ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА ГОТОВА ЗА УПОТРЕБА СРЕДА В ЧАШКИ PA-254035.05 Рев.: Sep 2011 BD Mueller Hinton Chocolate Agar (BD Мюлер Хинтън шоколадов агар) ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ BD Mueller Hinton Chocolate Agar (Мюлер Хинтън шоколадов агар) се използва за изолиране и култивиране на чувствителни бактерии от клинични материали. Той може също да се използва за проверка на чувствителност на Neisseria gonorrhoeae. ПРИНЦИПИ И ОБЯСНЕНИЕ НА ПРОЦЕДУРАТА Микробиологичен метод. Поради факта, че в началото на 60-те г. клиничните микробиологични лаборатории използваха голямо разнообразие от процедури за определяне чувствителността на бактерии към антибиотични и хемотерапевтични агенти, Bauer, Kirby и др. разработиха стандартизирана процедура, в която за тестова среда бе избран Мюлер Хънтън агар - среда, първоначална разработена за изолиране на гонококи.. 1-4 Допълнително международно съвместно изследване потвърди оценката на Мюлер Хънтън агар за тази цел поради относително добрата репродуктивност на средата, простотата на неговата формула и изобилието от експериментални данни, акумулирани при използването на тази среда. 5 Според CLSI, препоръчваната среда за проверка на чувствителността с дискова дифузия на Streptococcus pneumoniae е Мюлер Хинтън агар с 5% овнешка кръв. Препоръчителната среда за Haemophilus influenzae е Хемофилус тестова среда (HTM) агар. Критерии за интерпретация са предоставени в документ M100 (M2) на CLSI, който е включен в документ М2 на CLSI Стандарти за функциониране при проверки на чувствителност с антимикробни дискове, 7-мо изд.; утвърден стандарт. 6 Препоръчителната среда за Neisseria gonorrhoeae е GC агар с определена растежна добавка. Според други данни, Мюлер Хинтън агар с хемин и Iso-VitaleX може да се използва за рутинна проверка на чувствителността на N. gonorrhoeae към пеницилин и спектиномицин. 7 Мюлер Хинтън агар с добавка на затоплена кръв или хемоглобин и растежни фактори (например BD IsoVitaleX) е препоръчван като неселективна среда за изолиране на Neisseria and Haemophilus. 8 В BD Мюлер Хинтън шоколадов агар екстрактът от говеждо месо и казеиновия пептон осигуряват хранителни вещества. Нишестето абсорбира токсичните съставки, като мастни киселини, образуващи се от памучни тампони. Хемоглобинът осигурява Х фактор. BD IsoVitaleX доставя витамини и растежни фактори, включително V фактор (=НАД), който е необходим за растежа на Haemophilus influenzae. РЕАГЕНТИ BD Мюлер Хинтън шоколадов агар Формула* на литър пречистена вода Екстракт от говеждо месо 2,0 g Киселинен хидролизат на казеин 17,5 Нишесте 1,5 Хемоглобин 10,0 IsoVitaleX 10,0 ml Агар 17,0 g ph 7,3 ± 0,2 *Пригоден и/или допълнен според изискванията за удовлетворяване на критериите за ефективно функциониране. PA-254035.05-1 -
Обогатяващата добавка BD IsoVitalex съдържа следните растежни фактори (формула* на литър пречистена вода): Витамин B12 0,01 g L-глутамин 10,0 Аденин 1,0 Гуанинов хидрохлорид 0,03 p-аминобензойна киселина 0,013 Никотинамид аденин динуклеотид (НАД) 0,25 Тиамин пирофосфат 0,1 Железен цитрат 0,02 Тиамин хидрохлорид 0,003 Цистеин хидрохлорид 25,9 L-цистин 1,1 Глюкоза 100,0 *Пригоден и/или допълнен според изискванията за удовлетворяване на критериите за ефективно функциониране. ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ. Само за професионална употреба. Не използвайте чашки, ако те съдържат признаци на микробно замърсяване, обезцветеност, изсушаване, пукнатини или други признаци на увреждане. Прекаленото сбръчкване на тази среда в резултат на изсушаване може да доведе до фалшиви резултати за чувствителността. За справка относно асептичните манипулационни процедури, биологичните опасности и изхвърлянето на използвания продукт вижте документа ОБЩИ ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА. СЪХРАНЕНИЕ И СРОК НА ГОДНОСТ След получаване съхранявайте чашките на тъмно, при температура от 2 до 8 С, в оригиналната им маншетна опаковка до момента на непосредствената им употреба. Не допускайте замразяване и прегряване. Чашките могат да бъдат инокулирани до изтичане на срока на годност (виж етикета на опаковката) и инкубирани според препоръчваните инкубационни периоди. Отворените комплекти от 10 чашки могат да се използват в продължение на една седмица при съхранение на чисто място при температура от 2 до 8 С. ПОТРЕБИТЕЛСКИ КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ Инокулирайте представителните образци със следните щамове (за подробности вижте документа ОБЩИ ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА). Инкубирайте чашките при температура 35 ± 2 C в аеробна атмосфера, допълнена с въглероден двуокис. Прочетете чашките след 18 до 24 и след 42 до 48 часа инкубация. Щамове Темпове на растеж Haemophilus influenzae ATCC 10211 От добър до отличен растеж Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 Значителен до отличен растеж Neisseria meningitidis ATCC 13090 От добър до отличен растеж Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Неинжектирани От добър до отличен растеж Шоколадово кафяви, непрозрачни, може да бъдат леко нехомогенизирани За инокулация и инкубация на тестове за чувствителност, вижте Методика на тестуване. Тестов щам Диск за тестуване на чувствителност Размер на зона* (mm) Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Пеницилин Р-10 33-40 Спектиномицин SPT-100 25-31 * Размери на зоните въз основа на резултати от поне 3 различни партиди на BD Мюлер Хинтън шоколадов агар PA-254035.05-2 -
ПРОЦЕДУРА Предоставяни материали BD Mueller Hinton Chocolate Agar (Мюлер Хинтън шоколадов агар) (90 mm Stacker чашки). Микробиологично проверени. Непредоставяни материали Допълнителна културална среда, реагенти и лабораторно оборудване според нуждите. Видове материали BD Мюлер Хинтън шоколадов агар принципно може да се използва за всички видове проби от инфекции, за които се подозира, че съдържат чувствителни организми, особено, но не само, проби от първично стерилни локализирани участъци от тялото (например, мозъчногръбначна течност, абсцеси) и като субкултурна среда за кръвни култури. Основната и употреба е за селективно изолиране на Neisseria, Haemophilus и други бактерии, които могат да не растат върху рутинно използвани среди с кръвен агар, като Колумбия агар с 5% овнешка кръв. (вижте също РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ОГРАНИЧЕНИЯ НА ПРОЦЕДУРАТА). Използването на тази среда за рутинна проверка на чувствителността на Neissseria gonorrhoeae с пеницилин G и спектиномицин изисква използване на чисти култури. Не инокулирайте с материал за непосредствена проверка на чувствителност! Събиране и транспортиране на образци Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Haemophilus и други чувствителни организми са възприемчиви към неблагоприятни външни условия. Следователно, за всички материали трябва да се използва подходящ вид транспорт. Материалите трябва да бъдат изпратени в лабораторията възможно най-бързо и да не са по-стари от 24 часа, даже ако се използва транспорт. Оптималната температура за транспортиране е 20 до 25 C. Не охлаждайте. 9,10 Методика на тестуване За изолиране на чувствителни организми направете посявка на материала възможно найбързо след получаването му в лабораторията. Чашката с посявка се използва главно за изолиране на чисти култури от материали, съдържащи смесена флора. Като алтернатива, ако материалът е култивиран непосредствено от намазка, потрийте намазката върху неголям участък в края; след това направете посявка от тази повърхност. Ако материалът е взет от участък от тялото, съдържащ нормална флора, той също трябва да бъде инокулиран върху подходяща селективна среда, в зависимост от патогенния агент, който трябва да се изолира. За Neisseria gonorrhoeae трябва да бъде включена чашка BD Мартин-Луис агар, модифициран или BD GC-Lect агар, а за Haemophilus чашка BD шоколадов агар с IsoVitaleX и бацитрацин. Инкубирайте чашките при температура 35 ± 2 C в аеробна атмосфера, допълнена с въглероден двуокис. Прочетете данните след 18 до 24 и след 42 до 48 часа инкубация. За рутинна проверка на чувствителността на N. gonorrhoeae изолата, който трябва да е чиста култура, се суспендира в BD Trypticase соев бульон за съвпадане с мътността на стандарта McFarland 0.5. В рамките на 15 мин след регулиране на мътността на инокулата, потопете стерилен тампон в правилно разреден инокулат и го завъртете няколко пъти в посока срещу горната вътрешна стена на пробирката, за да изтискате излишната течност. Инокулирайте трикратно цялата повърхност на агара в чашката, завъртайки чашката на 60º между посевките за постигане на равна инокулация. Поставете дисковете с помощта на диспенсера за антимикробни дискове, спазвайки асептичните предпазни мерки. Разположете дисковете така, че центровете им да са на разстояние поне 24 мм един от друг. Препоръчва се да поставите пеницилиновите дискове така, че да са на разстояние не по-малко от 10 mm от края на Петри чашката. След поставянето на дисковете върху агара ги притиснете със стерилна игла или пинсета за да постигнете пълен контакт с повърхността на средата. Тази стъпка не е необходима, PA-254035.05-3 -
ако дисковете се поставят с помощта на самонагласящи диспенсери BD Sensi-Disc 6- или 8-места. 15 минути след поставяне на дисковете обърнете чашките и ги инкубирайте в аеробна атмосфера, обогатена с 5% въглероден двуокис при температура 35 до 37 C за 20 до 24 часа. Резултати Типичната колониална морфология на BD Мюлер Хинтън шоколадов агар е следната: Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Малки, влажни, перлени, с характерен миши мирис Малки, сивкаво бели до безцветни, мукоидни Средни до големи, синьо сиви, мукоидни Малки, плоски или по-големи мукоидни зеленикави колонии, средните обкръжаващи колонии могат да са сивкави Тестове за чувствителност: Зоните трябва да се отчетат от горната част на чашката. Чувствителността към пеницилин трябва да бъде потвърдена с бета-лактамаза тест, например BD Cefinase тест. РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ОГРАНИЧЕНИЯ НА ПРОЦЕДУРАТА BD Мюлер Хинтън шоколадов агар е обогатена неселективна среда, в която растат чувствителни и нечувствителни бактерии, включително нормална флора. Следователно, препоръчва се инокулиране на материалите и в подходяща селективна среда. Терминът чувствителни бактерии се отнася за бактерии, които не растат или не растат добре върху обикновено използвана основна изолираща среда, съдържаща овнешка кръв, например Haemophilus, патогенна Neisseria и някои други организми. За подробно описание на типовете материали, които трябва да бъдат инокулирани в тази среда, и тези, при които тази среда се използва за изолация, вижте отпратките. 10,11 Тази среда не е тестувана за поддържане на растеж на хранително вариантни стрептококи. Броят и типовете бактериални видове, появяващи се като инфекциозни агенти, е много голям. Поради това, преди използване на средата за рядко изолирани или новоописани микроорганизми е необходимо потребителят първо да провери нейната пригодност чрез култивиране на чисти култури от разглеждания организъм. Откриваните в тази среда размери на зони на чувствителност не са в пълно съответствие с тези, посочени в стандарта М2 6 на CLSI, който е написан въз основа на GC шоколадов агар с определена растежна добавка. СПРАВОЧНА ЛИТЕРАТУРА 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493-496. 2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5:91-100. 3. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: 330-333. 4. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: 149-158. 5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Berger, U. 1992. Neisseriaceae. In: Mikrobiologische Diagnostik (F. Burkhardt, ed.). Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 8. Nash, P., and M.M. Krenz. Culture media. In: Manual of clinical microbiology, (Balows, A., et al., eds.). 5 th edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA. PA-254035.05-4 -
9. Miller, J.M., and H.T. Holmes. 1995. Specimen collection, transport, and storage. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 10. Forbes, B.A., and P.A. Granato. 1995. Processing specimens for bacteria. In: P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 11. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.). 1995. Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. ОПАКОВКА/СЪДЪРЖАНИЕ BD Mueller Hinton Chocolate Agar Кат. 254035 Готова за употреба среда в чашка, пакет от 20 Кат. 254082 Готова за употреба среда в чашка, пакет от 120 ДОПЪЛНИТЕЛНА ИНФОРМАЦИЯ За допълнителна информация моля свържете се с местния представител на BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2011 BD PA-254035.05-5 -