РЕЦЕНЗИЯ на дисертация на тема: Синтез на флуоресцентни кумаринови производни за ензимни субстрати на Теодора Цветанова Цветкова, редовен докторант в Катедра Приложна органична химия във ФХФ на СУ Св. Климент Охридски за получаване на образователната и научна степен доктор по научно направление 4.2. Химически науки, специалност Технология на финия органичен и биохимичен синтез от проф. дхн Валерий Христов Христов, ШУ Епископ Константин Преславски Представеният за защита дисертационен труд е изработен от Теодора Цветанова Цветкова, редовен докторант в Катедра Приложна органична химия на ХФ на СУ Св. Кл. Охридски. Теодора Цветкова е завършила с много добър успех ОКС Бакалавър по химия в ХФ на СУ Св. Кл. Охридски през 2002 год. През 2004 год., пак там, се дипломира завършвайки магистърската програма Органични материали във висшите технологии с отличен успех. От 2004 до 2008 год. е редовен докторант в Катедра Приложна органична химия с научен ръководител проф. дхн Тодор Делигеоргиев с прекъсване от 23 месеца, през което време с Marie Curie Fellowship е в Южен Датски Университет в Одензе, Дания. От 2004 год. е назначена като химик в същата катедра на същия факултет, където работи и в момента. Дисертационният труд е структуриран в съответствие с утвърдените изисквания и е написан на 126 стр. като включва 36 схеми, 6 таблици и 41 фигури. Структуриран е в следните раздели: Увод 1 стр.; Литературен обзор 34 стр.; Резултати и обсъждания 35 стр.; Експериментална част 39 стр.; Изводи 2 стр.; Цитирана литература 161 източници, като 48 от тях (30 %) са публикувани след 2000 год. Представеният за рецензия дисертационен труд включва изследователски материал на актуална тема в областта на синтетичната органична химия. Обект на дисертацията е синтезът на кумаринови производни като иминокумарини, хидроксикумарини, хидроксибензо[f]кумарини, водоразтворими сулфокумаринови аналози и естери на кумарините и тяхното приложение като флуоресцентни ензимни субстрати. Интересът на изследователите към тях е обусловен преди всичко от факта, че поради естествената си флуоресценция кумариновите производни се използват широко като индикатори за различни йони, за маркиране на протеини, антитела и други биомолекули, като флуорофори за ензимни субстрати при установяване на ензимна активност и изследване на конформационните промени в активните центрове. 1
Поради интердисциплинарния характер на работата на Т. Цветкова и в съответствие с тематиката на дисертационния труд в литературния обзор доста обширно, но същевременно компетентно, са описани различни области като характеристики на кумариновите багрила и известни в литературата общи методи за техния синтез, както и областите на приложение поради тяхната естествена флуоресценция и фотостабилност. Разгледани подробно са разпространението и класификацията на природните кумарини, основни фотофизични характеристики и приложението на кумариновите хетероциклени системи, кумариновите багрила като субстрати за основните групи ензими, някои методи за синтез на пореакционноспособните и по-лесно окисляваните иминокумаринови производни. Направен е литературен преглед на основните методи за образуване на кумаринов хетеропръстен като акцентът е поставен върху реакцията на Perkin, кондензацията по Knoevenagel и реакцията на Pechmann. В отделни подраздели на обзора са представени накратко основните методи за синтез, свойствата и направленията, свързани с приложенията на някои производни на кумарините като водоразтворимите сулфопроизводни и ацетилните производни на кумарините, получавани съответно чрез реакциите на ароматно сулфониране и на ацетилиране на хидрокси-група. Добре би било, в края на прегледа на литературата да има обобщение, което би могло да очертае идеите на дисертационния труд и съвсем естествено да се мотивира и изведена целта на настоящата дисертация, за постигането на която ясно и конкретно са формулирани основните задачи по синтеза на флуоресцентни кумаринови производни за ензимни субстрати. От споменатото по-горе става ясно, че целта и задачите на дисертацията са безпорно в една съвременна, актуална и бързо развиваща се през последните години област на финия органичен синтез, а именно разработване на общи и препаративно достъпни методи за синтез на флуоресцентни цветни съединения с възможности за приложение в биологията, медицината и във висшите технологии. Изследванията в тази област са започнати във Факултета по химия и фармация от научния ръководител на докторанта проф. дхн Т. Делигеоргиев и настоящата дисертация е естествено продължение на тази интересна проблематика. Литературният обзор оставя добро впечатление със стегнатото и компетентно изложение на цитираните трудове и характеризира дисертанта като оформен специалист в областта и способен да намира, систематизира и анализира критично литературните данни. Прави впечатление умелото цитиране не само на оригинални статии, но когато е основателно и на вторични източници справочници и монографии. Цитираните множество патенти показват значението на избраната тема и конкретни обекти за практиката. В раздела Резултати и обсъждане са описани синтетичните и фотохимични 2
изследвания на кумаринови производни и тяхното приложение като флуоресцентни ензимни субстрати. Постигнатите от Теодора Цветкова резултати могат да се резюмират както следва: А. Синтез на полупродукти. В този раздел е описано получаването на три типа полупродукти: 1) По описани в литературата процедури са синтезирани 1-метилбензимидазол-2-ил-, бензотиазол-2-ил- и 4-фенилтиазол-2-ил-ацетонитрили като изходни съединения в кондензацията на Knoevenagel за синтез на 3-хетарилиминокумаринови производни; 2) Чрез формилиране по Vilsmeier-Haack-Arnold на дихидроксилни производни са синтезирани вторите изходни съединения в кондензацията на Knoevenagel; и 3) чрез реакция на сулфониране на съответните дихидробенз(нафт)алдехиди са получени 5-формилдихидробензен(нафтален)-2-сулфоновите киселини, необходими полупродукти за синтеза на водоразтворимите сулфопроизводни на 3-хетарилкумарини. Въпреки че описаните синтези на полупродукти не представляват централната част от дисертацията на Т. Цветкова, считам за уместно да подчертая, че обикновено подготвителната работа преди възловите етапи в синтеза отнема значително време и усилия. Като органик-синтетик високо оценявам трудностите, усилията и упоритостта, вложени за изолиране на десетките изходни съединения с привидно елементарни структури. Б. Синтез и фотофизични свойства на 3-хетарилиминокумаринови производни. Разработен е нов вариант на кондензацията по Knoevenagel за синтез на иминокумаринови производни като традиционния базичен катализатор е заменен със силната CF 3 COOH. Чрез тази модификация е постигната отлична повтаряемост на резултатите, високи добиви и чистота на целевите иминокумарини, както и лесното им изолиране и пречистване. В. Получаване и фотохимични свойства на 3-хетарилкумаринови производни. Чрез киселинна хидролиза с 10% воден разтвор на HCl на иминокумариновите производни са синтезирани, изолирани и доказани с елементен анализ за С и Н, 1 Н ЯМР, ИЧ и масспектри серии от четири 3-хетарилзаместени кумарини и дванадесет 3-хетарилбензо[f]кумарини. Изследвани са абсорбционните (UV-Vis) и флуоресцентните характеристики на синтезираните 3-хетарилкумаринови производни при различно ph и полярност на разтворите. Г. Получаване и фотохимични свойства на сулфопроизводни на 3-хетарилкумарини. При взаимодействие на хетероциклени ацетонитрили и 5-формил-дихидро-бензен(нафтален)- 2-сулфонови киселини в метанол и присъствие на катализатор CF 3 COOH са получени и е доказана структурата на серии от водоразтворими четири сулфопроизводни на 3- хетарилкумарините и дванадесет сулфопроизводни на 3-хетарилбензо[f]кумарините. При проследяване на абсорбционните и флуоресцентни свойства на синтезираните сулфонови киселини се наблюдава незначително влияние на сулфогрупата върху спектралните 3
отнасяния на получените продукти. Постигането на водоразтворимост, без да се променят флуоресцентните качества, е едно от основните постижения на дисертационния труд, тъй като така се изпълнява едно от основните изисквания за флуоресцентни ензимни субстрати те да са водоразтворими. Д. Синтез и спектрални свойства на ацетилни производни на 3-хетарилкумарини. Ацетилирането на получените в предишните раздели хидроксикумаринови производни с 15- кратен моларен излишък от оцетен анхидрид води до получаване на серии от ацетилни естери на 3-хетарилкумарините и на 3-хетарилбензо[f]кумарините. При сравняване на абсорбционните и флуоресцентните характеристики на ацетилирани и неацетилирани производни на 3-хетарилкумариновите производни се забелязва рязко намаляване на флуоресцентните добиви при ацетилните аналози. Голямата разлика във фотофизичните свойства на субстрата и флуоресцентния продукт от реакцията с ензима, т. е. добро съотношение сигнал-шум, прави ацетилните производни на 3-хетарилкумарините подходящи за изследване на ензимната активност като ензимни субстрати за различни лиази и ацетилази. Е. Получаване и спектрални свойства на флуорогенен субстрат на липази. Чрез въвеждане в системата ензим-субстрат на допълнителен псевдосубстрат - конкурентен инхибитор, съдържащ флуорогенен фрагмент в структурата си, се определя промяната в ензимната активност. За тази цел като ензимен инхибитор е получен и доказан с 1 Н- и 31 Р- ЯМР спектри етил хептанфосфонов естер на 3-бензотиазол-2-ил-2H-кумарин чрез триетапен синтез, включващ получаване на диетил хептанфосфонат по реакцията на Арбузов между триетилфосфит и 1-бромохептан, следваща обработка с PCl 5 до съответния естер-хлорид и реакцията на последния с 3-бензотиазол-2-ил-2Н-кумарин в DMF и в присъствие на DIPEA. За провеждане на първоначални качествени анализи на активността на панкреатичната липаза Candida rugosa е синтезиран хромогенен и флуорогенен субстрат - олеинов естер на 3-бензотиазол-2-ил-2H-кумарин, получен при реакция между олеиноил хлорид и 3- бензтиазол-2-ил-2н-кумарин в DMF и DIPEA. За олеиновия субстрат са проведени предварителни качествени анализи с липазата Candida rugosa и са показани неговите обнадеждаващи свойства като хромогенен и флуорогенен ензимен субстрат. Експерименталната част, изложена върху 39 стр., е написана прецизно и обемът й съответства на големия обем синтетична работа, извършен от докторанта. Структурите на междинните и крайни продукти са убедително доказани с ИЧ, 1 H ЯМР, елементен анализ, а за някои съединения и с 13 C и 31 Р ЯМР и мас-спектрометрия. Дисертацията съдържа оригинални приносни научни изследвания и резултати, доказани чрез използване на подходящи синтетични и съвременни аналитични и спектрални 4
методи. Това се вижда от експерименталните синтетични и аналитични данни описани в раздела Експерименталната част. Много добро е впечатлението от прецизно проведения експеримент, от коректно описаните процедури за синтез и от подробното спектрално охарактеризиране на съединенията. Вижда се, че Теодора Цветкова е усвоила и успешно прилага в работата си съвременни методи за синтез и изследване на органични съединения, т. е. изпълнени са и образователните задачи на докторантурата. Проведените изследвания имат научни и научно-приложни приноси с обогатяване на съществуващите познания в областта на финия органичен синтез в направлението синтез на флуоресцентни цветни съединения с възможности за приложение в биологията, медицината и във висшите технологии. Изводите отразяват и обобщават точно получените резултати. Авторефератът е структуриран по модела на дисертацията и отразява точно информацията включена в дисертационния труд. Научните резултати са публикувани в три статии, отпечатани в международно списание с импакт-фактор (за последните пет години) 0.992 Coloration Technology, което несъмнено говори за високото качество на научните изследвания и за международното признание на това качество. И в трите статии докторантът е втори автор след научния си ръководител. Нямам никакво съмнение в съществения принос на дисертанта в изпълнението на поставените цели и задачи. Намерен е един цитат на една от статиите. Изненадващо е, че липсва списък от научни форуми, в които са докладвани резултатите от дисертационната работа. Едва ли това означава, че резултатите не са докладвани на никакъв научен форум. Нямам съществени критики по дисертацията, но могат да се направят някои забележки, най-вече по отношение на химическия език и стил на доста места в дисертационния труд не е достатъчно ясен и точен. Забелязани са някои химически неточности и грешки в текста: например, 1) радикал вместо правилните заместител или група (стр. 16, 19, 26, 37); 2) карбоксилно-киселинни естери (стр. 22); 3) (R-O-P(O)=(OH) 2 ) (стр. 22); 4) карбонамиди и карбопиперидин (стр. 37); 5) р-толуолсулфонова киселина (стр. 48); 6) толуол (стр. 117); 7) варира заместителите при хидроксилната група. (стр. 51); 8) олеонил хлорид вместо олеиноил хлорид (стр. 117); 9) Би могло да бъде и по-добро оформянето на някои химични схеми чрез по-компетентно използване на химически софтуер (Схема 1 стр. 29, Схема 2 стр. 29, Схема 6 стр. 31, Схема 13 стр. 34 и др.). На много места се забелязват пунктуални и граматически грешки, свързани предимно с употребата на пълен и кратък член. Оставам с впечатлението, че за докторанта използването на пълен или кратък член е напълно хаотично. При съвсем непрецизно преглеждане на дисертационния труд, следейки за правилното членуване, са забелязани 35 (тридесет и пет) изречения, в които неправилно е употребен пълен или кратък член. Биха могли да се 5
направят още някои общи забележки при изразяването, които имат редакционен характер и не променят общото много добро впечатление от работата. Към дисертанта имам следните въпроси: 1) Добивите на синтезираните съединения 9a-d до 24a-d са дадени в точност до втория знак след запетайката. Каква е повторяемостта на експериментите, т. е. след колко опита за всеки продукт са получени тези стойности на добивите? 2) На стр. 72, в Схема 34 над стрелката е записан като разтворител CCl 4 (формула). Веднага под схемата в текста е пояснено, че за разтворител се използва сух хлороформ. На стр. 135 в Експерименталната част в методика 5.VIII.2. също е записан като разтворител сух хлороформ. В крайна сметка, какъв е разтворителят при тази реакция за синтез на фосфоновия естер-хлорид 26? 3) Навсякъде в дисертацията се използва термина иминокумаринови производни, но от друга страна, сулфопроизводни на кумарините и ацетилни производни на кумарините. Не би ли могло да се използват термините иминокумаринови, сулфокумаринови и ацетилкумаринови производни или иминопроизводни, сулфопроизводни и ацетилни производни на кумарините? Кой от двата варианти е правилен и по-точен? Не познавам лично Теодора Цветкова и нямам лични впечатления от нейните делови качества, но съдейки по дисертационния труд, без съмнение тя има много добра теоретична и експериментална подготовка, въз основа на които мога да констатирам, че те са били продуктивни при реализацията на изследователската й работа, осъществена под ръководството на проф. дхн Тодор Делигеоргиев. Заключение Дисертацията на Теодора Цветкова представлява задълбочено и системно изследване в актуална област на синтетичната органична химия и съдържа оригинални научни проучвания върху синтеза и приложението на флуоресцентни кумаринови производни за ензимни субстрати. В хода на работата дисертантът е усвоил широк кръг от синтетични и съвременни спектрални методи за изследване. Изключително добро впечатление прави щателното изследване на реакционните смеси при всеки отделен експеримент и особено използването на съвременни спектрални методи и техники за определяне на изолираните продукти. Оценявам високо изследванията на докторант Теодора Цветкова, включени в дисертационния труд. В хода на проведените изследвания докторант Цветкова се е изградила като утвърден специалист в областта на синтетичната органична химия, който ще бъде полезен във ФХФ към СУ Св. Кл. Охридски. Въз основа на гореизложеното считам, че представеният дисертационен труд на Теодора Цветкова отговаря напълно на изискванията на ЗРАС в РБ, на Правилника на СУ 6
Св. Кл. Охридски за прилагането му и на Препоръчителните изисквания на ФХФ на СУ за придобиване на научната и образователна степен доктор. Основните достойнства на дисертацията са: 1) Създадени са нови или са подобрени известни методи за синтез на флуоресцентни кумаринови производни, повечето от които са със значителни и целесъобразни предимства; 2) Целенасочено са синтезирани голям брой (79) съединения - полупродукти и багрила, от които 63 нови, неописани до сега в литературата, всичките надеждно охарактеризирани и идентифицирани; 3) Работата има особени достойнства с това, че не се ограничава само със синтеза на определените структури, а продължава с изследвания на техните свойства, за да се демонстрират качествата им и евентуалното им приложение. Тези изследвания несъмнено потвърждават правилността на целенасочения синтез и възможностите за прилагане на багрилата като флуоресцентни ензимни субстрати. Ще гласувам с ДА за присъждането на образователната и научна степен доктор по научно направление 4.2. Химически науки, специалност Технология на финия органичен и биохимичен синтез на Теодора Цветанова Цветкова. Убедено препоръчвам на уважаемите членове на Научното жури да гласуват по същия начин. 07. 02. 2013 г. Рецензент: гр. София (проф. дхн Валерий Христов Христов) 7