Microsoft Word HBe AG Ab PLUS (883599) BG V2.doc

Препис

1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS 2 микроплаки HBe Ag - 96 HBe Ab ДИАГНОСТИЧЕН НАБОР ЗА ОТКРИВАНЕ НА HВe Aг и HВe Aт ЧРЕЗ ИМУНОЕНЗИМЕН МЕТОД /01

2 СЪДЪРЖАНИЕ 1. ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ 2. КЛИНИЧНО ЗНАЧЕНИЕ 3. ПРИНЦИП НА ТЕСТА 4. СЪДЪРЖАНИЕ НА ДИАГНОСТИЧНИЯ НАБОР 5. НЕОБХОДИМ ИНВЕНТАР, НЕ ВКЛЮЧЕН В ДИАГНОСТИЧНИЯ НАБОР 6. ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ 7. УКАЗАНИЯ ЗА ХИГИЕНА И БЕЗОПАСНОСТ 8. ПРИГОТВЯНЕ НA РЕАГЕНТИТЕ 9. СРОК НА ГОДНОСТ - СЪХРАНЕНИЕ 10. ПРОБИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ 11. НАЧИН НА ПРИЛОЖЕНИЕ 12. ИЗЧИСЛЯВАНЕ И НТЕРПРЕТАЦИЯ НА РЕЗУЛТАТИТЕ 13. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ 14. КАЧЕСТВА НА ТЕСТА 15. БИБЛИОГРАФИЯ 2 [BG]

3 1 - ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ Диагностичният набор Monolisa HВe Ag-Ab PLUS е предназначен за качествено определяне на хепатит В антиген (HВe Ag) или антитела срещу хепатит В антигена (anti-hвe) чрез имуноензимен метод в човешки серум или плазма. 2 - КЛИНИЧНО ЗНАЧЕНИЕ Най-общо казано, наличието на HВe Ag отразява активна вирусна репликация в изследваното лице и служи за определяне стадия на инфекцията, в който е взета пробата. Антигенът Hвe (Hbe Ag) се появява в началото на хепатит В инфекцията. Персистирането му (повече от месец) е белег за задълбочаваща се чернодробна патология поради репликацията на вируса. Появата на антитела срещу HВe Ag означава намаляване на вирусната репликация и обикновено се приема като добър прогностичен признак. 3 - ПРИНЦИП НА ТЕСТА а) Определяне на HВe антиген Откриването на HВe Ag се основава на двустъпков сандвич имуноензимен метод. Използвано е човешко анти-hвe антитяло и двойка миши моноклонални анти-hвe антитела, маркирани с пероксидаза (mab1 и mab2). Моноклоналните антитела са насочени срещу различни епитопи. Твърдата фаза се състои от полистиренови стрипове с 8 ямки, натоварени с човешки анти - HВe антитела. Тестът включва следните етапи: 1. Инкубация на контролите и изследваните серуми с анти-hвe антителата, натоварени върху твърдата фаза. 2. Промиване, инкубация на фиксираните комплекси с маркираните спероксидаза моноклонални антитела. 3. Отстраняване на свободния конюгат чрез промиване; след това проявяване на фиксираната върху твърдата фаза ензимна активност с помощта на прибавения субстрат. 4. Стопиране на цветната реакция, отчитане на оптическата плътност на 450/620 nm и интерпретация на резултатите. b) Определяне на анти - HВe антитела За откриване на анти-hвe антителата се използва същата твърда фаза, която се използва и за откриване на HВe Ag. Тестът се основава на конкуренцията между антителата натоварени върху твърдата фаза и антителата, които се намират в изследваната проба, чрез използването на ограничени количества HВe Ag като неутрализиращ реагент. След това, изследването се осъществява чрез прибавянето на друга смес от моноклонални антитела, маркирани с пероксидаза. Тестът включва следните етапи: 1. Инкубация на контроли и неизследвани проби с анти-hвe антителата, натоварени върху твърдата фаза и неутрализиращия реагент. 2. Промиване, инкубация на фиксирания комплекс с антитела, маркирани с пероксидаза. 3. Отстраняване чрез промиване на свободния конюгат и след това проявяване на ензимната активност, свързана с твърдата фаза чрез прибавяне на субстрат. 4. Стопиране на цветната реакция, отчитане на оптическата плътност на 450/620 nm и интерпретация на резултатите 3 [BG]

4 4 - СЪДЪРЖАНИЕ НА ДИАГНОСТИЧНИЯ НАБОР Всички реагенти са само за ин витро приложение. Реагентите са предоставени в количества, достатъчни за изследване на 2х96 проби в 1 до 12 независими серии изследвания при следните комбинации: Или 96 определяния на HВe Ag и 96 определяния на анти- HВe Или 2х48 определяния на HВe Ag и 2х48 определяния на анти- HВe едновремено Mаркировка R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 HBe Ab positive control R5 HBe Ag positive control R6 Neutralizing HBe Ag R7a Concentrated anti HBe conjugate R7b Concentrated Ag HBe conjugate R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Състав на реагента Микроплака 12х8 стрипа, натоварени с човешки анти- HВe антитела, получени от положителна за HBs Ag плазма, инактивиранa Концентриран миещ разтвор (20X) Tris буфер на NaCl, ph 7.4 Консервант: ProClin 300 (0.04%) Отрицателна контрола Контролата е обща за HВe Ag теста и анти- HВe теста. Човешки серум отрицателен за HBs Ag,анти- HIV1, анти-hiv2 и анти-hcv антитела Консервант: < 0,1% натриев азид HВe Ab положителен контролен серум Дефибринирана човешка плазма, положителна за анти- HBe антитела, потенциално положителна за HBs Ag и отрицателна за анти-hiv1,анти-hiv2 и анти-hcv антитела, инактивирана. Консервант: < 0,1% натриев азид Hbe Ag положителен контролен серум Дефибринирана инактивирана човешка плазма, положителна за Hbe Ag и HbsAg, отрицателна за анти- HIV1, анти- HIV2 и анти- HCV антитела. Консервант: < 0.1% натриев азид Неутрализиращ HBe антиген Дефибринирана човешка плазма, положителна за Hbe Ag и HbsAg, отрицателна за анти-hiv1, анти- HIV2 и анти- HCV антитела, инактивирана Консервант: < 0.1% натриев азид Концентриран конюгат за анти-hbe теста (5X) Маркирани с пероксидаза 2 моноклонални анти Hbe антитела (mab1 и mab2)* Консервант: ProClin 300 (0.5%) Концентриран конюгат за Hbe Ag теста (5X) Маркирани с пероксидаза 2 моноклонални анти Hbe антитела (mab1 и mab2)* Консервант: ProClin 300 (0.5%) Су6стратен 6уфер на пероксидаза Разтвор на лимонена киселина и натриев ацетат с рн 4.0; съдържа Н 2 О 2 (0.015%) и DMSO (4%) Хромоген Разтвор, съдържащ тетраметил бензидин (ТМВ) Стопиращ разтвор 1 N разтвор на сярна киселина Празен флакон за разреждане на R2 Опаковка плаки 235 ml (8 ml) (1.5 ml) (1.5 ml) (8 ml) (3 ml) (3 ml) (60 ml) (5 ml) (28 ml) (25 ml) * Съотношението между моноклоналните антитела mab1 и mab2 е различно в конюгатите R7a и R7b. Не разменяйте двата конюгата. 4 [BG]

5 5 - НЕОБХОДИМ ИНВЕНТАР, НЕВКЛЮЧЕН В ДИАГНОСТИЧНИЯ НАБОР Дестилирана или напълно дейонизирана вода Натриев хипохлорит (домакинска белина) и натриев бикарбонат Попивателна хартия Ръкавици за еднократна употреба Пластмасови епруветки за еднократна употреба (12х75 мм) Ръчни или полу-автоматични, вариабилни или фиксирани пипети с обем 50 µl, 100 µl, 200 µl и 1ml Градуирани цилиндри с обем 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml Ажитатор тип Vortex Котейнер за заразоопасни отпадъци Ръчно, полу-автоматично или автоматично промивно устройство за микроплаки* Водна баня, термостатирана на 40 ±1 С или еквивалентен инкубатор за микроплаки* Отчитащо устройство за микроплаки, снабдено сфилтри с дължина на вълната 450 и 620 nm* (*) За подробности относно препоръчаната апаратура се обърнете към нашия Технически отдел. 6 - ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ Достоверността на резултатите зависи от стриктното спазване на следните правила за Добра Лабораторна Практика: Не смесвайте реагенти от различни партиди при изработване на една серия изследвания ЗАБЕЛЕЖКА: Допустимо е смесването на реагенти отразлични производствени партиди в една и съща серия изследвания за миещия разтвор (R2, маркировка: 20X, оцветена в зелено), субстратния бу ер на пероксидаза (R8, маркировка: ТМВ buf., оцветена в синьо), хромоген (R9, маркировка: ТМВ 11X, оцветена във виолетово) и стопиращ разтвор (R10, маркировка: 1N, оцветена в червено). Тези реагенти могат да бъдат използвани и с други продукти на Bio-Rad. Обърнете се към нашите технически служби за повече ин ормация.освен това, миещия разтвор (R2, маркировка: 20X, оцветена в зелено) може да бъде смесен в рамките на една серия изследвания с други два миещи разтвора, съдържащи се в различни диагностични набори, производство на Bio-Rad (R2, маркировка: 10X, оцветена в синьо или 10X, оцветена в оранжево) при условие, че е правилно приготвен. За поподробна ин ормация се обърнете към нашите технически служби. Името на теста, както и специфичен идентификационен номер на теста са отбелязани върху рамката на всяка плака, а също така и върху всеки стрип. Monolisa Hbe Ag-Ab PLUS: специфичен идентификационен номер = 56. Проверявайте специфичния идентификационен номер преди всяко изследване. В случаите когато идентификационният номер липсва или е различен от посочения тук, стрипът не трябва да се използва. Не използвайте реагенти с изтекъл срок на годност Преди употреба трябва да изчакате половин час, за да могат реагентите да се стабилизират на стайна температура и 1 час, за да се стабилизира разредения миещ буфер R2. Пригответе внимателно реагентите като внимавате да не ги замърсите. Не изработвайте теста в присъствие на реактивни изпарения (кисели, основни, алкални пари) или прах, които могат да увредят ензимната активност на конюгата. Използвайте добре измит и изплакнат с дейонизирана вода стъклен инвентар или инвентар за еднократна употреба (препоръчително). 5 [BG]

6 Не оставайте микроплаката да изсъхне между края на промивния цикъл и накапването на реагентите. Използвайте отделен наконечник за всяка изследвана проба. Промиването на ямката е критична стъпка от процедурата: спазвайте препоръчния брой промивни цикли и проверете дали ямката е изцяло напълнена и изпразнена. Лошото промиване може да доведе до получаване на недостоверни резултати. Никога не използайте един и същи контейнер за поставяне на конюгат и ензимно проявяващ разтвор. Проверявайте точността на пипетите и изправността на използваното оборудване. Не променяйте процедурата на изследването. Ензимно проявяващият (субстратен буфер+хромоген) трябва да бъде оцветен в розово. Промяната на розовото оцветяване няколко минути след приготвянето на разтвора означава, че той не може да бъде използван и трябва да се подмени. Ензимно проявяващият разтвор трябва да се приготвя в чист пластмасов съд за еднократна употреба или стъклен съд, който предварително трябва да бъде измит с 1N HCl, обилно изплакнат с дестилирана вода и подсушен. Реагентът се съхранява на тъмно. 7 - УКАЗАНИЯ ЗА ХИГИЕНА И БЕЗОПАСНОСТ Всички реагенти, включени в диагностичния набор са предназначени за ин витро приложение. При работа с реагентите и пробите, слагайте ръкавици за еднократна употреба Не пипетирайте с уста Материалът от човешки произход, употребен за приготвяне на реагент R3 (отрицателна контрола) е изследван и е отрицателен за повърхностен антиген на хепатит В вируса (HBs Ag) и антитела срешу човешкия вирус на имунната недостатъчност (анти-hiv1 и анти- HIV2) Материалът от човешки произход, използван за производство на реагент R1 (микроплака) е изследван и е отрицателен за антитела срещу човешкия вирус на имунната недостатъчност (анти-hiv1 и анти-hiv2). Положителен е за повърхностен антиген на хепатит В (HBs Ag). Инактивиран е чрез фотохимични методи. Материалът от човешки произход, използван за производството на реагенти R4 (анти-hbe положителна контрола), R5 (HBe Ag положителна контрола) и R6 (Неутрлизиращ HBe Ag) е изследван и е отрицателен за антитела срещу човешкия вирус на имунната недостатъчност (анти-hiv1 и Анти-HIV2) и антитела срещу хепатит С вируса (анти-hcv). R5 иr6 са положителни за повърхностен антиген на хепатит В вируса (HBs Ag), R4 е потенциално положителен за HBs Ag. Инактитвирани са чрез фотохимични методи. Тъй като няма диагностичен метод, който напълно да гарантира отсъствието на инфекциозни агенти, манипулирайте с реагентите и изследваните пробите като с потенциално инфекциозен материал. Оборудването, влязло в пряк контакт с пробите и реагентите, а също така и промивните води трябва да се считат за заразоопасни материали и да бъдат третирани като такива. Избягвайте разпръскването на изследваните проби или разтвори които съдържат пробите. Пръските трябва да бъдат почистени с 10% разтвор на белина. Ако замърсяващата течност е киселина, пръските трябва да бъдат неутрализирани с натриев бикарбонат и след това подсушени с попивателна хартия. Материалът, използван при почистването трябва да бъде изхвърлен в контейнера за заразоопасни отпадъци. 6 [BG]

7 Пробите и реагентите от човешки произход трябва да бъдат изхвърлени след обеззаразяване: - или чрез накисване за 30 минути в разтвор на белина с 5% крайна концентрация (1обем белина за 10 обема замърсени разтвори или вода). - или чрез автоклавиране на 121 С минимум за 2 часа. Автоклавирането е найдобрият метод за инактивиране HIV и HBV вирусите. НЕ СЛАГАЙТЕ В АВТОКЛАВА ТЕЧНОСТИ, КОИТО СЪДЪРЖАТ БЕЛИНА Не забравяйте да обеззаразите или автоклавирате разтворите, промивните води или каквито и да било течности, които съдържат биологичен материал преди да ги изхвърлите в канализацията. Списък с инструкциите за безопасност се предлага при поискване Химикалите трябва да се използват и съхраняват в съответствие с изискванията за Добра Лабораторна Практика. Избягвайте всякакъв контакт на кожата и лигавиците със субстратния буфер, хромогена и стопиращия разтвор (токсичност, дразнещо действие или изгаряне). За съвети относно рисковете и предпазните мерки, свързани с някои от химическите съставки на теста, прегледайте пиктограмите на етикетите и прочетете информацията в края на настоящата инструкция за употреба. Информационният лист за безопасност се предлага на ПРИГОТВЯНЕ НА РЕАГЕНТИТЕ Забележка: Преди употреба, оставете реагентите да се затоплят до стайна температура (18-30 С). Микроплака (R1) Всяка рамка, съдържаща 12 стрипа, е опакована във фолиев плик. С помощта на ножици или скалпел разрежете плика 0.5 до 1 см. над запечатването. Отворете плика и извадете рамката. Върнете неизползваните стрипове обратно в плика. Затворете го внимателно и отново го съхранявайте при температура +2-8ºС. Концентриран Миещ Разтвор (20X): R2 Разредете разтвора 1:20 с дестилирана вода, за да получите готов за употреба разтвор. Размесете. За един стрип са необходими 75 мл готов за употреба миещ разтвор. Концентриран конюгат за анти HBe теста (R7a) Разредете R7a 1:5 с приготвения R2 разтвор, в съответствие с използвания брой стрипове: Брой използвани стрипове О6ем R7a (мл) Допълнете с разреден R2 до (мл) [BG]

8 Размесете. Конюгатът R7a може да бъде използван така както е, без предварително разреждане, ако използвате следната процедура: прибавете в ямката 80 µl разреден миещ разтвор към 20 µl анти-hвe конюгат R7a. Размесете. Концентриран конюгат за HBe Ag теста (R7b) Използвайте същия протокол както за R7a конюгата. Ензимно проявяващ разтвор (R8+R9) Разредете реагент (R9) 1:11 с помощта на реагент R8 (Например: 1 мл от реагент R9 с 10 мл реагент R8). Хомогенизирайте. Необходими и достатъчни са 10 мл за 1 до 10 стрипа. 9 - СРОК НА ГОДНОСТ СЪХРАНЕНИЕ Съхранявайте диагностичния набор, след получаването му, на температура +2-8 С, Съхранявани на тази температура, всички реагенти са годни до датата, отбелязана върху етикета на външната опаковка (с изключение на реагентите, за които има специални указания). R1: След отварянето на вакуумно затворения плик, микроямковите стрипове, съхранявани при температура +2-8ºС в добре затворената оригинална опаковка, може да бъдат използвани за 1 месец. R2: Разреденият миещ разтвор може да се съхранява 2 седмици на С. Концентрираният миещ разтвор може да се съхранява С. R7a: Разреденият конюгат за анти-нве тест може да се съхранява 8 часа на С. Разреденият конюгат трябва да бъде защитен от светлина при съхранение на стайна температура ( С). R7b: Разреденият конюгат за HВe Ag тест може да се съхранява 8 часа на С. Разреденият конюгат трябва да бъде защитен от светлина при съхранениена стайна температура ( С). R8+R9: След приготвяне, ензимно проявяващият разтвор, съхраняван на тъмно и на стайна температура ( С) трябва да се употреби в рамките на 6 часа ПРОБИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ Пробите за изследване се вземат по обичайния начин. За изследване се използва неразреден серум или плазма (взетав антикоагуланти на основата на EDTA, цитрат, ACD). Отделете серума максимално бързо, за да избегнете хемолизата. Пробите, които съдържат агрегати трябва да бъдат избистрени преди изследването чрез центрофугиране. Фибринови агрегати или частички могат да доведат до получаване на фалшиво положителни резултати. Пробите се съхраняват на +2-8 С, ако изследването ще се извърши в рамките на 7 дни след вземането им или дълбоко замразени на -20 С. Не се загрява на пробите. Избягвайте многократните замразявания / размразявания. В случай, че пробите трябва да бъдат транспортирани, опаковавайте ги съгласно действащите разпордби за транспорт на заразоопасен материал. За предпочитане е да бъдат транспортирани замразени. НЕ ИЗПОЛЗВАЙТЕ ПРИ ИЗСЛЕДВАНИЯТА ЗАМЪРСЕНИ, ХИПЕРЛИПЕ- МИЧНИ ИЛИ ХЕМОЛИЗИРАЛИ СЕРУМИ. Забележка: Проби, съдържащи до 100 mg/l билирубин, липемични проби със съдържание на масти в количество до 36 g/l еквивалент на триолеин и хемолизирали проби със съдържание на хемоглобин до 2.5 mg/ml не оказват 8 [BG]

9 влияние на резултатите. Намаление в съотношенията са били наблюдавани при отрицателни проби с 45 mg/ml албумин НАЧИН НА ПРИЛОЖЕНИЕ Когато изследвате едновремено анти-нве и HBe Ag на една микроплака, ползвайте предложената работна схема за разпределение върху плаката: Анти-НВе тест: редове от 1 до 6 HBe Ag тест: редове от 7 до 12 а) протокол на анти-нве теста 1. Пригответе миещия разтвор 2. Извадете от опаковката един или няколко стрипа и рамката на плаката. Върнете в плика неизползваните стрипове и го затворете добре. 3. Накапете във всяка ямка както следва: А1, В1, С1: 100 µl отрицателна контрола (R3) D1: 100 µl положителна контрола (R4) Е1, F1, G1: 100 µl изследвана проба В зависимост от използваната система, може да промените местоположе -нието на контролите или реда на накапване. N.B: Има отчетлива разлика в оцветяването на празната ямка и ямката, в която има проба (жълта). Възможно е да се провери наличието на проба в ямката и чрез спектро отометрично отчитане на 490 nm (едновълно- во). Виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕ- ТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 4. Накапете бързо по 50 µl неутрализиращ (R6) във всяка ямка. Хомогенизирайте. Покрийте със самозалепващ се лист и инкубирайте 3 часа ± 10 минути на 37 С±1 С. N.В: Накапването на неутрализиращия HBe антиген (R6), който е оцветен в розово може да бъде контролирано визуално на този етап от манипу - лацията. Възможно е наличието на неутрализиращия HBe антиген да се провери и чрез спектро отометрично отчитане на 490 nm (едновълново отчитане). Виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 5. Пригответе разредения разтвор на конюгата R7a преди края на стъпка 4 от манипулацията. 6. Отстранете самозалепващия се лист. Изсмучете и изхвърлете в контейнера за заразоопасни материали съдържимото от ямките. След това промийте четири пъти. 7. Бързо, накапете във всяка ямка по 100 µl от разреден разтвор на конюгата R7a (Виж раздел 8. ПРИГОТВЯНЕ НА РЕАГЕНТИТЕ). Конюгатът R7a може да бъде използван неразреден като следвате посочената процедура: накапете първо 80 µl разреден миещ разтвор (R2) във всяка ямка и след това 20 µl анти-hвe конюгат R7a (5х). Размесете. Покрийте със самозалепващ се лист и инкубирайте за 30 минути на 37 С±1 С (минимум 25 минути и максимум 40 минути). Отстранете самозалепващия се лист, изсмучете съдържимото от всяка ямка и го изхърлете в контейнера за заразоопасни отпадъци. Промийте пет пъти. N.В: Накапването на разреден разтвор на конюгата R7а, който е оцветен във виолетово, може да бъде контролирано визуално на този етап от манипулацията. Възможно е наличието на разредения разтвор на конюгата R7а в ямката да бъде контролирано и чрез спектро отомет - рично отчитане 9 [BG]

10 на 620 nm (едновълновоотчитане).виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 8. Непосредствено преди употреба, пригответе ензимно проявяващия разтвор (R8+R9). Виж раздел 8: ПРИГОТВЯНЕ НА РЕАГЕНТИТЕ 9. Бързо накапете 80 µl ензимно проявяващ разтвор във всяка ямка. Поставете плаката на стайна температура ( С) и на тъмно за 30 ±5 минути. N.В: Накапването на ензимно проявяващия разтвор, който е оцветен в розово може да бъде контролирано визуално на този етап от манипулацията: Съществува отчетлива разлика между оцветяването на празната ямка и ямката съдържаща розово оцветения разтвор. Виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 10. Бързо накапете 100 µl стопиращ разтвор (R10) във всяка ямка. N.В: Накапването на стопиращия разтвор, който е безцветен може да бъде контролирано визуално на този етап от манипулацията. След накапването на стопиращия разтвор, розово оцветения субстрат при отрицателните проби се обезцветява; оцветения в синьо субстрат при положителните проби, променя цвета си в жълто. 11. Внимателно избършете дъното на плаката. Отчетете оптическата плътност не по-рано от 4 минути и не по-късно от 30 минути след накапване на стопиращия разтвор. Използвайте спектрофотометър с филтри с дължина на вълните 450/620 nm. b) Протокол на HBe Ag теста 1. Пригответе миещия разтвор. 2. Извадете от опаковката един или няколко стрипа и рамката на плаката. Върнете в плика неизползваните стрипове и го затворете добре. 3. Накапете в ямките по посочения ред: D1: 100 µl положителна контрола (R5) Е1, F1, G1: 100 µl изследвана проба N.B: Има отчетлива разлика в оцветяването на празната ямка и ямката, в която има проба (жълта). Възможно е да се провери наличието на проба в ямката и чрез спектро отометрично отчитане на 490 nm (едновълново). Виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 4. Покрийте със самозалепващ се лист и инкубирайте 3 часа ± 10 минути на 37 С±1 С. 5. Пригответе разтвора на конюгат R7b преди края на етап Отстранете самозалепващия се лист. Изсмучете съдържимото от всяка ямка и го изхвърлете в контейнера за заразоопасни отпадъци. След това промийте четири пъти. 7. Накапете бързо 100 µl разреден разтвор на конюгат (R7b) във всяка ямка. Конюгатът R7bможе да бъде използван и неразреден като следвате посочената процедура: накапете първо 80 µl разреден миещ разтвор (R2) във всяка ямката, а след това 20 µl анти-нве конюгат R7b (5х). Размесете. Покрийте със самозалепващ се лист и инкубирайте 30 минути (минимум 25 минути и максимум 40 минути) на 37 С±1 С. Отстранете самозалепващия се лист, изсмучете съдържимото от всяка ямка и го изхвърлете в контейнера за заразоопасни отпадъци, след това промийте плаката 5 пъти. N.В: Накапването на разредения разтвор на конюгата R7, който е тюркоазно оцветен, може да бъде контролирано визуално на този етап т манипулацията. Възможно е наличието на разредения разтвор на конюгатаr7b да бъде 10 [BG]

11 контролирано и спектро отометрично с илтър с дължина на вълната 620 nm (едновълново). Виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 8. Непосредствено преди употреба, пригответе ензимно проявяващия разтвор (R8+R9). 9. Накапете бързо 80 µl ензимно проявяващ разтвор (R8+R9) във всяка ямка. Поставете плаката за 30 ±5 минути на тъмно на стайна температура ( С). N.В: Накапването на ензимно проявяващия разтвор, който е розово оцветен, може да бъде контролирано визуално на този етап от манипулацията: Има отчетлива разлика в оцветяването на празна ямка и ямка с розово оцветената течност. Виж раздел 13: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ. 10. Бързо накапете 100 µl стопиращ разтвор (R10) във всяка ямка. N.В: Накапването на стопиращия разтвор, който е безцветен може да бъде контролирано визуално на този етап от манипулацията. След накапването на стопиращия разтвор, розово оцветения субстрат при отрицателните проби се обезцветява, синьо оцветения субстрат при положителните проби се оцветява в жълто. 11. Внимателно избършете дъното на плаката. Отчетете оптическата плътност с помощта на спектрофотометър снабден с филтри 450/620 nm. Отчитането трябва да се извърши не по-рано от 4 минути и не по-късно от 30 минути след стопиране на реакцията. в) Едновременно изра6отване на анти- HВe и HВe Ag теста (върху една и съща плака) Стъпките на процедурите са същите като описаните по-горе. Единствената промяна е в схемата на подреждане на контролите и пробите върху плаката и тя е следната: Анти- HВe тест: редове от 1 до 6. HВe Ag тест: редове от 7 до ИЗЧИСЛЯВАНЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ НА РЕЗУЛТАТИТЕ a) анти- HBe тест 1. Изчисляване на средната стойност на оптическата плътност (= опти- ческа плътност OD) на отрицателната контрола: Средна стойност (OD3) Пример: R3 Отрицателна контрола OD С6ор OD = Средна стойност (OD R3) = Сбор OD/3 = 4.569/3 = Само една стойност на отрицателната контрола (R3) може да бъде пренебрегната когато се отклонява с повече от 25% от средната стойност на отрицателната контрола. В тези случаи изчислeте средната стойност с помощта на другите две стойности на отрицателната контрола. 2. Изчисляване на праговата стойност За всяка плака праговата стойност (СО) се изчислява по следната формула: Прагова стойност (СО) = Средна стойност на отрицателна контрола (OD R3) x [BG]

12 Пример: Средна стойност (OD R3) =1.523 СО = х 0.4 = Валидиране на анти-нве теста Средна стойност (OD R3) >0.900 OD R4< Изчисляване на съотношението За всяка проба съотношението се изчислява по следната формула: Съотношение = OD проба / СО 5. Интерпретация на резултатите Пробите трябва да се считат за: положителни когато стойността на съотношението е по-малка или равна на 0.9 (съотношение 0.9) отрицателни когато стойността на съотношението е по-голяма от 1.1 (съотношение > 1.1) Когато стойностите са в границите между 0.9 и 1.1 се препоръчва изследването за анти-нве да бъде повторено чрез последващо накапване на пробата. Препоръчва се първично положителните проби да бъдат изследвани отново в две ямки ( на дубъл ). Ако при повторното изследване поне една стойност е положителна се приема, че пробата е положителна. b) HBe Ag тест 1. Изчисляване на средната стойност от оптическите плътности (OD) на отрицателната контрола: средна стойност (ODR3): Пример: R3 Отрицателна контрола OD С6ор OD = Средна стойност (ODR3) = Сбор OD/3 = 0.071/3= Само една стойност на отрицателната контрола може да бъде елиминирана, ако се отклонява с повече от 25% от средната стойност. В тези случаи средната стойност се изчислява с помощта на другите две стойности. 2. Изчисляване на праговата стойност (СО) За всяка плака праговата стойност (СО) се изчислява по следната формула: Прагова стойност (СО) = средна стойност (OD R3) Пример: СО = = Валидиране на HBe Ag теста Средна стойност (OD R3) < OD R5 > Изчисляване на съотношението За всяка проба съотношението се изчислява по следната формула: Съотношение = OD проба / СО 12 [BG]

13 5. Интерпретация на резултатите: Пробата се счита за: положителна когато стойността на съотношението е по-голяма или равна на 1 (съотношение 1) отрицателна когато стойността насъотношението е по-малка от 1 (съотношение < 1) Препоръчва се първично положителните проби да бъдат изследвани отново в две ямки. След изследването, ако поне един от резултатите е положителен пробата се приема за положителна СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН КОНТРОЛ НА НАКАПВАНЕТО НА ПРОБИТЕ И РЕАГЕНТИТЕ 1. Анти- НВе тест Наличие на про6и и контроли Наличието на проби и контроли в ямките може да проверено чрез автоматично отчитане на 490 nm. Всяка ямка, която съдържа проба или контрола трябва да има OD по-голяма от Наличие на неутрализиращ HBe Ag (R6) Наличието на неутрализиращия HBe Ag в ямките може да бъде проверено чрез автоматично отчитане на 490 nm и изчисляване на делта OD Делта OD = (OD490 проба (или контрола ) с R6 ) (OD490 проба (или контрола) без R6). Стойността на делта OD трябва да бъде по-голяма от Наличие на концентриран конюгат за анти-нве теста (R7a) Наличието на разреден конюгат R7a в ямките може да бъде контролирано чрез автоматично отчитане на 620 nm. Стойността на OD във всяка ямка трябва да бъде по-голяма или равна на и по-малка или равна на Наличие на ензимно проявяващ разтвор (R8+R9) Наличието на ензимно проявяващ разтвор в ямките може да бъде проверено чрез автоматичното отчитане на 490 nm. Стойността на OD във всяка ямка трябва да бъде по-голяма от HBe Ag тест Наличие на про6и и контроли Наличието на проби и контроли в ямките може да проверено чрез автоматично отчитане на 490 nm. Всяка ямка, която съдържа проба или контрола трябва да има OD по-голяма от nm. Наличие на концентриран конюгат за HBe Ag теста (R7b) Наличието на разреден конюгат R7b в ямките може да бъде контролирано чрез втоматично отчитане на 620 nm. Стойността на OD във всяка ямка трябва да бъде по-голямa от Наличие на ензимно проявяващ разтвор (R8+R9) Наличието на ензимно проявяващ разтвор в ямките може да бъде проверено чрез автоматичното отчитане на 490 nm. Стойността на OD във всяка ямка трябва да бъде по-голяма от [BG]

14 14 - КАЧЕСТВА НА ТЕСТА Качествата на теста Monolisa HBe Ag-Ab PLUS, обобщени по-долу, са изпитани в две лаборатории върху проби от кръводарители, пациенти и сероконвертни панели. 1. HBe Ag тест Специфичност Специфичността, установената върху изследванията на 200 проби от случайни кръводарители, е 100% [ %] (IC95). Освен това специфичността беше зледвана върху проби от пациенти и се установи 100% [ %] (IC95, 416/416 проби). Изследванията, на проби от 195 пациенти със заболявания или състояния несвързани с хепатит В инфекция (бременни жени, пациенти с положителен ревматоиден фактор, с анти-нуклеарни антитела, с анти-миши IgG антитела или с други вирусни или бактериални инфекции) показаха специфичност от 99.49% [ %] (IC 95, 194/195 проби установени като отрицателни). Аналитична чувствителност При изследванията с PEI стандарта праговата чувстителност на теста беше установена на 0.64 IU/ml [ ] (IC95). Чувствителност Чувствителността беше изследвана с помощта на 203 положителни проби от проследявани пациенти с HBV инфекция и търговски сероконвертни панели. Чувствителността върху тези проби беше установена на 99.51% [ %](IC 95, 202/203 проби). Възпроизводимост на изследванията Възпроизводимостта на изследванията с теста Monolisa HBe Ag-Ab PLUS беше определена чрез изследване на 4 проби: 1 отрицателна проба, 1 слабо положителна за HBe Ag проба, 1 силно положителна за HBе Ag проба и 1 интермедиерна проба, положителна за HBе Ag. Възпроизводимостта в серията изследвания беше установена, като тези 4 проби бяха изследвани 30 пъти в една и съща серия изследвания. Възпроизводимостта между сериите изследвания беше установена чрез изследване на тези проби на дубъл в продължение на 20 дни с ритъм от две изследвания на ден. Резултатите са посочени на следните таблици: Та6лица 1: Възпроизводимост в серията изследвания n = 30 Про6а 1 Про6а 2 Про6а 3 Про6а 4 Средна стойност съотношение Стандартно отклонение(sd) CV (%) [BG]

15 Та6лица 2: Възпроизводимост между сериите изследвания n = 80 Про6а 1 Про6а 2 Про6а 3 Про6а 4 Средна стойност сътоншение Стандартно отклонение (SD) CV (%) Анти-НВе антитела тест Специфичност Специфичността, установена при изследване на проби от 200 случайни дарители е 100% [ %], (IC95). Освен това специфичността беше изчислена на базата на резултатите от изследвани проби от 206 пациенти и е 98.54% [ %], IC95 (203/206). Изследвани са проби от 198 пациенти със заболявания или състояния несвързани с хепатит В вирусна инфекция ( бременни жени, пациенти с положителен ревматоиден фактор, с анти-нуклеарни антитела, с анти-миши IgG антитела). Три от тези проби са дали положителен резултат (2 са HCV положителни и една е с положителен ревматоиден фактор). Специфичността, изчислена върху тази популация е 98.48% [ %] (IC95,195/198 проби, установени като отрицателни). Тези проби бяха изследвани повторно; пробата с положителен ревматоиден фактор е двукратно положителна. Двете проби положителни за HCV са или отрицателни или съмнителни при повторния скрининг. Чувствителност Изследванията на чувствителността бяха извършени върху 220 проби от проследявани пациенти с хроничен хепатит В и върху търговски панели. Установената чувствителност е 98.64% [ %] (IC 95, 217/220 проби). Възпроизводимост на изследванията Възпроизводимостта на изследванията с теста Monolisa HBe Ag-Ab PLUS беше определена чрез изследване на 4 проби: 1 отрицателна проба, 1 слабо положителна за анти-hbe антитела проба, 1 силно положителна за анти -HBе антитела проба и 1 интермедиерна проба за анти- HBе антитела. Възпроизводимостта в серията изследвания беше установена, като тези 4 проби бяха изследвани 30 пъти в една и съща серия изследвания. Възпроизводимостта между сериите изследвания беше установена чрез изследване на тези 4 проби на дубъл в продължение на 20 дни с ритъм от две изследвания на ден. Резултатите са посочени на следните таблици: 15 [BG]

16 Та6лица 1: Възпроизводимост в серията изследвания n=30 Про6а 1 Про6а 2 Про6а 3 Про6а 4 Средна стойност съотношение Стандартно отклонение (SD) CV(%) Та6лица 2: Възпроизводимост между сериите изследвания n = 80 Про6а 1 Про6а 2 Про6а 3 Про6а 4 Средна стойност на сътношенията Стандартно отклонение(sd) CV(%) РЕФЕРЕНЦИИ 1 - MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l'hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L'ADN du virus de l'hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l'antigène HBe et l'anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l'hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); [BG]

17 17 [BG]

18 18 [BG]

19 19 [BG]

20 20 [BG]

21 21 [BG]