НАУЧНИ ТРУДОВЕ НА РУСЕНСКИЯ УНИВЕРСИТЕТ , том 48, серия 9 Химичен състав, антимикробна и антиоксидантна активност на екстракти от смес на плодов

Препис

1 Химичен състав, антимикробна и антиоксидантна активност на екстракти от смес на плодове от черен пипер (Piper nigrum L.), кимион (Cuminum cyminum L.) и кориандър (Coriandrum sativum L.) Велизар Гочев, Таня Гирова, Иванка Стоилова, Красимира Добрева, Албена Стоянова Abstract. The chemical composition of the extracts with 70 % ethanol of the mixture of black pepper:cumin=1:1 ( extract 1) and of the mixture of black pepper:cumin:coriander=1,5:1:0,5 (extract 2) was analysed using GC and GC/MS. The main compounds of the extract 1 were β-caryophyllene (20,84 %), cuminaldehyde 37,22 %) and p-menthadiene-1,4-al-7 (13,82 %). The main constituents of the extract 2 were β-caryophyllene (26,84 %) and cuminaldehyde (35,05 %). Antimicrobial testing showed high activity of the extracts against the Gram-positive bacteria as well the Gram-negative bacteria. The concentrations necessary for 50 % neutralization of the respective radicals (IC 50 ) were 0,41 mg/cm 3 и 0,47 mg/cm 3 for DPPH, respectively. Key words: Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activity, extracts from mixture of black pepper, cumin and coriander. ВЪВЕДЕНИЕ Плодовете на черен пипер (Piper nigrum L.), кимион (Cuminum cyminum L.) и кориандър (Coriandrum sativum L.) са едни от най-използваните в ХВП, поради съдържанието на различни биологично-активни вещества [2, 3]. Днес тези подправки се използват и под формата на екстракти [3], като е установено, че проявяват антимикробна [11, 20] и антиоксидантна активност [9, 10, 16, 21], дължаща се основно на съдържанието на етеричното масло. В предишни наши изследвания са установени най-подходящите технологични параметри за получаване на екстракти с етилов алкохол на смес от подправките черен пипер:кимион = 1:1 [6] и смес от черен пипер:кимион:кориандър = 1,5:1:0,5 [7]. Няма данни за определяне на химичния състав, антимикробната и антиоксидантната активност на екстракти от смес на плодове от черен пипер, кимион и кориандър, което е и цел на настоящата работа. ИЗЛОЖЕНИЕ Материали. Изследвани са два екстракта, получени чрез екстракция със 70 % етилов алкохол и следващо изпарение на разтворителя на вакуумизпарител екстракт 1 (смес от плодове на черен пипер :кимион = 1:1) [6] и екстракт 2 (смес от плодове на черен пипер:кимион:кориандър = 1,5:1,0: 0,5 [7]. Химичен състав на ароматичните продукти. На екстрактите е определено съдържание на етерично масло [8]. Неговият състав е изследван чрез GC анализ чрез апарат Agilent 7890A с пламъчно-йонизационен детектор; колона HP-INNOWax Polyethylene Glycol (60 m x 0,25 mm; филм 0,25 µm); температурни условия: 70 О С/10 min, О C при 5 О C/min, 240 О C-5 min; О C при 10 О C/min, 250 О C/15 min; газ носител хелий, 1 cm 3 /min постоянна скорост; инжектор: split, 250 О C, split съотношение 50:1. За MS/GC анализа е използван апарат Agilent 5975 C, газ носител хелий, колоната и температурните условия са както при GC анализа; детектори: FID,280 О C, MSD, 280 О C transfer line. Антимикробна активност. Изследвани са тест-култури, които са най-често срещаната микрофлора по хранителните продукти. Една част от тях са изолирани от месни продукти от търговската мрежа, съгласно стандартни методи на ISO [5, 14], а референтните тест-култури са получени от НБПМКК, София. Идентификацията на изолираните хигиенно-индикаторни и патогенни микроорганизми е осъществена чрез прилагане на 29 биохимични теста [4]. Всички използвани тест-микроорганизми са

2 депозирани в микробната културална колекция на катедра Биохимия и микробиология при Биологическия Факултет на ПУ П. Хилендарски, Пловдив. Антимикробната активност е определена чрез: * дисков агар дифузионен тест, описан от Sacchetti и съавт.[19], съгласно препоръките на National Committeeor Clinical Laboratory Standards (NCCLS) [15]; * метод на серийните разреждания (МСР), съгласно методиките на Franz и съавт. [12], Hili и съавт. [13] и Pauli [18], в съответствие с препоръките на NCCLS [15]. За определяне на минималната бактерицидна концентрация (МBС), по 100 µl от всяка степен на разреждане са инокулирани върху петриеви блюда с месопептонен агар и са култивирани при условията, посочени в МСР. След края на култивирането е определен броят на колониите прораснали във всяко петриево блюдо. МBС е дефинирана, като най-ниската концентрация на изследваната проба, унищожила над 99,9 % от клетките в изходния нетретиран инокулат. Антиоксидантна активност по метода на Mensor и съавт. [15]. Резултати и обсъждане. Количеството на етерично масло е 3,0 % в екстракт 1 и 2,5 % в екстракт 2, като не се различава от данните в литературата [3]. Съдържанието на ароматичните вещества е представено на табл. 1. От данните се вижда, че в екстракт 1 са идентифицирани 28 компонента (91,72 % от общия състав), като 10 от тях са над 1 %, а останалите 18 под 1 %. В екстракта преобладават ароматните съединения (42,30 %), следвани от сескитерпеновите въглеводороди (29,48 %), монотерпеновите кислородни производни (16,26 %) и сескитерпеновите кислородни производни (8,53 %). Ароматните съединения са представени основно от: куминов алдехид (37,22 %) и куминов алкохол (1,06 %); сескитерпеновите въглеводороди - от β-кариофилен (20,84 %) и α-хумулен (1,62 %); монотерпеновите кислородни производни - от р-ментадиен-1,4-ал-7 (13,82 %), а сескитерпеновите кислородни производни - от кариофиленоксид (3,81 %), спатуленол+пиперонал (2,18 %) и каротол (1,83 %). Tаблица 1. Съдържание на ароматични вещества в екстракти от смес на плодове от черен пипер, кимион и кориандър, %. Компоненти 1* 2 Компоненти Лимонен 0,21 2,63 18 γ-муролен 0,14-2 γ-терпинен 0,35 -** 19 β-селинен 0,72 1,28 3 р-цимен 0,45 0,35 20 α-селинен 0,56 0,86 4 Оцетна киселина 1,45 1,27 21 Геранилацетат - 0,71 5 α-кубебен 0,15-22 δ-кадинен 0,58 0,52 6 Фурфурал 0, Пиперидинкарбоксиалдехид - 0,50 7 α-терпинен 1,00 0,95 24 Куминов алдехид 37,22 35,05 8 α-копаен 0,65 0,70 25 р-ментадиен-1,4-ал-7 13,82 2,71 9 Линалол 0,11 0,17 26 Карвакрол 0,07-10 р-ментадиен-ол-7-2,59 27 Кариофиленоксид 3,81 5,23 11 β-елемен 0,73 1,00 28 Каротол 1,83 2,08 12 Терпинен-4-ол 0,22-29 р-ментадиен-1,4-ол-7 0,76 0,65 13 β-кариофилен 20,84 26,84 30 Лонгипинокарвон - 1,08 14 γ-елемен 0,14-31 Куминов алкохол 1,06 1,33 15 Фарнезен 0,61 0,58 32 Тимол - 0,26 16 α-хумулен 1,62 2,03 33 Спатуленол+пиперонал 2,18 3,73 17 β-бизаболен 0,30-34 Кариофила-4,8-диен- 5-ол - 0,

3 * - екстракти; ** - липсва в екстракта В екстракт 2 са идентифицирани 26 компонента (95,67 % от общия състав), като 14 от тях са над 1 %, а останалите 12 под 1 %. В екстракта преобладават ароматните съединения (36,99 %), следвани от сескитерпеновите въглеводороди (33,81 %), сескитерпеновите кислородни производни (11,61 %); монотерпеновите кислородни производни (7,91 %) и монотерпеновите въглеводороди (3,58 %). Ароматните съединения са представени основно от: куминов алдехид (35,05 %) и куминов алкохол (1,33 %); сескитерпеновите въглеводороди - от β-кариофилен (26,84 %), α-хумулен (2,03 %) и β-селинен (1,28 %); сескитерпеновите кислородни производни - от кариофиленоксид (5,23 %), спатуленол+пиперонал (3,73 %) и каротол (2,08 %); монотерпеновите кислородни производни от р-ментадиен-ол-7 (2,59), р-ментадиен-1,4-ал-7 (2,71 %) и лонгипинокарвон (1,08 %), а монотерпеновите въглеводороди от лимонен (2,63 %). Резултатите от определяне на антимикробния ефект са представени в табл. 2. От данните се вижда, че и двата екстракта проявяват антимикробна активност спрямо всички изследвани тест-микроорганизми. Gram-положителните бактерии са почувствителни спрямо изследваните екстракти (зони на инхибиране между 11,3 до 12,7 mm), като минималната бактерицидна концентрация е 0,4 %. Изследваните Gram-отрицателни бактерии са по-малко чувствителни (зони на инхибиране между 6,3 до 8,7 mm) с минимална бактерицидна концентрация 0,8 %. Това се дължи на разликата в строежа и състава на клетъчната стена на двете групи бактерии. Наличието на външна мембрана при Gram-отрицателните бактерии затруднява дифузията на екстрактите през мембраната към протоплазмата на клетката, което ги прави по-устойчиви под действието на изследваните екстракти. Таблица 2. Антимикробна активност на екстракти от смеси на плодове от черен пипер, кимион и кориандър. Тест-микроорганизми Екстракт 1 Екстракт 2 IZ, mm MBC*, % IZ, mm MBC, % Bacillus cereus ATCC ,3 ± 0,58 0,4 11,7 ± 0,58 0,4 Staphylococcus aureus 12,7 ± 1,15 0,4 12,3 ± 1,53 0,4 Staphylococcus aureus ATCC ,7 ± 0,58 0,4 12,7 ± 0,58 0,4 Citrobacter diversus 8,3 ± 0,58 0,8 7,7 ± 0,58 0,8 Escherichia coli 8,0 ± 0,66 0,8 8,3 ± 0,58 0,8 Escherichia coli ATCC ,3 ± 0,58 0,8 7,7 ± 0,58 0,8 Pantoea aglomerans 7,3 ± 0,58 0,8 7,7 ± 0,58 0,8 Proteus vulgaris 8,7 ± 0,53 0,8 8,3 ± 0,58 0,8 Pseudomonas aeruginosa 6,3 ± 0,58 0,8 6,7 ± 0,58 0,8 Salmonella abony 7,3 ± 0,58 0,8 7,3 ± 0,50 0,8 * За всички изследвани случаи MIC съвпада MBC Получените резултати за различната устойчивост на Gram-положителните и Gram-отрицателните бактерии спрямо инхибитори на микробния растеж съвпадат с литературните данни за ароматични продукти от изследваните подправки [11, 20]. Установените малки разлики в зоните на инхибиране за един и същ тест-микроорганизъм при двата екстракта се обясняват с варирането в съдържанието на етеричното масло и съдържащите се в него ароматични вещества. Антиоксидантната активност на двата екстракта е определена спрямо свободния DPPH радикал, като данните от инхибирането му са представени на фиг. 1. Найвисок процент на инхибиране на свободния радикал DPPH (88,1 %) се постига от екстракт 1 при концентрация 1 mg/cm 3. Почти в същата степен се улавя DPPH радикалът и от екстракт 2 ( 80,2 %) при същата концентрация. В сравнение с тради

4 ционно силните антиоксиданти аскорбинова киселина, рутин, BHT и BHA, изследваните екстракти имат по-ниска антиоксидантна активност, която е от порядъка на 0,2 до 1,0 µg/cm 3 [1]. Инхибиране на DPPH, % Концентрация, mg/cm Фиг. 1. Антиоксидантна активност на екстракти от смеси на плодове от черен пипер, кимион и кориандър спрямо DPPH радикала. - Екстракт 1; - Екстракт 2. За антиоксидантната активност най-често се съди по концентрацията, необходима за 50 % улавяне на радикала IC 50. Колкото е по-ниска тази стойност, толкова са по-силни антиоксидантните свойства на изследваното вещество. Екстракт 1 е с по-висока антиоксидантна активност, в сравнение с екстракт 2, стойностите на IC 50 са съответно 0,41 mg/cm 3 и 0,47 mg/cm 3. Получените резултати потвърждават данните от литературата за антиоксидантна активност на ароматични продукти от плодове на черен пипер, кимион и кориандър [9, 10, 16, 21]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В екстрактите, получени при преработката на смес от плодове на черен пипер: кимион (1:1) и черен пипер:кимион:кориандър (1,5:1:0,5) със 70 % етилов алкохол преобладават ароматични компоненти, които са основни за етеричните масла от плодове на черен пипер (β-кариофилен) и на кимион (куминов алдехид и р-ментадиен-1,4-ал-7). На тях се дължи и специфичния и характерен мирис на получените екстракти. Екстрактите проявяват по-изявена антимикробна активност спрямо Gram-положителните бактерии, в сравнение с Gram-отрицателните бактерии. Те притежават и антиоксидантна активност спрямо DPPH радикала. ЛИТЕРАТУРА [1] Атанасова Т., И. Стоилова, А. Стоянова - Изследване на плодове от анасон (Pimpinella anisum L.). 6. Антиоксидантна активност на етерични масла, Научни трудове на СУ, Пловдив, серия В. Техника и технологии, т. 12, 2008, [2] Боева А., Л. Нонинска, М. Цанова Подправките като храна и лекарство, София, Изд. Медицина и физкултура, [3] Георгиев Е., А. Стоянова Справочник на специалиста от ароматичната промишленост, БНАЕМПК, Пловдив, [4] Гирова Т., В. Гочев - Ръководство по микробиологичен контрол на храни, КСИ, Пловдив, [5] Гирова Т., В. Гочев - Микробиологичен мониторинг на месни продукти от търговската мрежа на град Пловдив за периода г., Научни трудове ПУ П. Хилендарски, т. 41, 2007, 6, [6] Добрева К. Проучване върху добива на олеорезини от смеси на подправки. 1. Плодове от черен пипер (Piper nigrum L.) и кимион (Cuminum cyminum L.), Юби

5 лейна научна сесия 100 години научноизследователска работа с етерично-маслените и лечебни култури в България, 1-2 юни, Казанлък, 2007, [7] Добрева К. - Проучване върху добива на екстракти от смеси на подправки. 2. Плодове от черен пипер (Piper nigrum L.), кимион (Cuminum cyminum L.) и кориандър (Coriandrum sativum L.), Научни трудове УХТ, т. 54, 2007, св. 1, [8] Стоянова А., Е. Георгиев, Т. Атанасова Ръководство за лабораторни упражнения по Технология на етеричните масла, Пловдив, Акад. Изд. УХТ, [9] Beddows C., C. Jagait, M. Kelly - Preservation of alpha-tocopherol in sunflower oil by herbs and spices, Internatonal Journal of Food Sciences and Nutrition, v. 51, 2000, 5, [10] Dang M., M. Takacsova, D. Nguyen, K. Kristianova - The influence of extracts and essential oils from various spices on the oxidation stability of lard, Czech Journal of Food Sciences UZPI (Czech Republic), v. 18, 2000, [11] Ertürk Ö. - Antibacterial and antifungal activity of ethanolic extracts from eleven spice plants, Biologia, v. 61, 2006, 3, [12] Franz C., A. Mathe, G. Buchbauer (editors) - Essential oils: Basic and Applied research, Carol Stream: Allured Publishing Corporation, 1996, [13] Hili P., C. Evans, R. Veness - Antimicrobial action of essential oils: effect of DMSO on the activity of cinnamon oil, Lett. Appl. Microbiol., v. 24, 1997, [14] ISO 4833: Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of microorganisms - Colony-count technique at 30 degrees C. [15] Mensor L., F. Menezes, G. Leitao - Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method, Phytotherpie, v.15,2001, [16] Nakatani N., R. Inatani, H. Ohta, A. Nishioka - Chemical constituents of pepper (Peper spp.) and application to food preservation: naturally occurring antioxidative compounds, Environ Health Perspect, v. 67, 1986, [17] National Committee Clinical Laboratory Standards, Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard, 1990, NCCLS Publication M7-A2, Villanova, PA, USA. [18] Pauli A. - Anticandidial low molecular compounds from higher plants with special reference to compounds from essential oils, Medicinal Research Reviews, v , 2, [19] Sacchetti G., S. Maietti, M. Muzzoli, M. Scaglianti, S. Manfredini, M. Radice, R. Bruni - Evaluation of 11 essential oils of different origin as functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods, Food Chemistry, v. 91, 2005, [20] Souza E., T. Stamford, E. Lima, V. Trajano, J. Filho - Antimicrobial effectiveness of spices: an approach for use in food conservation systems, Brazilian Archives of Biology and Technology, v.48, 2005, 4, [21] Yanishlieva N., E. Marinova, J. Pokorný - Natural antioxidants from herbs and spices, European Journal of Lipid Science and Technology, v. 108, 2006, 9, За контакти: Гл. ас. д-р инж. Велизар Гочев, Катедра Биохимия и микробиология, ПУ П. Хилендарски, Пловдив. Гл. ас. Таня Катедра Биохимия и микробиология, ПУ П. Хилендарски, Пловдив. Доц. д-р инж. Иванка Стоилова, Катедра Биотехнология, УХТ - Пловдив. Гл. ас. д-р Красимира Добрева, Технически колеж Ямбол, ТУ Стара Загора. Проф. дтн инж. Албена Стоянова, Катедра Технология на тютюна, захарта, растителните и етерични масла, УХТ - Пловдив. Докладът е рецензиран