СПРАВКА за приносите и научно-изследователските направления в трудовете на доц. д-р Пенка Ангелова Мончева Научно-изследователската работа на доц. д-р Пенка Мончева е концентрирана в областта на бактериологията в следните три основни направления: 1. Биология на актиномицети-продуценти на антибиотици 2. Биология на млечнокисели бактерии 3. Биоразнообразие на фитопатогенни бактерии 1. Биология на актиномицети-продуценти на антибиотици В общия списък на публикациите са представени научни разработки, проведени преди хабилитацията ми като доцент, върху изучаването на биологията на актиномицети-продуценти на антибиотици. Изследвано е разнообразието на тази група микроорганизми в почви от различни географски райони по света, изучени са някои аспекти от регулацията на антибиотикообразуването при вида Streptomyces hygroscopicus 155 и Streptomyces albogriseolus 444. Разработени са лабораторна и промишлена технология за получаването на антибиотици от вида S. hygroscopicus 155 (направено е промишлено внедряване в производството на антибиотика пандавир, в което съм била член на колектива-внедрител), изследвани са въпроси, свързани с диференциацията на стрептомицетите и ролята на калциевите йони в тях и др. (Публикации 9*, 10*, 16*, 17*, 18*, 19*, 20*, 21*, 22*, 23*, 24*, 26*, 7*, 28*, 29*, 30*, 31* и 32* ). Изследванията в областта на биологията на актиномицети-продуценти на антибиотици продължих и след хабилитацията като доцент. - За първи път е направено изследване на биоразнообразието на актиномицетните съобщества в почви от о. Ливингстон, Антарктика. Изолирани и характеризирани са по различни признаци голям брой актиномицетни щамове и е извършен скрининг на тяхната антимикробна активност. Антибактериалните вещества на най-активните щамове са 1
характеризирани и частично пречистени. Изпитана е тяхната активност в условия in vivo за обеззаразяване на семена от патогени по доматите. Създадена е богата колекция от антарктически актиномицетни щамове в катедрата, които са обект на проучвания и от други изследователи. (Публикации 41, 46, 48, 59, 62). - Доказана е индуциращата и стимулираща роля на калциевите йони в процеса на морфологичната диференциация, съответно на Streptomyces hygroscopicus 155-0 (неактивен вариант на родителския щам по отношение на образуването на антибиотик) и Streptomyces hygroscopicus 155. Тяхната роля е потвърдена чрез блокирането на индуциращата и стимулиращата им роля от модулатори на калциевите канали. Изказано е предположение за възможното функциониране на калмодулинподобни протеини с калций-свързваща функция, подобно при еукариотите, а впоследствие е изолиран и частично пречистен белтък с такава роля (Публикация 36, 37). - Доказана е индуциращата роля на продуцираните от родителския щам Streptomyces hygroscopicus 155 антибиотици върху морфологичната диференциация на неактивния вариант S. hygroscopicus 155-0 и ролята на калциевите йони в усилването на това тяхно действие. Направено е предположение за регулаторната функция на собствените антибиотици върху процесите на диференциация, която се експресира през Ca 2+ - сигнална система. (Публикация 36). - Разкрита е връзка между извънклетъчната протеолитична активност на стрептомицетите и тяхната диференциация (Публикация 36). Под мое научно ръководство в направлението Биология на актиномицетите са защитени 14 дипломни работи (8 след хабилитацията като доцент), разработена е еднa докторска дисертация, а докторантът е отчислен с право на защита. В момента има новозачислен редовен докторант по същото направление под мое ръководство (Вж. Списък на докторанти ). В това направление съм била ръководител на 3 научни проекта (два, от които след хабилитацията ми като доцент) и съм участвала в работния колектив на други 5 проекта (два от тях след хабилитацията като доцент). Статиите в това направление са цитирани 101 пъти, главно от чуждестранни автори. 2
2. Биология на млечнокисели бактерии В периода преди хабилтацията ми като доцент са провеждани изследвания върху млечнокиселите бактерии. Акцентирано е върху изолирането и идентифицирането на два щама на видовете Lactobacillus delbrueckii и Streptococcus thermophilus subsp. salivarius, съответно щам 1043 и щам 81. От двата щама са изолирани, пречистени и характеризирани два нови бактериоцина. (Публикация 33* и 34*). Статиите са цитирани 135 пъти от чуждестранни автори в публикации в списания с импакт фактор. Като продължение на започнатите изследвания върху млечнокиселите бактерии са следващите работи в това направление след хабилитацията ми като доцент: Изучено е разнообразието на млечнокиселата микрофлора на традиционни ферментирани български продукти с оглед на изолиране на потенциални стартерни култури с добри производствени характеристики. В резултат на изследванията е създадена богата колекция от млечнокисели бактерии, видово идентифицирани и скринирани по критериите за пробиотични щамове. Част от щамовете са намерили практическо приложние (Публикации 42, 43 и 44). При изследване на млечнокиселата микрофлора на различни видове кефир в търсенето на щамове с антибактериална и протеолитична активност са изолирани и идентифицирани щамове, принадлежащи към родовете Lactobacillus (Lactobacillus sp. Lactobacillus kefir DR22x) и Lactococcus (Публикация 35, 53 и 71), продуценти на антибактериални субстанции с бактериоцин-подобна структура и свързани с клетъчната стена екстрацелуларни протеолитични ензими с вероятна принадлежност към сериновите протеази. Изучено е влиянието на условията на провеждане на ферментационния процес върху антибактериалната активност на изследваните кефирни напитки. Под мое научно ръководство в това направление са защитени 7 дипломни работи (Всички след хабилитацията като доцент), а в момента има зачислен 1 редовен докторант (Вж. списък на докторанти). В това направление съм била ръководител на един международен проект и съм участвала в работния колектив на други 5 проекта, четири, от които след хабилитацията ми като 3
доцент (Вж. «Списък проекти»). Статиите от отва направление са цитирани общо 147 пъти. 3. Биоразнообразие на фитопатогенни бактерии Това е ново направление в моята научно-изследователската дейност, създадено и развито след хабилитацията ми като доцент, но намиращо се във връзка с направлението Биология на актиномицети-продуценти на антибиотици. През осемдесетте години, в рамките на научни проекти, в които съм участвала, колективът на тогавашната катедра по Обща и промишелна микробиология с вирусология работи съвместно с Института по защита на растенията по изпитването на актиномицети (основно стрептомицети) за активност срещу фитопатогенни бактерии и гъби (Проекти 15, 16 и 18, Вж. Приложение «Списък проекти»). В резултат на тези изследвания е създаден антибактериен препарат, наречен «Бактерицин», защитен с авторско свидетелство, в чийто авторски колектив участвам (Публикация 18). Изследванията в тази област, както бе посочено по-горе, продължиха и след хабилитацията ми като доцент, но се развиха и в посока на изучаване на биоразнообразието на фитопатогенните бактерии в България и търсенето на биологични средства за борба с тях. Това изисква точно познаване на видовата структура и разнообразието на популациите на различните видове фитопатогенни бактерии във всеки конкретен район, както и на техните основни характеристики и особености. Основните приноси от изследванията в това направление са свързани с изучаването на фитопатогенни представители на родовете Erwinia, Burkholderia, Pseudomonas, Xanthomonas и Curtobacterium и биха могли да се обобщят както следва: На базата на изолирането и идентифицирането с класически и молекулно-генетични методи на голям брой щамове с различен произход от България (гостоприемник, район, година) за първи път се прави изследване на вътревидовото разнообразие (фенотипно и генотипно) в популациите на Erwinia amylovora, един от най-опасните фитопатогени по представители на сем. Rosaceae. Данните за разнообразието, разкрито сред българската популация, допълват съществуващата информация в 4
научната литература за вътревидовото разнообразие на вида E. amylovora и имат освен фундаментално и практическо значение при неговото диагностициране. (Публикация 45, 49, 54, 56, 60 и 72). Изолирани и идентифицирани са щамове на вида E. amylovora от два гостоприемника ягода и арония, които се съобщават като такива за първи път за страната. Установеното има важно практическо значение във фитосанитарния контрол и при отглеждането на тези култури. (Публикация 49). Оптимизирана и приложена за идентификацията на E. amylovora e молекулната техника мултиплекс PCR, даваща възможност за провеждането на едностъпална PCR-амплификация, едновременно по два генетични локуса (специфичен регион от плазмида реа29 и amsрегиона в геномната ДНК). Чрез тази техика се спестява време, елиминират се неспецифичните реакции с близки видове и E. amylovora ясно се диференцира от близкия по генотипни характеристики вид Erwinia pyrifoliae. Този метод би могъл да се използва във фитосанитарния контрол за бърза диагностика на вида (Публикация 54). Установено е фенотипно разнообразие в българската популация на E. amylovora, изразяващо се в различие на метаболитните профили, определени със системите API и BIOLOG, като са докладвани нови, неизвестни до момента за вида API20Е профили, установени, съгласно възприетата система за тяхното кодиране. (Публикации 49 и 56). Приносът е с теоретична и практическа стойност за характеризирането на вида като цяло и неговото диагностициране. Разкрито е вътревидово генетично разнообразие в популациите на E. amylovora в България на базата на рестрикционен анализ на специфичен регион от съдържащия се в патогените плазмид реа29 (фактор на патогенността) с ензима HpaII. Установен е полиморфизъм сред щамовете в дължината на един от фрагментите (най-дългия), получени след рестрикция. Вариабилният фрагмент е секвениран при 5 от щамовете, а секвенциите са депозирани в GenBank (Accession numbers EU725787, EU725788, EU725789, EU725790 и EU725791). Този резултат 5
допълва съществуващата информация за вътревидовото генетично разнообразие на вида. (Публикация 60). Вътревидовото разнообразие в българската популация на E. amylovora е оценено чрез макрорестрикционен анализ на тотална ДНК с две рестриктази XbaI и SpeI с последващо разделяне на фрагментите чрез PAGE. На базата на формираните профили е установен доминиращият в популацията профил (т. нар. Pt2). Установени са три нови за България и два нови за вида рестрикционни профили, неописани до момента в научната литература. На базата на този анализ е постигнато диференциране на щамовете, изолирани от гостоприемници от подсем. Rosoidеae от тези, изолирани от подсем. Maloidеae на сем. Rosaceae, до момента постигнато само с техниката RAPD. Установеното от нас е принос към съществуващата информация за генетичното вътревидово разнообразие на вида. На базата на получените резултати е направен извод за хетерогенността в произхода на началния инокулум на патогена в България. (Публикация 72). Приносът има както фундаментално, така и практическо значение при проследяване на движението на патогена в различни райони на света. Създадена е колекция от български изолати на вида Erwinia amylovora, като част от нея (38 щама) е депозирана в Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМКК) с каталожни номера НБПМКК 8468-8477, НБПМКК 8509-8527 и от НБПМКК 8483-8492. По този начин изолираните български щамове са достъпни за всички изследователи на този вид за използването им като референтни в сравнителни анализи. За първи път видовете Pseudomonas marginalis и Pseudomonas fluorescens се съобщават като агенти, причиняващи меко гниене по луковиците на гладиола, хипеаструм, лук, чесън и див чесън. Приносът има важно практическо приложение (Публикация 47). На базата на съществуващата информация за бактериите от род Burkholderia е направен анализ и обобщение (Публикация No 55) на особеностите на този род, сред който се срещат както патогени по човека, така и фитопатогени. Обзорът послужи като база за последващи изследвания върху разпространението на тези патогени в България. 6
В резултат на изолиране, характеризиране и идентифициране на щамове е установено, че видовете Burkholderia gladioli pv. alliicola и Pantoea aglomerans предизвикват подобни симптоматични признаци, а глaдиолата се съобщава за първи път като гостоприемник на тези два патогена. Доказана е неприложимостта на метода на обгазяване на луковиците с метилбромид и въглероден диоксид за тяхното обеззаразяване от патогените. (Публикации 64, 65). Синдромът меко гниене по луковиците на лук при съхранение се причинява от видовете B. gladioli, Burkholderia cepacia, Burkholderia pyrrocinia и P. marginalis, които се установяват за първи път в България. Установено е, че клиничните изолати на B. cepacia притежават потенциал на фитопатогени (Публикации 63). Получените резултати са с парктическо значение, но биха имали и фундаментална стойност след продължаване на изследванията. За първи път у нас се изследва фенотипното вътревидово разнообразие в популациите на видовете B. gladioli и B. cepaciа, изолирани от лук и идентифицирани с фенотипни и генотипни методи. Със значителна хетерогенност по отношение на метаболитeн профил, изследван със системата BIOLOG, се характеризират популациите на вида B. gladioli Приносът има важно значение при диагностицирането на патогените и допълва информацията за тяхното вътревидово разнообразие (Публикация 64) Разработена е процедура, базираща се на техниката RAPD-PCR с използването на един вид праймер (CUGEA1), чрез която близките и неразличаващи се по фенотипни признаци два патовара на вида B. gladioli (alliicola и gladioli) се разграничават помежду си. (Публикация 66). Приносът има практическо значение при диагностицирането на патогените. Проследено е фенотипното разнообразие в популациите на причинителите на бактериоза по доматите и пипера от род Xanthomonas за периода 1985-2007 г, установен е патотипът и расовият състав. На базата на фенотипното характеризиране се установява, че поне три вида бактерии предизвикват болестта бактерийно напетняване по домати и пипер Xanthomonas vesicatoria/x. perforans, Xanthomonas euvesicatoria 7
и Xanthomonas gardneri. Видовете X. euvesicatoria, X. gаrdneri се съобщават за първи път за страната. Установеното доминиране на пиперено-доматения патотип е с важно значение, тъй като показва, че доматите могат да служат като източник на патогени, които да се разпространяват и по пипера. Установеното е с важно селскостопанско значение в отглеждането на двете кутури. (Публикация 67) Видовете Curtobacterium flaccumfaciens, Pseudomonas putida и Pseudomonas chlororaphis се съобщават за първи път в България като причинители на бактерийни болести, съответно по растенията коледна звезда, кала и лале. Съобщението е от практическо значение. (Публикация 68) Под мое научно ръководство в това направление за периода от 2000 г.(след хабилитацията ми като доцент) до момента са защитени 11 дипломни работи и 2 докторски дисертации. В момента в същото направление под мое ръководство са зачислени двама редовни докторанти (Вж. приложение «Списък докторанти»). По това направление съм ръководила 2 научни проекта и съм участвала в работния колектив на други два (Всички след хабилитацията ми като доцент). Статиите от това направление са цитирани общо 61 пъти. София, 20.04.2012 Подпис: (доц. д-р Пенка Мончева) 8