МАС СПЕКТРОМЕТРИЯ ПРИЛОЖЕНИЕ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ

Препис

1 Приложение на високоразделителни течна хроматография и мас спектроскотия за охарактеризиране на биологично активни вещества, природни продукти и функционални храни Акад. Проф. Ваньо Митев дм, дбн Доц. инж. Валентин Лозанов дб МУ-София, Катедра Медицинска Химия и Биохимия

2 Аналитичен метод за измерване на молекулното маса на вещество Х m/z m = молекулна маса z = заряд на молекулата Y относителна интензивност

3 Какво прави мас спектрометъра? измерва молекулната маса най-прецизно от всички други техники. дава информация за химичната структура на изследваното вещество (проба) За какво може да се използва мас спектрометъра? За идентификация, потвърждение и количествено определяне на: метаболити, протеини,вещества изолирани от естествен източник, пептиди, захариди, липиди, нуклеотиди, лекарствени вещества, синтетични органични вещества, полимери всички органични вещества които могат да се йонизират

4 КАК РАБОТИ МАС СПЕКТРОМЕТЪРА? - Въвеждане на пробата в апарата - Генериране на йони в газова фаза - Разделяне на йоните в мас анализатора на база m/z - Детектиране на йоните - Обработка на резултата проба Вакум система йонизатор Мас анализатор детектор

5 КАК СЕ ДЕФИНИРА МАСА? За определяне на числената стойност на присъщото свойство на веществата "маса" като отправна точка се използва въглерод-12, 12 C. Единицата за маса се изразява в Далтон (Dalton, Da). ЕДИН ДАЛТОН СЕ ДЕФИНИРА КАТО 1/12 ОТ МАСАТА НА ЕДИН АТОМ ВЪГЛЕРОД Element Mass Abundance H %.15 C N Така, един въглероден атом (С) има маса от 12. Da.

6 Intensity ИЗОТОПИ Повечето елементи имат повече от един стабилен изотоп ЗАЩО ТОВА Е ВАЖНО? Мас спектрометъра може да види тези изотопи ако има достатъчно висока разделителна способност. Колкото по-висока е разделителна способност на мас спектрометъра толкова по-прецизно е измерването. tt_21_3 #1148 RT: AV: 1 NL: 1.93E8 F: FTMS + p ESI Full ms [3.-.] herb_2_ #1647 RT: AV: 1 NL: 7.92E5 F: ITMS - p ESI Full ms [.-.] W=395.2mmu 2311_2 #149 RT: 1. AV: 1 NL: 1.18E8 F: FTMS + p ESI Full ms [.-.] W=448.5mmu W=2.7mmu W=1.6mmu m/z m/z Моноизотопна маса m/z Средна маса

7 Няколко важни характеристики Масов обхват (Mass range): Какъв обхват от маси може да се измерят? Разделителна способност (Resolution): Колко добре са разделени масовите пикове? Точност на измерване на масата (Mass accuracy): Колко точно е измерена дадена маса спрямо теоретичната? Динамичен обхват (Dynamic range): Каква е разликата между най-ниско и най-високо интензивните масови пикове, които могат да се измерят в единичен скан? Чувствителност (Sensitivity): Колко е най-малкото количество вещество което може да се измери

8 Intensity Intensity Разделителна способност R=M/ M (m/z)/ (m/z) 2311_2 #747 RT: 7.36 AV: 1 NL: 7.94E4 F: FTMS + p ESI Full ms [.-.] R=339 W=11.2mmu 3 3 full width R=3294 W=11.5mmu R=3574 W=1.6mmu R=334 W=11.3mmu m/z M=FWHM 2311_2 #1767 RT: AV: 1 NL: 4.E5 F: FTMS + p ESI Full ms [.-.] R=194 4 W=157.2mmu Half mass R=194 W=89.2mmu R=54 W=295.4mmu R=84 W=194.9mmu R=814 W=211.8mmu m/z

9 Cuts Точност на измерване ppm= (M измерена - М теоретична )/М теоретична х 1 6 Точността на измерената маса пряко зависи от разделителната способност. Колкото е по-висока разделителната способност толкова по-точно се измерва масата. ppm<.5 Resolution =1 ppm< 5 Resolution = 3 ppm< Resolution = Mass (m/z)

10 ТИПОВЕ МАС СПЕКТРОМЕТРИ Йонизатор ESI MALDI CI APCI APPI EI PD FAB SELDI Мас анализатор Magnetic Sector Time of flight (TF) Quadrupole Ion Trap Linear Ion Trap rbitrap

11 Електроспрей йонизация (El) налягане = 1 atm диаметър = um ниско напрежение Градиент на вакума N 2 Проба в разтвор N 2 газ MH + MH 2 + MH 3 + Високо напрежение (~4 kv) Заредени капки

12 rbitrap принцип на работа Makarov A. Anal. Chem., 72, теоретична обосновка 5г - LTQ rbitrap Discovery първият търговски апарат на пазара.

13 Тандем (MS/MS) мас спектроскопия йонен източник Мас анализатор 1 колизионна клетка Мас анализатор 2 Изолиране на йон(и) фрагментиране детекция на фрагментните MS 1 колизия MS 2 йони gas MS gas gas MS/MS - йонни фрагменти на изолиран в MS1 йон(и) MS/MS - йон(и) в MS1 които имат фрагмент Х в MS2 MS/MS - йони имащи идентични неутрални фрагменти (MS1-MS2) В зависимост от типа на мас анализаторите има различни типове тандем мас апарати: Triple quadrupole (QqQ; QQQ), Q TF, Q Trap,TF - TF LTQ rbitrap Q rbitrap (QExactive)

14 Приложение на мас спектроскопия в метаболитни изследвания Метаболом съвкупност от всички метаболити в клетката, тъканите, органите и организма, които са крайни продукти на клетъчни процеси ( обикновено се отнася за вещества под Da) и играят съществена роля за нормално функциониране на живия организъм Създаване на карта - отпечатък на всички метаболити в конкретен жив организъм - амбициозна цел Метаболити - изключително разнообразие от химични вещества (амино киселини, гликозиди, липди, пурини, фосфати и много други) Силно динамична система променяща се понякога за секунди. Липса на универсални подходи за анализ различните класове химични съединения изискват специфични аналитични подходи Голямото разнообразие от вещества и липсата на директна генетична информация затруднява създаването на ефективни бази данни.

15 Количествен анализ на аминокиселини и биогенни амини чрез мас спектрометрия след дериватизация F F N R R 1 H(R)NH N пробоподготовка екстракция N FAESC Boric buffer ph 9-1, ACN R NH R 1 дериватизация Плазма, урина, клетъчни лизати, тъкани, продукти от животински и растителен произход мас анализ MS or MS/MS компютърен анализ NL: 2.44E8 Base Peak F: 9 FTMS + c ESI Full ms [.-.] MS 1411_9 7 резултати 3 1

16 D:\Analytical\aapa\AAPA_new\AAPA_27_8 7/26/18 17:3:3 RT: NL: 7.13E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 RT: NL: 4.97E F: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] MS AAPA_27_8 RT: NL: 1.63E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 RT: NL: 1.17E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 9.43E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 2.75E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 2.E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 6.78E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 2.5E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 2.79E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 6.24E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 9.31E F: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] MS AAPA_27_ NL: 1.18E F: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] MS AAPA_27_ NL: 5.82E F: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] MS AAPA_27_8 NL: 1.21E F: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] MS AAPA_27_8 NL: 1.62E F: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] MS AAPA_27_ NL: 1.86E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 1.28E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 8.14E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 8.21E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 2.31E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 4.E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 1.54E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_ NL: 1.3E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 5.65E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 8.E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 1.6E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 6.42E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 8.67E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8 NL: 1.8E F: FTM S + p ESI Full ms [1.-1.] M S AAPA_27_8

17 Area Количествен анализ на антиоксиданти в билкови екстракти чрез LC - HRMS D:\Analytical\antiox\antiox new\78_7 8/7/18 17:59:4 RT: NL: 1.42E8 TIC F: FTMS - p ESI Full ms [1.- 7.] MS 78_7 78_7 # RT: AV: 3 NL: 3.38E6 T: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] _7 RT: Mass: NL: 1.93E7 F: epicatechin Y = *X R^2 =.9975 W: Equal m/z m/z RT: SM: 11G RT: SM: 11G RT: SM: 11G NL: 3.64E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_ NL: 1.37E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_7 NL: 3.11E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_7 NL: 4.46E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_7 NL: 2.33E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_7 NL: 2.13E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_7 NL: 5.23E F: FTMS - p ESI Full ms [1.-7.] MS 78_7

18 Intensity Intensity Използване на високоразделителна мас спектрометрия и биоинформатика за доказване на произход на билков екстракт приложение при Portulaca oleraceа L. (тученица) d:\analytical\...\bg_1611_7_ /16/16 13:25:4 blank % MeH new column RT: NL: 4.12E9 TIC F: FTMS - c ESI Full ms [1.-.] MS BG_1611_ RT: NL: 6.84E9 TIC F: FTMS + c ESI Full ms [1.-.] MS bg_1611_7_ Изследвани 36 проби от различни региони на страната и Гърция Доказано наличие на 1832 индивидуални вещества в пробите

19 Сравнителен анализ на кисели млека произведени чрез различни шамове на Lactobacillus bulgaricus Изследвани 15 проби получени при използване на различни естествени шамове на Lactobacillus bulgaricus Идентифицирани 8 индивидуални вещества e:\2_ ?. 13:5:29?. sample 43 1 dil 2_16 #75 RT: 1. AV: 1 NL: 8.57E7 T: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] RT: A Въглехидратен профил NL: 5.4E9 TIC F: FTMS - p ESI Full ms 2.25 [.-1.] 2.43 MS 2_ E N L E6 2_15#236 RT: AV: 1 F: FTMS - p ESI 1 Fu ll m s @ hcd. m/z [ _15 #9 RT: 2.22 AV: 1 NL: 7.27E7 T: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] N L : E _15#2 RT: AV: 1 F: FTMS - m/z 9 p ESI Fu ll m s @ hcd. [ ] 2_15 # RT: AV: 8 NL: 5.77E T: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] _15 #389 RT: 3.74 AV: 1 NL: 3.25E6 T: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] m/z m /z RT: RT: SM: 11G RT: SM: 11G SM: 11G моно три тетра B C D NL: 8.E7 NL: 7.1E7 NL: 5.45E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS 2_ F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS 2_ F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS 2_ m/z Лактозни изомери при Lb. bulgaricus шам 43

20 Изследване структурата на неизвестни вещества чрез MS n MS MS/MS MS 3 Хроматографски чисто вещество изолирано от Geranium sanguineum (кръвен здравец) Селективен каспаза-3 инхибитор 6.43 MS 4 MS (R) H (R) H 2-hydroxy-2,3-dihydrogenistein R = H, pentose

21 Идентификация на онечиствания и замърсявания в търговски продукти brij_58_ #713 RT: 9.53 AV: 1 NL: 7.56E7 T: FTMS + p ESI Full ms [1.-1.] лош търговски вид на спиртна напитка (опалесценция (утайка)) RT: липидно онечистване в захар.3% m/z

22 Идентификация на известни вещества в сложни смеси (анаболни вещества в хранителни добавки) C H 3 C H 3 H H H 1,4-Androstadiene-3,17-dione H 3 C H 3 C H H Androstenedion H sample androstenedion 1,4-androstadien-3,17-dione П-Ccjl1523 detected * detected П-Ccj11111 detected * detected tt П-4 vsv n. d. n. d. Capsules # detected * detected Gul n. d. n.d. Guggul(synth) 111 n. d n. d NSU 5122-LCE n. d n. d

23 D:\Analytcal\phyto_hormons\PH_7_6 7/6/18 15:1:54 mix 38 1ug std 15 diluted buffer A 1/1 Количествен анализ на фито хормони и растежни регулатори RT: NL: 1.19E9 TIC F: FTMS + p ESI Full ms [.- 1.] MS PH_7_ NL: 3.43E8 TIC F: FTMS - p ESI Full ms [.- 1.] MS PH_7_ D:\Analytcal\phyto_hormons\PH_7_6 7/6/18 15:1:54 mix 38 1ug std 15 diluted buffer A 1/1 RT: RT: RT: NL: 1.19E TIC F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_ NL: 1.2E F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_ NL: 5.73E F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 9.36E F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 8.12E F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 5.13E F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 6.29E F: FTMS + p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_ No Compound MW [M+H]+ [M-H]- 1 GIBBERELLIN A GIBBERELLIC ACID (GA3) GIBBERELLIN A GIBBERELLIN A GIBBERELLIN A GIBBERELLIN A GIBBERELLIN A GIBBERELLIN A α-naphtaleneacetic ACID (NAA) N-(2-CHLR-4-PYRIDYL)-N'-PHENYLUREA THIDIAZURN (TDZ) trans-zeatin (tz) (±)-cis,trans-abscisic ACID (ABA) INDLE-3-ACETIC ACID (IAA) INDLE-3-BUTYRIC ACID (IBA) MEPIQUAT CHLRIDE DAMINZIDE (Alar, B-Nine) INDLE-3-PRPINIC ACID (IPA) PACLBUTRAZL UNICNAZLE FLURPRIMIDL ANCYMIDL TRIACNTANL (±)-JASMNIC ACID (JA) L-α-[(2-AMINETHXY)VINYL]GLYCINE(AVG) ERGSTERL (ERG) EPIBRASSINLIDE (EBI) FLURIDNE MALEIC HYDRAZIDE D:\Analytcal\phyto_hormons\PH_7_6 7/6/18 15:1:54 mix 38 1ug std 15 diluted buffer A 1/1 RT: RT: NL: 3.43E TIC F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_ NL: 5.1E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 5.98E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 8.83E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 9.88E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 1.74E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 1.26E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 1.26E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_ NL: 9.26E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 4.31E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 2.41E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 2.1E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 7.81E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6 NL: 5.9E F: FTMS - p ESI Full ms [.-1.] MS PH_7_6

24 БЛАГОДАРЯ ЗА ВНИМАНИЕТО

25 Всичко е ясно!? Някакви въпроси?