 Научни публикации и участия в научни форуми Списък на научните публикации, включени в дисертационната работа 1. Nedzhib, A., Stoykova, S., Atanasov, V., Pantcheva, I., Antonov, L. Pd(II) complexes of acetylcholinesterase reactivator Obidoxime. // Interdisc Toxicology, 2014, 7 (3), Неджиб, А., Стойкова, С., Съмналиев, И. Съвременни тенденции при дизайн на нови реактиватори на AChE като антидоти при интоксикации с органофосфорни съединения (бойни отровни вещества и пестициди). // Военна медицина, 2016, 68 (4), Неджиб, А., Стойкова, С., Съмналиев, И., Антонов, Л., Панчева, И. Комплексообразувателна способност на пралидоксим (2-PAM) с Pd(II) и Pt(II). // Военна медицина, 2016, 68 (4), Неджиб, А., Горанова, Я., Стойкова, С., Съмналиев, И. Реактиватори на холинестеразата като антидоти на нервните агенти история, актуално състояние и перспективи. // Военна медицина, 2017, 69 (2), Неджиб, А. Изследване на комплексообразувателната способност на TMB-4 с Pd(II) йони. // Военна медицина, 2018, 70 (3),

49 Участия в научни форуми по темата на дисертацията 1. Nedzhib, A., Pantcheva, I. N., Antonov, L. Spectrophotometric study on complexation ability of acetylcholinesterase reactivator Obidoxime. International Workshop Sensing applications of supramolecular chemistry, March, 2013, Plovdiv, Bulgaria постерно съобщение. 2. Nedzhib, A., Stoykova, S., Pantcheva, I. N. Complexation of Obidoxime with respect to its reactivation ability. 4 th Workshop on experimental models and methods in biomedical research, May, 2013, Sofia, Bulgaria устен доклад. 3. Nedzhib, A., Pantcheva, I. Photometric study of Obidoxime in the presence of (NH4)2PtCl4. TOXCON th Interdisciplinary Czech- Slovak Toxicology Conference, June, 2013, Hradec Kralove, Czech Republic постерно съобщение. 4. Неджиб, А., Стойкова, С., Съмналиев, И. Комплексообразувателна способност на пралидоксим (2-РАМ) с Pd(II) и Pt(II). Традиционна годишна среща на клиничните токсиколози в България, 3 4 Декември, 2016, Плевен, България постерно съобщение. 5. Неджиб, А., Стойкова, С., Съмналиев, И. Изследване на комплексообразувателната способност на TMB-4 С Pd(II) йони. 5 ти Конгрес на българско дружество по клинична токсикология, Септември, 2018, Троян, България постерно съобщение

50 Изказвам най-искрени благодарности към своите научни ръководители проф. Иван Съмналиев, дмн и проф. Ивайла Панчева, дх, ръководството на Военномедицинска академия, колегите от катедра Медицина на бедствените ситуации, както и на всички роднини и приятели за помощта, подкрепата, полезните съвети и напътствия при изготвянето на настоящата дисертация. Специално благодаря на своята съпруга гл. ас. Силвия Стойкова, дх за любовта и безусловната подкрепа във всяко начинание

51 M I L I T A R Y M E D I C A L A C A D E M Y Department of Disaster medicine AHMED NEDZHAT NEDZHIB, PhD Oxime reactivators of cholinesterase coordination ability and reactivation potential A B S T R A C T for the awarding of the educational and scientific degree "PhD" Area of higher education: 7. Healthcare and sports Professional direction: 7.1 Medicine Scientific specialty: Military toxicology Scientific supervisors: prof. Ivan Samnaliev, DSc prof. Ivayla Pantcheva, PhD SOFIA 2021

52 M I L I T A R Y M E D I C A L A C A D E M Y Department of Disaster medicine AHMED NEDZHAT NEDZHIB, PhD Oxime reactivators of cholinesterase coordination ability and reactivation potential A B S T R A C T for the awarding of the educational and scientific degree "PhD" Area of higher education: 7. Healthcare and sports Professional direction: 7.1 Medicine Scientific specialty: Military toxicology Scientific supervisors: prof. Ivan Samnaliev, DSc prof. Ivayla Pantcheva, PhD Reviewers: assoc. prof. Dimo Dimov, MD, PhD assoc. prof. Yulian Zagranyarski, PhD Reviewers Committee: prof. Magdalena Kondeva-Burdina, PhD prof. Ognyan Petrov, PhD assoc. prof. Dimo Dimov, MD, PhD assoc. prof. Ivan Popivanov, MD, PhD assoc. prof. Yulian Zagranyarski, PhD SOFIA

53 The thesis contains 103 pages, illustrated with 47 figures and 12 tables, and bibliographic sources are 130. PhD student works in the Military toxicology Section at the Department of Disaster Medicine of the MHAT-Sofia at the MMA. The PhD thesis is discussed, accepted and directed for defense in front of scientific jury by the extended Department Council at the Department of Disaster medicine of the MHAT-Sofia at the MMA on The defense of the dissertation will take place on , at o clock in the Ceremonial Hall of MMA, Sofia, St. G. Sofiyski 3 at an open meeting of the scientific jury. All documents are published on the webpage of Military Medical Academy. Ahmed Nedzhib, PhD - 2 -

54 Content INTODUCTION CONCLUSIONS FROM THE SCIENTIFIC LITERATURE OVERVIEW AIM AND TASKS EXPERIMENTAL PART REAGENTS, SOLVENTS AND MATERIALS EQUIPMENT METHODS AND PROCEDURES Spectrophotometric investigation of the reaction system Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L Stability of complexes at real conditions (conditional stability constants (β')) Determination of MPT and PO purity by gas-chromatographic analysis Preparing of substances solutions for in vitro experimental determination of enzyme activity In vitro cholinesterase inhibition and reactivation procedure Determination of BuChE activity Ellman s method for determination of AChE activity Calculation of the inhibitory effect and the enzyme activity reactivation RESULTS AND DISCUSSION SPECTROPHOTOMETRIC EVALUATION OF THE COORDINATION ABILITY OF QUATERNARY MONO- AND BIS-PYRIDINIUM ALDOXIMES STABILITY OF THE NEWLY OBTAINED COMPLEXES (CONDITIONAL STABILITY CONSTANTS (Β')) REACTIVATING POTENTIAL OF THE NEWLY SYNTHESIZED COMPOUNDS TOWARDS INHIBITED ERYTHROCYTE/BRAIN AChE AND BuChE CONCLUSIONS CONTRIBUTIONS PUBLICATIONS AND PARTICIPATION IN SCIENTIFIC FORUMS

55 Used abbreviations CWA Chemical warfare agents OPC Organophosphorus compounds GA Tabun GB Sarin GD Soman GF Cyclosarin ACh Acetylcholine ChE Cholinesterase AChE Acetylcholinesterase BuChE Butyrylcholinesterase Ch Choline MMA Military medical academy RBC-AChE Erytrocite acetylcholinesterase MPT Methylparathion PO Paraoxon RChE Cholinesterase reactivator RLMT Research laboratoary of military toxicology β Stability constant β Conditional stability constant ATChI Acetyltjiocholine iodide DTNB 5,5 -dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) PBS Phosphate buffer saline GC-FID Gas chromatography with flame-ionization detector FiNAl Fishing Net Algorithm brain-ache Brain acetylcholinesterase - 4 -

56 Intoduction The third decade of the new century has come, bringing with it an widespread anxiety, worry and fear of the raging pandemic caused by COVID-19. It turned out that the humanity, despite the latest technological advances, is extremely vulnerable and unprepared for such developments. This raises very acute questions about the timely and adequate response of national and global teams to outbreaks of biological agents - one of the elements of the weapons for mass destruction. The world community was equally alarmed by the news of the use of chemical warfare agents (CWA) during the Syrian civil war, which claimed the lives of thousands and injured even more completely innocent civilians, including children. For 2-3 years, new similar inhumane actions followed, which clearly showed that the threat of using chemical agents in local conflicts or terrorist acts still exists. Particular attention should be paid to the fact that among the agents used there are representatives of the most toxic CWA, such as nerve agents. It is a sarin, the use of which has been proven by accredited international toxicology laboratories. Shocking for the world was the use of the latest generation of nerve agents "Newcomer", characterized by hypertoxicity, as a means of terror in the English city of Salisbury in These events gave rise to a reassessment of the effectiveness of the established drug approach for the prevention and treatment of acute intoxications with nerve agents. One of its main components are cholinesterase reactivators, which are a classic example of the etiological treatment of an intoxication. It turns out that there are certain limiting factors, which require an intensive research in this area in order to optimize the antidote therapy. To achieve this task, a number of modern methods is applied, allowing the synthesis of new promising compounds. One of the possible approaches for the production of new cholinesterase reactivators is a subject of the pressent dissertation

57 Conclusions from the scientific literature overview 1. Due to their physical and chemical properties, the nerve agents are the most toxic representatives of the chemical warfare agents. For this reason, they are seen as a potential source of threat to the civilian population in the case of a terrorist attack. 2. Despite the significant advantages in antidote therapy of intoxications with organo-phosphorous compounds (OPC), in particular the use of cholinesterase reactivators (RChE), there are still unresolved issues. One of them is the lack of an universal reactivator that is effective against all representatives of these agents. 3. This is the reason for conducting an intensive research aimed to the synthesis and evaluation of new promising compounds as cholinesterase reactivators. One of the possible approaches for obtaining new ones is the coordination of oxime compounds with metal ions

58 Aim and tasks Aim The main goal of the present dissertation is to study the complexation ability of a series of oxime reactivators of cholinesterase with divalent metal ions of palladium and platinum and to evaluate the reactivation potential of the newly obtained complex species in vitro. Tasks In order to fulfill the set goal, it was necessary to solve the following tasks: 1. Investigation of the ability of aldoxime reactivators 2-PAM, ВТ-07, ВТ- 08, TMB-4, Obidoxime and ВТ-07-4М to interact with divalent metal ions of palladium (Pd(II)) and platinum (Pt(II)). 2. Determination of the stability of the newly obtained complexes. 3. Investigation of the reactivation potential of newly synthesized compounds towards brain-ache, erythrocyte AChE and BuChE, inhibited by organophosphorus insecticides methylparathion (MPT) and paraoxon (PO) in in vitro experiments

59 Experimental part Reagents, Solvents and Materials Ligands 2-PAM (HL +, HLI) и ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Obidoxime и ВТ-07-4М (H2L 2+, H2LX2, X = Cl, Br ) were synthesized in the Research Laboratory of Military Toxicology (RLMT, MMA-Sofia). Methylparathion (MPT) was provided by the same laboratory. (NH4)2PdCl4, (NH4)2PtCl4, NaOH, H3PO4 Na2CO3, NaCl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, KHCO3, Triton X-100, paraoxon (PO), acetylthocholine iodide (ATChI), 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) and abs. EtOH were purchased from Sigma-Aldrich (Germany). The Britton-Robinson buffer (ph 7.4) was prepared immediately prior to the experiments from phosphoric, boric and acetic acids in final concentrations of M of each of them. The ph value was adjusted using NaOH ( M). The phosphate buffer (ph 6, final concentration 0.6 M, and ph 8, final concentration 0.1 М) was prepared immediately before the experiments, and the ph value was adjusted using NaOH and/or H3PO4. All reagents and solvents were p.f.a. qualified. Deionized water was used in the experiments (18.2 MΩ.cm). A whole boold (from healthy volunteers) in a vacuum tube containing a gel separator (yellow cap) was centrifuged at 3000 rpm for 3 min. The separated serum was used to determine BuChE activity. A whole blood (from healthy volunteers) in a vacuum tube containing heparin as an anticoagulant (green cap) was centrifuged at 3000 rpm for 3 min. The separated plasma was removed and PBS (phosphate buffer saline, ph 7.4) was added to the erythrocyte mass until the initial volume was reached. The resulting sample was carefully homogenized (without a vortex) and centrifuged again at 3000 rpm for 3 min. The procedure was repeated until a clear - 8 -

60 transparent supernatant was obtained. The latter was removed and the erythrocyte mass was hemolyzed by adding 9.00 ml of 2.5% Triton X-100 to 1.00 ml. The resulting hemolysate was used as a source of erythrocyte AChE (RBC-AChE). A dissected brain from male Wistar rats (reached sexual maturity, weighing g) was provided by the Institute of Neurobiology of BAS. 10% (w/v) brain homogenate was prepared using a mechanical tissue homogenizer, and ml of deionized H2O were added to 1.65 g of rat brain. Until the experiment, this sample was stored at temperatures from 16 to 20. Immediately before experiment, from 10% (w/v) brain homogenate the 2% brain homogenate was prepared by dilution with deionized H2O. The 2% brain homogenate thus obtained was used as a source of brain AChE in in vitro experiments. Equipment The spectral changes in reaction systems Pd(II)/Pt(II) 2-PAM, ВТ-07, ВТ-08, Obidoxime и ВТ-07-4М were monitored using Shimadzu UV-1800 spectrophotometer. Spectrophotometric behavior in the reaction system Pd(II) TMB-4 was followed by Thermo Scientific Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer. The measurement of cholinesterase activity was performed on Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics BA-88A (Semi-automatic Biochemical Analyzer). The purity of insecticides MPT and PO was determined by Agilent 6890N gas chromatograph with flame-ionization detector (GC-FID)

61 Methods and procedures Spectrophotometric investigation of the reaction system Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L 2+ After the preparation of the stock solutions ( M) of the reagents (metal salt and ligands) in the corresponding buffer solution, the complexation processes in the systems Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L 2+ were monitored spectrophotometrically in the range from 220 up to 500 nm under different reaction conditions (ph, molar ratio of reagents and reaction time) as follows: 1. For the systems Pd(II)/Pt(II) HL + /H2L 2+ (HL PAM; H2L 2+ - ВТ- 07, ВТ-08, Obidoxime и ВТ-07-4М): ph 7.4 (Britton-Robinson buffer), molar ratio metal-ligand from 1-10 to Spectra were recorded immediately after mixing the reagents and at 24 th, 48 th, 72 nd and 168 th hours; 2. For the system Pd(II) TMB-4: at ph 6 (phosphate buffer 0.6 M), molar ratio metal ion-ligand from 1-10 to 10-1, registration at 0 th and 24 th hour. The spectra of the ligands at the respective ph were recorded using the baseline of the respective buffer solution, and those of the oximate particles (anionic form of the ligands) under alkaline conditions (excess of solid Na2CO3). All spectra of the complex species were recorded at the corresponding concentration of metal (II) salts as a baseline. The final concentration of the ligands under all reaction conditions was kept a constant ( M). Stability of complexes at real conditions (conditional stability constants (β')) The conditional stability constants (β') of newly obtained complex species, observed at different ph value (6.0, 7.4) and rection time (0 th and 24 th h), were calculated using equation 1 (Eq. 1), based on the following reaction: n Pd 2+ /Pt 2+ + HL + /H 2 L 2+ complex β = C complex n C Pd 2+ /Pt 2+ C H 2L 2+ /HL + (Eq. 1)

62 In the course of the experiments, a major problem arose, relating to the fact that the equilibrium is not completely shifted to the final products (i.e. to the complex formation). For this reason, the classical methods for experimental data processing cannot be used directly for complex formation quantification, since the individual spectra of the observed complex particles are unknown. Therefore, the Fishing Net Algorithm (FiNAl) was applied, specially developed for a quantitative analysis of such type of system. Applying this approach, the molar parts of the unreacted (x H2 L 2+ /HL +) and complex-formed (x complex) oxime-containing species in each solution were obtained, taking into account the initial ph-dependent conversion of the oximes to the corresponding oximate anions (x L ). As can be seen from the equations below (Eq. 2 and Eq. 3), the molar parts can be easily obtained using the total ligand concentration: 0 C H2 L 2+ /HL + = C H2 L 2+ /HL + + C ; C = C L + C complex (Eq. 2) 1 = x H2 L 2+ /HL + + x ; x = x L + x complex (Eq. 3), 0 where C H2 L 2+ /HL + is the total concentration of ligand, while C H2 L 2+ /HL +, C L and C complex are the equilibrium concentrations of the free unreacted ligand, the initially formed oximate and the complex formed under the corresponding experimental conditions. The molar parts of the complex species were calculated from the total molar part of the oximate anions x* (Eq. 4): x complex = x x L (Eq. 4) As a result of this transformation, the β' can be expressed by Eq. 5:

63 β = x complex x H 2L 2+ /HL + 1 n (Eq. 5) C Pd 2+ /Pt 2+ presented under logarithmic conditions (Eq. 6): x complex lgβ = lg n lg C x Pd 2+ H 2L 2+ /HL + /Pt 2+ (Eq. 6), where the number of coordinated metal ions (Pd 2+ /Pt 2+ ) (n) and the values of β' were calculated using the graphical dependence of lg x complex x H 2L 2+ /HL + to lg C Pd 2+ /Pt 2+. Determination of MPT and PO purity by gas-chromatographic analysis Solutions with an approximate concentration of M in abs. EtOH were prepared from the insecticides MPT (Mw = g/mol, ρ = 1.36 g/cm 3 ) and PO (Mw = g/mol, ρ = g/cm 3 ). Their purity was determined by the gas chromatography with flame-ionization detector (GC-FID) and quantified as a percentage of the total amount of the peaks area. The chromatographic conditions applied were as follows: capillary column HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane (30.0 m, 320 µm inner diameter and 0.25 µm film thickness), helium gas carrier with a flow rate of 2.0 ml/min, injector temperature 250 C, splitless mode and temperature program - initial temperature of 40 with hold for 1 min, followed by increase of 10 /min to 280 and hold for 5 min. The amount of the sample injected was 1.0 µl. Preparing of substances solutions for in vitro experimental determination of enzyme activity The stock solutions of metal salts and ligands were prepared in concentrations of M (Britton-Robinson buffer M ph 7.4; only in

64 the system with TMB-4 phosphate buffer ph 6.0 was used). By mixing the appropriate amounts of them, the corresponding complex species required for the in vitro analysis were obtained at a constant concentration of the ligands ( M). The molar ratio of the complex species studied and corresponding periods are presented in Table 1. Table 1. Reaction systems Pd(II)/Pt(II) H2L 2+ /HL +, used for in vitro studies Ligand (L) Molar ratio Pd(II):L Time for complex formation [h] 2-PAM BT BT TMB Obidoxime BT-07-4M Ligand (L) Molar ratio Pt(II):L Time for complex formation [h] 2-PAM BT BT Obidoxime BT-07-4M The in vitro inhibition of cholinesterase activity was performed using the pesticides MPT and PO. From the corresponding stock solutions of each of the two inhibitors in abs. EtOH (PO М; MPT М) series of solutions of different concentrations were prepared by diluting with a deionized water, as follows:

65 - PO from to М; - MPT from to М. In vitro cholinesterase inhibition and reactivation procedure A control sample (100% enzyme activity): To 200 µl of 2% brain homogenate/hemolysate/serum, 50 µl of deionized H2O (final volume 250 µl) were added. The sample was vortexed and incubated at 37 for 30 min. After that, it was placed on an ice bath until the measurement of the respective enzyme activity. An inhibition of enzyme activity: To 200 µl 2% brain homogenate/hemolysate/serum were add 25 µl inhibitor (from a series of dilute solutions) and 25 µl deionized H2O (final volume 250 µl). The sample was vortexed and incubated at 37 for 30 min, then placed on an ice bath until the relevant enzyme activity was measured. A reactivation of enzyme activity: To 200 µl 2% brain homogenate/hemolysate/serum, 25 µl inhibitor were added at the given inhibitory concentration, reaching 55-65% inhibition at 30 min. The sample was vortexed and incubated at 37 for 30 min. After the inhibition time, 25 µl RChE/metal salt/complex (final volume 250 µl) were added to the sample, which was homogenated and incubated again at 37 for 30 min. Next, the sample was placed on an ice bath until the relevant enzyme activity was measured. All experiments were performed in triplicate. Determination of BuChE activity The activity of serum BuChE was measured using a ready-made kit (Chema Diagnostica) according to the manufacturer's instructions. The determination was performed by the kinetic colorimetric method, where the concentration of the enzyme is inversely proportional to the color intensity (Figure 1)

66 The butyrylthiocholine reaction was initiated by the addition of the following samples: - serum, containing only enzyme (control sample); - serum, containing pesticide (inhibited enzyme activity); - serum, containing pesticide with reactivator (reactivated enzyme activity). The resulting solution was tempered at 37 ºC for 90 s, after which the reading of the absorbance change at 405 nm per unit time up to 3 minutes of the reaction was started. The enzyme activity in U/L was calculated according to the factor specified in the manufacturer's instructions. butyrylcholine BuChE butyric acid thiocholine red blood salt [Fe(CN) 6 ] 3- +e - [Fe(CN) 6 ] 4- yellow blood salt Figure 1. Schematic representation of the reaction for measuring the activity of BuChE Ellman s method for determination of AChE activity The determination of brain acetylcholinesterase (brain-ache) and erythrocyte acetylcholinesterase (RBC-AChE) was performed by the classical Ellman method. Under the action of the enzyme AChE, the reaction substrate acetylthiocholine iodide (ATChI) was hydrolyzed to produce thiocholine, which reacts with Elman's reagent 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) to form a color compound with λmax = 420 nm. The concentration of the two enzymes is directly proportional to the color transition (Figure 2). The test sample is prepared by mixing the following reagents: 650 µl 0.1 M phosphate buffer ph 8.0, 50 µl 0.01 M DTNB and 10 µl M ATChI, to which 25 µl of 2% brain homogenate or 5 µl of the corresponding hemolysate sample are added (i.e. control sample, sample with inhibited enzyme activity,

67 sample with reactivated enzyme activity). The resulting solution was tempered at 37 ºC for 60 s, after which the reading of the change in absorbance at 420 nm per unit time up to 4 min of reaction was started. The obtained numerical result for the enzyme activity is presented in AU/min. AChE acetylthiocholine acetic acid thiocholine DTNB Figure 2. Schematic representation of the reaction to measure AChE activity Calculation of the inhibitory effect and the enzyme activity reactivation The inhibitory effect of the tested insecticides MPT and PO was calculated according to Eq. 7: % Inhibition = ( ЕА control EA inhibitor ЕА control ) 100 (Eq. 7), where: EAcontrol is the enzymatic activity of the control samples; EАinhibitor is the enzymatic activity of the inhibited sample. The reactivating effect of the studied ligands and complex species was calculated according to Eq. 8: % Reactivation = (1 ЕА control EA reactivator ЕА control ЕА inhibitor ) 100 (Eq. 8), where: EAcontrol is the enzymatic activity of the control sample; EАinhibitor is the enzymatic activity of the inhibited samples; EАreactivarot is the enzymatic activity of the reactivated samples

68 Results and discussion The experimental part of the present dissertation is aimed to the evaluation of the complex-forming ability of oxime reactivators 2-PAM (HL + ) и ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Obidoxime, ВТ-07-4М, (H2L 2+ ) with the ions of Pd(II) and Pt(II). The chemical formulas of the target oximes (Figure 3) clearly show that the selected compounds differ in their structure. 2-PAM is a representative of the mono-pyridinium aldoxime reactivators of cholinesterase, with a pyridinium nitrogen atom attached to the methyl group and an oxime group placed at the second position in the heteroaromatic ring. The rest of the ligands are symmetric bis-pyridinium dialdoximes, i.e. they consist of two heteroaromatic cycles linked by a methylene or oxymethylene bridge and containing two oxime groups each of them placed at the second or fourth position. In the case of Obidoxime, the bridge is oxymethylene with oxime groups on the fourth position of the both rings. TMB-4 and BT-07 h possess two heterocycles linked by a propylmethylene bridge, and the two oxime groups are located in fourth (TMB-4) and second (BT-07) positions, respectively, in both heteronuclei. BT-07-4M and BT-08 contain a butyl methylene bridge, the aldoxime groups being substituted at the fourth (BT-07-4M) and second (BT- 08) positions. The quaternization of the pyridinium type nitrogen atom in the chemical structure of these compounds determines their positive charge. This predefines their difficulty to react with positively charged metal ions, and thus to isolate any newly formed solid particles. On the other hand, the presence of an oxime group in the chemical structure of aldoximes determines their coordination behaviour and suggests that these cholinesterase reactivators may act as potential ligands capable complexing metal ions

69 2-PAM ВТ-07 (K005) ВТ-08 (K033) TMB-4 Obidoxime ВТ-07-4М (K074) Figure 3. Chemical structures of oxime RChE

70 Spectrophotometric evaluation of the coordination ability of quaternary mono- and bis-pyridinium aldoximes The spectrophotometry (UV-Vis spectroscopy) is currently the most appropriate method for monitoring the complex-formation reactions when the ligands absorb in the ultraviolet and/or visible region of the electromagnetic spectrum, for several reasons: 1. The method is applicable at relatively low concentrations of the test substances, which avoids complications related to association, aggregation, etc. phenomena; 2. The measurements can be performed in various solvents (including water); 3. The mathematical apparatus for the evaluation of complexation processes is well defined by the Bouguer-Lambert-Beer law. The absorption spectra of the aldoxime compounds at ph 7.4 (Britton- Robinson buffer) in the range from 220 to 500 nm are shown in Figures 4 and 5 (solid lines). Phosphate buffer (ph 6.0) was used only in case of TMB-4. The molecular spectra of the ligands clearly show that the absorbance maxima of 2-PAM, BT-07 and BT-08 lay in the range nm, while those of Obidoxime, TMB-4 and BT-07-4M in the range nm. These results reveal that the position of the oxime groups, i.e. the change of the 2 nd to the 4 th position in the quaternary pyridinium ring causes a hypsochromic shift of the absorption maximum. At ph 7.4, the oximes are partially converted to oximates, visible from the less intense absorption band in the range nm, which is in agreement with the previously reported data. At ph 6.0 TMB-4 exists only in its oxime form

71 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 Absorbance [A] 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 2-PAM ВТ-07 ВТ-08 0,2 0,1 0, λ [nm] Figure 4. UV-Vis absorption spectra of 2-PAM, BT-07 and BT-08 (solid line - at ph 7.4; dotted - under alkaline conditions) Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 Обидоксим 0,8 0,7 TMB-4 0,6 ВТ-07-4М 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Figure 5. UV-Vis absorption spectra of Obidoxime, ВТ-07-4М and TMB-4 (solid line - at ph 7.4/6.0; dotted - under alkaline conditions) The absorption spectra represented by solid lines in the above figures relate to the protonated form (HL + /H2L 2+ ) of the ligands and their partial conversion to the corresponding oximates at ph 7.4. In the presence of an excess of Na2CO3, the deprotonation of the ligands occurs, which causes a shift of the oximate anion absorbance in the range of nm (dotted lines in Figures 4-5)

72 Absorbance [A] The absorption maxima corresponding to the ionization of the oxime group can be explained by the occures π-π* transitions in the aromatic system. The ligands time-dependent changes observed at ph 7.4/6.0 and in alkaline conditions were followed within one week after their dissolution (in TMB-4 at 0 th and 24 th hour) in order to monitor the stability of compounds under given conditions. The data are presented in Figures Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 Обидоксим 0,8 0,7 TMB-4 0,6 ВТ-07-4М 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Figure 6. Time-dependent absorption spectra of 2-PAM (solid line ph 7.4, dotted alkaline conditions) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ч 24 ч 48 ч 72 ч 168 ч 0, λ [nm] Figure 7. Time-dependent absorption spectra of ВТ-07 (solid line ph 7.4, dotted alkaline conditions)

73 1,2 Absorbance [A] 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ч 24 ч 48 ч 72 ч 168 ч 0, λ [nm] Figure 8. Time-dependent absorption spectra of ВТ-08 (solid line ph 7.4, dotted alkaline conditions) Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 0 ч 1,3 1,2 24 ч 1,1 1,0 48 ч 0,9 0,8 72 ч 0,7 0,6 168 ч 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Figure 9. Time-dependent absorption spectra of Obidoxime (solid line ph 7.4, dotted alkaline conditions)

74 Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 0 ч 1,3 1,2 24 ч 1,1 1,0 48 ч 0,9 0,8 72 ч 0,7 0,6 168 ч 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Figure 10. Time-dependent absorption spectra of ВТ-07-4М (solid line ph 7.4, dotted alkaline conditions) 0,9 0,8 0,7 Absorbance [A] 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0 ч 24 ч 0,1 0, λ [nm] Figure 11. Time-dependent absorption spectra of TMB-4 (solid line ph 6.0, dotted alkaline conditions) As can be seen, the experimental results show that in some cases, a timedependent hypochromic effect was observed. This fact indicates some instability of the reactivators in solution and probably relates to an ocurence of degradation process. From the spectral data analysis can be concluded that the most significant changes are observed in BT-07 and BT-08 systems (especially in their anionic form), which are bis-pyridinium aldoximes and contain oxime

75 groups in second place of the heteroring. For the other reactivators studied, the contribution of these decomposition process is insignificant. In the course of experiments it was found that the addition of Pd(II)/Pt(II) ions to oximes solutions causes their spontaneous deprotonation and this process depends on the molar ratio of metal (II) ion-ligand in the studied system. The increase of metal (II) ion amounts decreases the absorption maximum of the band relating to the oxime group in the range nm, and increases that in the range nm. The process is independent of the acidity of the solution at 0 th hour (ph 6.0 for TBM-4 and ph 7.4 for other oximes) but time-dependent hypochromic shifts and changes in spectral characteristics are observed, suggesting that concomitant side effects (probably degradation) processes, take place. The changes in the reaction mixture containing Pd(II) ions and Obidoxime at molar ratio of metal (II) ion-ligand varing from 1-10 to 10-1, recorded at ph 7.4 in the range 0 th -168 th hour, are presented in Figure 12. The spectral analysis data revealed, the the reaction between Pd(II) and the studied ligands proceeds rapidly and takes place immediately after mixing the reagents. The deprotonation of the oximes in the presence of palladium (II) ions is accompanied by their coordination, as the spectra of reactivators under the alkaline conditions (oximate form) differ from those observed in the Pd(II)- HL + /H2L 2+ systems, even in the presence of a significant metal ions excess. The last ones are hypo- and batochromically shifted and a such spectral characteristic implies the participation of the oximate group(s) in the additional interaction with the Pd(II) ions. Figure 13 shows the absorption spectra of Obidoxime in its oxime and oximate forms, as well as in the presence of Pd(II) ions

76 1,2 1,1 0 h Absorbance [A] 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 изобестична точка ,1 1,0 24 h 0, λ [nm] 1,1 48 h 1,0 Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,1 0, λ [nm] 1,1 72 h 1,0 0, λ [nm] 1,1 168 h 1,0 Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,1 0,0 0, λ [nm] λ [nm] Figure 12. Time-dependent UV-Vis spectra of the system Pd(II)-Obidoxime with increasing molar ratios metal(ii) ion ligand

77 Absorbance [A] 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 1 0,8 2 0,7 3 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, λ [nm] Figure 13. UV-Vis spectra of Obidoxime: oxime form (1), oximate form (2) and in the presence of Pd(II) ions (3), molar ratio metal(ii) ion-ligand = 2-1, 0 th hour The stability of the obtained new complex species occurs to be a timedependent, as the speed of the ongoing side processes is significantly influenced to the molar ratio of Pd(II) -ligand and the type of oxime (mono- or bis-). The data show that the position of the oxime group (2 nd, 4 th ) and the nature of the bridge do not significantly affect the changes in the studied systems. Thus, in the reaction system Pd(II)-2-PAM (mono-pyridinium aldoxime with one oxime group placed at the second position in the aromatic ring) the course of side reactions is observed as early as at the 24 th hour. In the case of bis-aldoximes BT-07 and BT-08 (2 nd position of the oxime groups) and their analogues TMB-4, Obidoxime and BT-07-4M (4 th position of the oxime groups), the changes in the spectral characteristics start to arise and are noticeable on the 48 th hour. In all cases, the excess of palladium(ii) ions potentiates undesirable processes, but in the absence of metal ions or at a stoichiometric ratio Pd(II)-ligand = 1:1 the changes are insignificant and the stability of complex species can be observed throughout a one-week period studied. From a coordination point of view, it is of interest to compare the effects of the palladium(ii) ion towards its structural analogue platinum(ii), therefore

78 similar one-week studies on the ability of oximes 2-PAM, BT-07, BT-08, Obidoxime and BT-07-4M to interact with Pt (II) ions were performed. The representative spectral curves of the reaction system containing Pt(II) and Obidoxime (ph 7.4, molar ratios of Pt(II)-ligand from 1-10 to 10-1) recorded in the time interval of 0 th -168 th hour are shown in Figure 14. Absorbance [A] 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Absorbance [A] 1,3 0 h 1,2 1,1 1, , , , , , , , , ,1 0, λ [nm] 24 h Absorbance [A] 1,2 48 h 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, , λ [nm] 1,1 72 h 1,0 0, λ [nm] 1,1 168 h 1,0 Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Absorbance [A] 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, ,1 0,1 0,0 0, λ [nm] λ [nm] Figure 14. Time-dependent UV-Vis spectra of the system Pt(II)-Obidoxime with increasing molar ratios metal(ii) ion ligand

79 Both Pd(II) and Pt(II) ions cause a deprotonation of the studied aldoximes, but the interaction proceeds at a lower rate and the formation of complex particles is observed only at the 24 th hour after mixing the reagents in the case of Pt(II). In contrast to the slow establishment of the equilibrium process, the followed side reactions are accelerated (compared to the Pd(II)- containing systems), and again the most significant changes are observed in the excess of platinum(ii) ions. In conclusion, the ability of a series of cholinesterase reactivators to interact with palladium(ii) and platinum(ii) ions was evaluated spectrophotometrically: - The reaction proceeds faster in the presence of Pd(II) than in the presence of Pt(II) ions, but the deprotonation and the coordination of oxime ligands as their corresponding oximates are observed in both cases; - The newly obtained complex species possess a spectral band that shifts hypo- and batochromically compared to that observed in the uncoordinated oximate form of the aldoximes; - The presence of an isobestic point in all systems studied indicates a chemical equilibrium process, which is not fully shifted to the final products. For this reason, the individual spectral characteristics of the newly obtained complex species are unknown; - The positive charge of the initial quaternary aldoximes is preserved in the Pd(II) and Pt(II) coordination compounds, and so far no suitable reaction conditions have been found for the isolation of the observed complex species in the solid state; - Both in the spectra of the free ligands and in the systems containing metal(ii) ion and reactivator, time-dependent changes due to side recations are observed. The last ones relates to the reactivator nature (mono- or bis-aldoxime) and the amount of Pd(II)/Pt(II) ions in the solution, but are not significantly affected by the position of the oxime groups and the origin of the bis-pyridinium bridge of the compounds

80 Stability of the newly obtained complexes (conditional stability constants (β')) Based on the spectrophotometric studies, the complex formation process that takes place can be expressed by the following chemical equation: n Pd 2+ /Pt 2+ + HL + /H 2 L 2+ complex, where HL + is 2-PAM, H2L 2+ ВТ-07, ВТ-08, TMB-4, Obidoxime and ВТ-07-4М. The rate by which the coordination ion (Pd(II)/Pt(II)) and the ligands (HL + /H2L 2+ ) are associated characterizes the stability of the resulting complex. The equilibrium constant, showing how far the process has been shifted towards the right reaction, serves as a quantitative measure of such stability. It is called the "total" stability constant and is denoted by β. Its value can be calculated by Eq. 1 (from the experimental part), but under ideal conditions. In real experiments, the most of the complex-formation processes are equilibrated, but also are accompanied by side reactions. In this case, the "conditional" stability constant (β') is introduced, which takes into account the specific conditions under which the studied complexation process takes place. Determination of the stability of the complex compounds is used in the field of chemistry, environmental science, toxicology, military toxicology, forensics, catalysis, food quality and preservation, etc. For the purposes of toxicology, and in particular of military toxicology, the determination of the β' values of the target coordination compounds, a subject of the present dissertation, is extremely important in line with their possible application in antidote therapy of OPC poisoning. In the course of the experiments it was found that the equilibrium in the metal(ii) ion oxime systems is not fully shifted to the complex formation, even at the presence of a large excess of Pd(II)/Pt(II) ions. For this reason, the individual spectra of the formed complex species are unknown and the classical methods for processing the spectral data are not applicable for quantitative evaluation of the coordination processes. To avoid this complication, the Fishing Net Algorithm (FiNAl) procedure, specially developed for quantitative analysis of such systems, was applied. As a result, the molar parts of the

81 unreacted ligands (x H2 L 2+ /HL +) and the complexed oximate (x complex) species in each solution were calculated. The initial ph-dependent conversion of oximes to oximate anions (x L ) was also accounted. It should be noted that the simultaneous time-dependent side reactions complicates the application of FiNAl and imposes limitations in the calculation of the respective molar parts of the complexes, which in turn reduces the number of spectral data used in the analysis. The accompanying processes let to the selection of a data set, presented in Table 2. Table 2. Spectral data used in the FiNAl procedure Molar ratio System Pd(II)-ligand Pd(II)-ligand Time interval 2-PAM th h ВТ th h ВТ th h TMB th h Obidoxime th h, 24 th h ВТ-07-4М th h, 24 th h System Pt(II)-ligand Molar ratio Pt(II)-ligand Time interval 2-PAM th h ВТ-07 1: th h ВТ-08 1: th h Obidoxime th h ВТ-07-4М 1: th h The mathematical apparatus for calculating the values of the molar parts and the conditional stability constants of the newly obtained coordination compounds is presented in details in the "Experimental part" Section of the dissertation. According to the Eq. 6, the construction of a logarithmic

82 dependence of x complex x reactivator on the concentration of metal(ii) ion allows the expession of the linear equation y = ax + b, where a reflects the number of coordination ion included in the complex, and b - the value of the conditional stability constant. Figure 15 shows the representative graphs of this dependence for the Pd(II) -Obidoxime system, obtained immediately after mixing the reagents and at 24 th hour. 1,1 1,5 0,8 1,2 0,5 0,2 y = 1,47x + 6,52 R² = 0,9874 0,9 0,6 y = 1,97x + 9,34 R² = 0,9927 lg -0,1-5,5-5,3-5,1-4,9-4,7-4,5-4,3-4,1-3,9-3,7-0,4 lg 0,3 0,0-5,5-5,3-5,1-4,9-4,7-4,5-4,3-4,1-0,3-0,7-0,6-1,0-0,9-1,3-1,2-1,6-1,5 Figure 15. Graphic dependence of lg(xcomplex/x H2 L 2+) from lgc Pd 2+ for the Pd(II)-Obidoxime system at 0 th (left) and 24 th (right) hour The processing of the experimental data shows that in the studied Pd(II)- containing systems bis-aldoximes can participate in two types of complex species with composition [PdHL] 3+ and/or [Pd2L] 4+, respectively, which depends on the position of the oxime group in the structure of the reactivator. The ligands BT-07 and BT-08, containing oxime groups at the 2 nd position, coordinate two palladium cations, forming only complex species with a composition [Pd2L] 4+. Obidoxime and BT-07-4M, each having two oxime groups at the fourth position in the pyridinium rings, form two complex species with a composition of [PdHL] 3+ (0 th hour) and [Pd2L] 4+ (24 th hour), while the reaction of TMB-4 proceeds with the formation of [PdHL] 3+ only. The monoaldoxime 2-PAM coordinates a Pd(II) ion to form a complex with [PdL] 2+. The binding of platinum(ii) ions is slower than that of Pd(II), with bisoximes forming only one type of complex species with a [PtHL] 3+ composition

83 within 24 hours after mixing the reagents. No species with a [Pt2L] 4+ composition were observed in any of the bis-pyridinium ligands studied, most likely due to faster side reactions occurred than in the case of Pd(II)-containing reaction systems. The data for the calculated conditional stability constants of the observed compounds are summarized in Table 3. Table 3. Logβ' values of reaction systems Pd(II)/Pt(II)-HL + /H2L 2+ System Pd(II)-lgand Complex specie logβ' R 2 2-PAM [PdL] BT-07 [Pd2L] BT-08 [Pd2L] TMB-4 [PdHL] Obidoxime BT-07-4M [PdHL] [Pd2L] [PdHL] [Pd2L] System Pt(II)-ligand Complex specie logβ' R 2 2-PAM [PtL] BT-07 [PtHL] BT-08 [PtHL] Obidoxime [PtHL] BT-07-4M [PtHL] There is a very limited information in the scientific literature on the ability of cholinesterase reactivators to form complex compounds. In the framework of the present dissertation, the ongoing processes between the quaternary aldoximes and the double-charged metal ions of palladium and platinum have been studied for the first time. It was found that the mono- and bis-pyridinium aldoximes 2-PAM, BT-07, BT-08, TMB-4, Obidoxime and BT-07-4M, in the presence of ions of Pd(II) or Pt(II), participate in a coordination equilibrium process where the

84 formation of positively charged complex species was observed. The calculated conditional stability constants ( ) suggest the formation of stable species in solution, but at the present stage of the research no specific conditions have been found for their isolation in a solid state. From the experimental data available so far, it is highly speculative to suggest an exact binding mode of the studied ligands to the corresponding metal(ii) ion. The obtained results are a good starting point looking for different approaches that will allow the isolation of the compounds in a pure form and with a certain composition, which in turn will make possible their structural characterization. In conclusion, the interaction of mono- and bis-quaternary pyridinium aldoximes 2-PAM, BT-07, BT-08, Obidoxime and BT-07-4M with ions of Pd(II) at ph 7.4 and TMB-4 at ph 6.0, respectively, leads to the formation of coordination compounds containing one and/or two metal(ii) ions depending on the chemical structure of the ligands (i.e. the position of the oxime groups) and the reaction time. In contrast to the Pd(II)-containing systems, the complexation process between 2-PAM, BT-07, BT-08, Obidoxime and BT-07-4M and Pt(II) cations at ph 7.4 poceeds slower with the formation of only of mononuclear complex species. The newly obtained species, especially those containing two metal(ii) centers, possess a significant stability in solution. Reactivating potential of the newly synthesized compounds towards inhibited erythrocyte/brain AChE and BuChE The cholinesterase reactivators studied in the dissertation are wellnown antidotes of OPC intoxications in civilian clinical practice or in military toxicology (2-PAM, TMB-4 and Obidoxime). Binding them in the form of Pd(II)/Pt(II) -containing species requires an additional assessment of the effect that the metal(ii) ion would renbder on the oximes reactivation potential. For that purpose, in vitro studies on the enzymes acetyl- (AChE) and butyryl- (BuChE) cholinesterase inhibited by the organophosphorus pesticides methylparathion (MPT) and paraoxon (PO) were performed. The last ones are

85 widely used in experimental toxicology as "surrogate" (replacement) compounds of nerve agents. The purity of the pesticides used was initially determined. The analysis was performed by gas chromatography with a flameionization detector (GC- FID). The amount of OPC was calculated as a percentage of the total amount of the peaks area; the resulting chromatograms are presented in Figures pa pa time Figure 16. Chromatogram of the product containing methylparathion time Figure 17. Chromatogram of paraoxon