Folie 1

Препис

1 ТРОМБОЦИТИ ФИЗИОЛОГИЯ И ФУНКЦИЯ ТЕСТОВЕ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА ТРОМБОЦИТНАТА ФУНКЦИЯ Добринка Динева Симпозиум МЛАД ХЕМАТОЛОГ ноември 2018 Варна

2 ИСТОРИЯ Описани от Osler през 1873 година като дисковидни, самостоятелно циркулиращи в кръвта телца, формиращи агрегати веднага след излизането им от кръвната циркулация. Седем години по-късно Bizzozero описва анатомично тромбоцитите и подчертава тяхната роля в хемостазата и тромбозата.

3 ТЕРМИНОЛОГИЯ Формени елементи, произлизащи от цитоплазмата на мегакариоцитите единствените полиплоидни хематопоетични клетки. Характерни само за бозайниците platelets. При всички останали животински видове тези клетки са ядроносни - thrombocytes Незрели и зрели тромбоцити при птици, Lucas and Jamroz, The evolution of mamalian platelets, 2008

4 РЕГУЛАЦИЯ НА ТРОМБОПОЕЗАТА Основен регулатор тромбопоетин (TPO) IL-3 - стимулира ранните етапи на съзряване IL-6, IL-11 и SCF регулират тромбопоезата, но само в присъствието на TPO или IL-3 Мегакариоцити и образуване на тромбоцити, J.E.Italiano, H. Hartwig, Megakariocyte development and platelet formation, 2008

5 ОБРАЗУВАНЕ При разпадането на един мегакариоцит се образуват около 2000 тромбоцита. 3 механизма на тромбоцитно формиране: - цитоплазматична фрагментация на демаркационната мембранна система (DMS) - пъпкуване на мегакариоцитната повърхност - образуване на протромбоцити Място на формиране - костен мозък - кръвообръщение - бели дробове Механизми на тромбоцитообразуване, J.E.Italiano, H. Hartwig, Megakariocyte development and platelet formation

6 ЦИТОПЛАЗМА ПЕРИФЕРНА ЗОНА - кръгова микротубулна система от туболин и тромбоцитен актомиозин, изгражда опорната структура на тромбоцитите, - отворена каналикуларна система - многобройни инвагинации на повърхността на тромбоцитите от по-тесни канали - плътна тубуларна система - основното място за съхранение на Ca2 +. Микрофиламентите във взаимодействие с тубулната система обуславят промените в тяхната форма

7 ЦИТОПЛАЗМА ЦЕНТРАЛНА ЗОНА Включва различни органели: a-гранули най-многобройни (40-80)- тромбоглобулин, тромбоспондин, фибронектин, тромбоцитен растежен фактор, Р- селектин, ф.4, F V, F VIII:vWF, фибриноген d плътни гранули адреналин, серотонин, епинефрин, Са++, ADP, ATP Енергетични гранули гликоген Лизозоми Митохондрии осигуряват енергийния метаболизъм лизозоми a-гранули гликоген митохондрии d гранули

8 ТРОМБОЦИТНА МЕМБРАНА Трипластов строеж - два белтъчни слоя и един липиден фосфолипидите изходен материал за синтез на ф3 тъканен тромбопластин, необходим за активиране на вътрешната система на кръвосъсирване и ТхА2, активиращ тромбоцитната агрегация Гликопротеини функциониращи като рецептори.... активиране

9 ТРОМБОЦИТНИ РЕЦЕПТОРИ CD41 (GPIIb/IIIa) фибриноген, фибронектин. Централна роля в тромбоцитната агрегация CD42 (GPIb) мембранен рецептор за фактора на фон Вилебранд, участващ в адхезията на тромбоцитите към субендотела. При нормална циркулация фактора на Вилебранд не се свързва с тромбоцитния рецептор. In vitro e необходим антибиотика ристоцетин, за да настъпи свързване на F VIII:vWF към рецептора. CD51 (GP IIIa) витронектин CD49b/CD29 (GP Iа/IIa) колаген CD 49e/CD29 (GP Ic/IIa) - фибронектин CD 36 (GP IV) тромбоспондин GP V - тромбин Тромбоцитни рецептори ==============. Thrombin ADP Epinephrine Collagen Тромбоцит PAR-4 P2Y 1 TBX A 2 TBXA 2 -R Serotonin P2Y 12 EPI-R PAR-1 5HT 2 A GP VI GP Ia Fibrinogen GP IIb/IIIa Anionic phospholipid surfaces GP IIb/IIIa Тромбоцит Peyvandi F, et al. Semin Thromb Hemost, 2009;35:

10 ПУРИНЕРГИЧНИ РЕЦЕПТОРИ Активират се от аденинови нуклеотиди - активиране на фосфолипаза С и до регулация на активността на аденилат-циклазата. P2Y1 рецепторът медиира бързата обратима агрегация от ADP, промяната на формата на тромбоцита и транзиторното увеличение на вътреклетъчния калций чрез активиране на фосфолипаза С. Този рецептор играе важна роля във формирането на тромба. P2Y12 играе основна роля в стабилизацията на тромбоцитните агрегати, индуцирани от тромбин и тромбоксан А2. Lawrence F. Brass and Timoty J. Stalker, Mechanisms of platelets activation, Platelet Immunology 2008, Cambridge University Press

11 ОСНОВНИ ФУНКЦИИ - УЧАСТИЕ В ХЕМОСТАЗАТА С четири основни физиологични отговора при активирането им (от колаген, тромбин, ADP, имунни комплекси) : 1. Адхезия 2. Контрахиране и промяна във формата 3. Реакция на освобождаване 4. Агрегация Christopher M. Platelet function testing, ISTH 2017

12 УЧАСТИЕ В КОАГУЛАЦИЯТА - адсорбираща повърхност за факторите на кръвосъсирване, - доставяне на вазоактивни амини - ф5, епинефрин; доставяне на протеини, необходими за кръвосъсирването ф3, ф4, ф V, фибриноген - стабилизиране на тромбоцитния тромб и ретракция на съсирека (тромбастенин) E.E.Gardnier, R.K.Andrews, Coagulation and Platelet function, Advances in Experimental Medicine and Biology 2014

13 НАРУШЕНИЯ В ТРОМБОЦИТНАТА ФУНКЦИЯ Нарушената тромбоцитна функция може да се изяви като заболяване, свързано с кървене или заболяване, свързано с тромбоза. Кървенето е свързано с нефункциониращи тромбоцити или с наличие на тромбоцитни инхибитори. Нарушенията могат да бъдат вродени или придобити, срещат се по-рядко и се проявяват с minor bleeding, често се съчетават с тромбоцитопения. Тромбоцитната активация обаче е честа и съпътства разпространени сърдечно-съдови заболявания с ендотелна увреда като МИ, нестабилна ангина, ИМИ.

14 ТРОМБОЦИТНИТЕ ФУНКЦИОНАЛНИ ТЕСТОВЕ ПРИЛОЖЕНИЕ I. Доказване на вродени заболявания на функцията на тромбоцитите. II. Доказване на придобити нарушения на тромбоцитната функция. III. Контрол на адекватен отговор на лечението с антиагреганти откриване на оптимална доза или недостатъчен отговор / лекарствена резистентност или увеличен отговор при пациенти след перкутанна коронарна ангиопластика /ПКА/. Контрол на къмплайънса или последваща оценка на неуспешна терапия. IV. Потвърждаване на адекватна хемостаза след спиране на лечението. Предотвратяване на риск от периоперативно кървене при хирургични интервенции и оценка на нуждата от заместителна трансфузия с тромбоцити.

15 I. ВРОДЕНИ ДЕФЕКТИ В ТРОМБОЦИТНАТА ФУНКЦИЯ АДХЕЗИЯ GPIb-vWF Болест на von Villebrand Синдром на Bernard-Soulier АГРЕГАЦИЯ GPIIb-IIIa Тромбастения на Glanzmann АКТИВАЦИЯ ЕКЗОЦИТОЗА НА ГРАНУЛИТЕ ЦИТОСКЕЛЕТА Циклооксигеназни дефекти (ASA) Дефекти в P2Y12 рецепторите Дефекти в съхранението (SPD) Дефекти в освобождаването Wiskott - Aldrich ЛИПИДНАТА СТРУКТУРА НА МЕМБРАНАТА Scott syndrome

16 II. ПРИДОБИТИ НАРУШЕНИЯ В ТРОМБОЦИТНАТА ФУНКЦИЯ Системни заболявания Хематологични заболявания Сърдечни оперативни интервенции Придобити нарушения в съхранението Антитромбоцитни медикаменти Уремия Автоимунни - антитромбоцитни антитела Чернодробни заболявания Миелопролиферативни заболявания Миелодисплазия, левкози Диспротиенемия Придобит von Willebrand Екстракорпорално кръвообръщение Трансфузия нa тромбоцити Аспирин, Тиенопиридини, GPIIb/IIIa инхибитори

17 ВЕЩЕСТВА, ПОВЛИЯВАЩИ ТРОМБОЦИТНАТА ФУНКЦИЯ COX-1 инхибитори - аспирин COX-1 и COX-2 инхибитори (нестероидни противовъзпалителни) COX-2 инхибитори - Celecoxib Инхибитори на тромб. рецептори тиенопиридини, IIbIIIa инхибитори Фосфодиестеразни инхибитори дипиридамол, силостазол Директни тромбинови инхибитори (лепирудин, аргатробан, бивалирудин) Антикоагуланти хепарин, варфарин Сърдечно-съдови медикаменти бетаблокери, вазодилататори, диуретици, калциеви антагонисти Антимикробни средства В-лактами - пенецилин, цефалоспорин Антималарийни препарати Химиотерапевтици Психитропни Трициклични антидепресанти Фенотиазини Локални и общи анестетици Рентгенови контрастни материи Други - клофибрат, декстран, експекторанти Храни чесън, лук, джинджифил, кофеин, алкохол Рибено масло, ленено семе, витамин С и Е Arch Pathol Lab Med. 2002;126:

18 III. КОНТРОЛ НА ДААТ ПКА - основен метод за лечение и превенция на острия коронарен синдром. Подтискането на тромбоцитната функция е ключов фармакологичен механизъм в профилактиката на артериалната тромбоза - двойна антиагрегантна терапия с аспирин и клопидогрел. Стентиране Ендотелна травма Експозиция на компонентите от интимата на съдовата стена Активиране на тромбоцитите Артериална тромбоза Въпреки това от 4 до 30 % от пациентите остават с висока остатъчна тромбоцитна реактивност на фона на терапия (HPR) свързана с исхемични усложнения

19 IV. ХИРУРГИЧНИ ИНТЕРВЕНЦИИ ПРЕПОРЪКИ ПРИ СПЕШНА ОПЕРАТИВНА ИНТЕРВЕНЦИЯ 2012 Society of Thoracic Surgeons Guideline Клас IIa: При пациентите на ДААТ е разумно да се отложи провеждането на оперативната интервенция в зависимост от резултатите от тестовете за тромбоцитно инхибиране, а не прилагането на специфичния период на изчакване Мониториране на тромбоцитната функция Клас IIb: Поради тяхната висока отрицателна предиктивна стойност, преоперативните point-of-care тестове за оценка на риска от кървене са полезни за идентифициране на пациентите с остатъчно тромбоцитно инхибиране и тези които могат да бъдат подложени на операция без увеличен риск от кървене. Point-of-care тестовете за оценка на периоперативната тромбоцитна функция могат да бъдат полезни за намаляване на трансфузиите с кръвни продукти

20 КОГА ДА ПОДОЗИРАМЕ ДЕФЕКТ В ТРОМБОЦИТНАТА ФУНКЦИЯ Клинично изявено кървене при нормални коагулационни тестове Анамнеза за : Необичайно кожно-лигавично кървене, кървене при зъбна екстракция, епистаксис, менорагия или постоперативно кървене Дали кървенето е скорошно или от детска възраст Фамилна анамнеза за масивно кървене Прием на медикаменти, повлияващи тромбоцитната функция

21 С КАКВО ДА ЗАПОЧНЕМ? CBC Тромбоцитен брой MPV Натривка от периферна кръв Извършване на изследвания за бъбречна и чернодробна функция, парапротеини Време на кървене

22 АВТОМАТИЗИРАНИ ТРОМБОЦИТНИ ФУНКЦИОНАЛНИ ТЕСТОВЕ Рутинни тромбоцитни тестове LTA светлинна абсорбционна агрегометрия Point-of-care тромбоцитни тестове - PFA - VERIFY NOW - MULTIPLATE Специфични - Флоуцитрометрия

23 СВЕТЛИННА ТРАНСМИСИОННА АГРЕГОМЕТРИЯ (LTA) Турбидиметричнен метод, разработен през 1962 година от Born. Тромбоцитната агрегация се измерва спектрофотометрично в богата на тромбоцити плазма (PRP). Образуването на агрегати след прибавяне на агрегиращи агенти довежда до увеличение на светлинната трансмисия и промяна в сигнала. A. Mодел на агрегация В. Принцип на светлинната трансмисионна агрегометрия (по Jackson S P Blood, JASH 2007;109: )

24 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Christopher M. Platelet function testing, ISTH 2017

25 ДИАГНОСТИЧНА СТОЙНОСТ НА LTA Служи основно за разграничаване на нарушена от нормална тромбоцитна функция LTA самостоятелно не идентифицира всички пациенти с нарушена функция Липсва стандартизация Необходим е консенсус по отношение на панела от агонистите и техните концентрации, дефиниция на референтните интервали от здрави контроли и патологичните резултати Най-полезния допълнителен тест е измерване на секрецията от гранулите Честотата на абнормалните резултати при дефекти в секрецията варира между различните проучвания между 14.3% - 56%. Не се препоръчва за мониториране на антитромбоцитната терапия Hayward et al. JTH 2009 Quiroga et al. Br.J Haematol 2009 Pal et al. Am J Clin Pathol 2011 Dawood et al. Blood 2012

26 PFA -100 collagen aperture Образуване на тромбоцитна запушалка на отвора в мембраната - отчита се времето (скоростта) за затваряне на отвора. PFA глобален тест за тромбоцитна адхезия и агрегация в условия на висок shear stress. Отчита намалението на скоростния поток при преминаване на тромбоцити в цитратна пълна кръв през апертура, натоварена с колаген при скорост от sес-1. Измерва се времето на затваряне на апертурата от агрегералите тромбоцити Closure time (CT ). Замества времето на кървене. Чувствителен към дефекти в тромбоцитните рецептори GPIIb/IIIa, GPIb, дефекти на VWF.

27 VerifyNow Светлинен източник Агонист Тромбоцитите се активират от агониста в смесителната камера + Смесителна камера Фибриноген-покрити частици Измерва се нивото и степента на промяна в светлинната трансмисия Аглутинираните частици се струпват в купчини от агрегати Определя се степента на агрегация на тромбоцитите в пълна кръв върху полистиренови гранули, покрити с фибриноген. Резултатите се отчитат за 3 минути. Недостатъците са ограничението само с 3 вида картриджи (Aspirin Assay, IIb/IIaAssay и P2Y12 Assay) и високата цена на изследването. Принцип на VerifyNow тромбоцитни функционални тестове.

28 MULTIPLATE - агрегометрия Multiplate (multiple platelet function analyzer) е POC- апарат за изследване на агрегацията в пълна кръв спрямо различни агонисти. Предимствата на Multiplate са: бързината на изследването (времето за анализ е 10 минути) измерването на тромбоцитната функция директно от пълна кръв - естествена среда за тромбоцитното функциониране електронната пипета осигурява стандартизация на накапванията Активатори (агонисти) на тромбоцитите: арахидонова киселина - ASPI тест АДФ - ADP тест АДФ и простагландин Е1 ADPтест HS пептид, активиращ тромбиновия рецептор - TRAP колаген - COL тест ристоцетин - RISTO тест

29 Aгрегация [AU] ПРИНЦИП НА ИЗМЕРВАНЕ Импедансна агрегометрия Активираните тромбоцити разкриват своите рецептори на повърхността си и се прикрепят към сензорните електроди като увеличават електрическото съпротивление. Промяната в импеданса се изразява в Агрегационни единици (AU). ПАРАМЕТРИ НА ИЗМЕРВАНЕТО [AU/min] AU*min [AU] Време [min] Изчисляват се 3 параметри: Агрегация [AU] височина на кривата Скорост [AU/min] стръмност на кривата Площ под кривата на агрегация [AU*min], отразява общата тромбоцитна активност и се представя в 1 U = 10 AU*min

30 РАЗГРАНИЧАВАНЕ НА ВРОДЕНИ НАРУШЕНИЯ ЗАБОЛЯВАНЕ TRAP ASPI ADP TЕСТ COL RISTO HIGH RISTO LOW ADP рецепторни дефекти NORMAL* NORMAL* LOW NORMAL* NORMAL* NORMAL (=low) VON WILLEBRAND (Type I, III, II) NORMAL* NORMAL* NORMAL* NORMAL* LOW NORMAL (=low) VON WILLEBRAND IIb NORMAL/ LOW NORMAL/ LOW NORMAL/ LOW NORMAL/ LOW NORMAL/ LOW HIGH BERNARD SOULIER NORMAL* NORMAL* NORMAL* NORMAL* LOW NORMAL (=low) GLANZMANN THROMBASTHENIA LOW LOW LOW LOW LOW NORMAL (=low) Andreas Calatzis, Round table meeting hematology 2010, Munich

31 РАЗГРАНИЧАВАНЕ НА vwd И Bernard Soulier Syndrome Прибавянето на vwf коригира агрегацията с ристоцетин при vwd, но не и при Bernard Soulier Syndrome TRAPtest ASPItest Прибавяне на vwf ADPtest COLtest RISTOtest high

32 vwd тип II Терапевтично приложение на vwf преди зъбна екстракция - корекция на RISTO-тест : 3000 IE vwf in vivo Andreas Calatzis, Round table meeting hematology 2010, Munich

33 ИНХИБИРАНА АГРЕГАЦИЯ ОТ ZOLOFT ADP 28 U ASPI 25 U TRAP 50 U Време на кървене 15 мин. Thr 173 x 109/l INR 1.08 aptt 27 s AT III 96 % Liatest vwf 192 % Zoloft: Селективен инхибитор на серотонина. 1 месец след спиране на терапията: ADP 42 U ASPI 56 U TRAP 72 U I. Paskaleva, University National Heart Hospital - Sofia

34 МАСИВНО КЪРВЕНЕ СЛЕД ЕКК Дете на 17 г. с Т/Ф РТ 16,8 S; INR 1.4 aptt 30 s; R 1.17 Fib 400 mg/dl D Dimer 1.7 mg/l Thr 141 x 10 9 /l ADP - 17 U TRAP 21 U

35 ФЛОУЦИТОМЕТРИЯ Разредена антикоагулирана кръв се инкубира с различни антитела и багрила, които се свързват специфично с индивидуални тромбоцитни белтъци, гранули и липидни мембрани. Изисква скъпа апаратура и високо квалифициран персонал. НЕАКТИВНИ ТРОМБОЦИТИ АКТИВИРАНИ ТРОМБОЦИТИ Мембранни рецептори Брой на плътните гранули Israels, McNicol, Laboratory investigation of platelet function disorders, ISTH 2015 Маркери за тромбоцитно активиране: Екзоцитоза на гранулите Свързване с фибриноген Разкриване на прокоагулантна активност Освобождаване на активни субстанции

36 ТЕСТОВЕ - ВИДОВЕ Предоставя широки възможности за оценка на тромбоцитите и тяхната агрегация. Тестове, сварзани с екзоцитоза на гранулите Тестове, свързани с тромбоцитните рецептори Маркери за активация CD62P (P-селектин) - a-гранули CD63 лизозоми Mepacrine uptake/release плътни гранули GPIIb-IIIa (CD41/CD61) Glanzmann GPIb-IX (CD42a/CD42b) Bernard-Soulier) GPVI (CD36) - колаген GPIь-IIa (CD33/CD49b) - колаген PAC-1 (fibrinogen mimetic) - GPIIb-IIIa Annexin V анионни фосфолипиди Christopher M. Platelet function testing, ISTH 2017

37 МОНИТОРИРАНЕ НА ТЕРАПИЯ - VASP тест Измерва специфичен интрацелуларен маркер на остатъчна P2Y12 активност. VASP се фосфорилира от самр, продуциран от аденилат-циклазната каскада, регулирана от P2Y12 рецептора. ADP, свързвайки се с рецептора, подтиска каскадата и увеличава дефосфорилацията на VASP. Инхибирането на рецептора от клопидогрел довежда до увеличение на фосфорилацията на VASP. Резултатите се изразяват като PRI - отношение между фосфорилирания и дефосфорилирания VASP. Вазодилататорно стимулирана протеинова фосфорилация Varenhorst C. Platelet inchibition in CAD Mechanisms and Clinical Importance Uppsala. ISBN

38 РАЗГРАНИЧИТЕЛНИ ГРАНИЦИ ПРИ ТЕРАПИЯ Platelet function testing Newest consensus paper Verifynow Odds ratio 2-3 Тест, единици Cutoff-граница, свързана с исхемични събития Cutoff-граница, свързана с кървене VASP 1.16 LTA 2-6 VerifyNow PRU Assay, PRU > 208 < 85 Multiplate analyzer ADPinduced aggregation, U > 46 < 19 Page 43 Andreas Calatzis, calatzisa@gmail.com Multiplate highest relative risk for clopidogrel resistant patients using the Multiplate analyzer 12 VASP-PRI 50 < 16 ADP, adenosine diphosphate; AU, aggregation units; PRU, P2Y 12 reaction units; VASP-PRI, vasodilator-stimulated phosphoprotein-platelet reactivity index. Rev.Esp.Cardiol :480-7 Personalized Antiplatelet Therapy, Paul A. Gurbel all.

39 ФУНДАМЕНТАЛНИ НЕРЕШЕНИ ПРОБЛЕМИ Изследванията, обхващащи тромбоцитната функция са вариабилни в същността си, тъй като се изследва клетъчна функция и динамика на живи клетки, а не отделен показател. Не се провeждат при физиологични условия: напр. нисък shear stress, не отчитат участието на съдовите стени, измерват в отсъствие на RBC, WBC Корелацията между отделните тестове е слаба - затруднение в сравнението на резултатите с различните методи Достъпът до специализирани тестове е ограничен Само малък брой рядки вродени заболявания (GT,BSS) могат да бъдат диагностицирани само с оптична агрегометрия

40 ИЗПОЛЗВАНЕ НА ТЕСТОВЕТЕ Проучване от 202 лаборатории в 37 страни Включени изследвани пациенти: диагностицирани пациенти с заболявания на тромбоцитната функция 40 % Laboratory testing for PDP Gresele et al. J Thromb Haemost 2014; 12:1562

41 ГЕНЕТИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ Панел за генетична идентификация 32 гена Въпреки проведените лабораторни изследвания около над 50 % от пациентите с нарушена тромбоцитна функция остават без точна диагноза Генетичните тестове характеризират дефектите на молекулно ниво Christopher M. Platelet function testing, ISTH 2017

42 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нарушенията в тромбоцитната функция са чести, диагностичното уточняване е предизвикателство Анамнезата и клиничната оценка са от съществено значение, както и обсъждане на интерфериращи фактори медикаменти и храни Скриниращите методи не са достатъчно чувствителни и специфични Агрегометрията и тестовете за оценка на секрецията са найизползваните методи в клиничната лаборатория, изискват квалифициран персонал, опит, време, скъпа апаратура Голяма част от пациентите остават без уточнена диагноза При съмнение за вроден дефект във функцията генотипизирането е по-ефективен метод в сравнение с фенотипизирането Агрегометрията от пълна кръв е препоръчвания метод за оценка на антитромбоцитната терапия

43 . БЛАГОДАРЯ ЗА ВНИМАНИЕТО!