АВТОРСКА СПРАВКА за приносния характер на научните трудове в съавторство на гл. ас. д-р Венцислава Петрова кандидат в конкурса за научна длъжност Доце

Препис

1 АВТОРСКА СПРАВКА за приносния характер на научните трудове в съавторство на гл. ас. д-р Венцислава Петрова кандидат в конкурса за научна длъжност Доцент по 4.3. Биологически науки (Обща и приложна микробиология и микробна биоинформатика) Представените трудове на кандидата са в научната област на конкурса и са обобщени в основните направления обща, приложна микробиология и микробна биоинформатика. Научните приноси, в съответствие с посочените научни направления, са обобщени както следва: I. Обща микробиология: теоретични аспекти на клетъчна и молекулярна микробиология на еукариотни микроорганизми I.1. Клетъчни и молекулярни механизми на стресов отговор при дрожди В развитието на съвременната биология сериозно място заемат изследванията, свързани с клетъчните и молекулни механизми на стресов отговор и особеностите на оксидативния стрес. Проучването на тези процеси в клетката, използвайки един от найподходящите и достъпни еукариотни модели дрождите, допринася за задълбочаване на познанията относно механизмите за поддържане на редокс хомеостазата, както и за изграждането и еволюцията на клетъчната антиоксидантна система. Изследвани са три метаболитно различни типа дрождеви организми: факултативно анаероби Крабтри (+) (Saccharomyces cerevisiae), които се развиват на глюкоза с висока катаболитна скорост ( mmol глюкоза g -1 min - 1 ) и с ниска консумация на кислород (5 50 mmol О2 g -1 min -1 ) и синтезират етанол в аеробни условия; респираторни Крабтри (-) (представители на родовете Pichia, Hansenula и Kluyveromyces), които се характеризират с високи нива на дишане по 1

2 време на усвояването на глюкоза ( mmol О2 g -1 min -1 ) и много ниска скорост на глюкозен катаболизъм (10 40 mmol глюкоза g -1 min -1 ); и облигатно респираторни (представители на родовете Cryptococcus и Rhodotorula), които не са способни да ферментират въглеродните източници. Тези метаболитно различни дрождеви микроорганизми притежават разнообразни механизми на репарация и протекция в отговор на стресови условия. Този отговор е проследен чрез изследване на следните клетъчни и молекулни аспекти: a) растеж и/или клетъчна морфология; б) кинетичен отговор на клетъчната култура на стресови условия; в) метаболитна активност; г) динамика на ензимна компартментализация д) генни мутации и регулация. Клетъчният отговор показва комулативен ефект от промени, които стават на ниво транскрипция, транслация или метаболитно активиране/деактивиране, клетъчна морфология или растеж. Изследванията в тези аспекти води до формулирането на следните важни научни приноси: а) Влияние на стресови фактори върху растежа и/или клетъчната морфология (публикации I-12A-2-2-2, I-12A-2-2-4, I-12A и I-12A ) За оптимален растеж и функция на дрождевите микроорганизми е необходимо наличието на специфични и деликатно балансирани условия на околната среда. Всяка рязка промяна в параметрите на култивиране може да доведе до нарушаване на клетъчната хомеостаза и провокиране на съответен клетъчен отговор. Един от подходите за преодоляване на неблагоприятните условия на средата при дрожди е свързан с регулацията на жизнения цикъл и клетъчната морфология. С тази цел е изследвана промяната в клетъчния растеж и структура при модулиране на условията на култивиране (източник на въглерод: глюкоза, етанол, метанол, глицерол), както и при въздействие с различни стресови фактори (Н2О2, паракват, менадион, Cd 2+ ). Научните приноси на получените резултати могат да бъдат обобщени както следва: Охарактеризиран е клетъчният растеж и динамиката на органелна биогенеза при различни по своя метаболизъм дрождеви микроорганизми 2

3 (ферментативни, респираторни и обигатно окидативни) в условия, индуциращи стресов отговор. Оценен е ефектът на въздействие на различни индуктури на оксидативен стрес (Н2О2, паракват, менадион) върху растежа на дрождеви микроорганизми с ферментативен, респираторен и облигатно оксидативен тип на метаболизъм. Установено е, че дрожди с ферментативен тип на метаболизъм са значително почувствителни към въздействието на екзогенни ксенобиотици, в сравнение с такива с респираторен или окислителен тип на метаболизъм. Изучен е in vivo токсичният ефект на различни концентрации на Cd 2+ при 7 метаболитно различни дрождеви вида (Крабтри отрицателни: Candida glabrata и Schizosaccharomyces pombe; и Крабтри положителни: Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces maxianus и Rhodotorula graminis). Установено е повишена устойчивост към тежки метали и запазване на жизнеспособност в присъствието на високи концентрации на Cd(NO3)2 (1.5 mm) при два вида дрожди - H. polymorpha и R. graminis. б) Кинетичен отговор на клетъчната култура на стресови условия (публикации I- 12A-2-2-2, I-12A и I-12A ) Постигането на балансиран растеж и запазване на редокс-хомеостазата в дрождевата клетка е изучено чрез проследяване корелацията между растежните параметри на метаболитно различни дрождеви култури и стратегиите им за преодоляване на различни стресови въздействия. Изследванията са проведени в периодична система за култивиране, в присъствието на различни въглеродни източници глюкоза, етанол, метанол и глицерол. Получените резултати имат следния приносен характер: Определена е връзката между условията на култивиране, кинетичните параметри на растеж ( и Yx/s) и механизмите на стресов отговор при дрожди, характеризиращи се с различен тип на метаболизъм ферментативни (p. Saccharomyces), респираторни (p. Kluveromyces, p. Pichia и p. Hasenula) и облигатно оксидативни (p. Rhodotorula). Установено е, че добивният коефициент (Yx/s) е по-нисък при щамовете с ферментативен, в сравнение с тези, имащи оксидативен тип на метаболизъм, 3

4 независимо от почти изравнените стойности за max. Този феномен корелира както със степента на окисленост на въглеродните субстрати, така и със специфичната скорост на усвояването им. в) Метаболитна активност (публикации I-12A-2-2-2, I-12A-2-2-4, I-12A и I- 12A ) Ролята на въглеродния метаболизъм в метаболитната адаптация и поддържането на клетъчната редокс-хомеостаза при дрожди е оценена чрез проследяване на специфичните активности на ключови ензими от антиоксидантната защитна система СОД и каталаза. Получените резултати имат следния научен принос: Установена е връзката между условията на култивиране, динамиката на клетъчен растеж и регулацията на генната експресия на СОД и каталаза при дрожди с различен тип на метаболизъм: ферментативен, респираторен и оксидативен тип на усвояване на въглеродния източник. Охарактеризирани са електрофоретичните профили на ключовите антиоксидантни ензими СОД и каталаза при 5 дрождеви вида (S. cerevisiae, K. marxianus, P. pini, H. polymorpha и R. glutinis) и са установени еволюционните и метаболитни връзки между тях. За първи път е установено, че в условия на повишена концентрация на ROS в клетките на метилотрофни дрожди от родовете Pichia и Hansenula се експресират допълнителни мултимерни форми на Mn СОД. Получени са оригинални доказателства за висока термостабилност и слабата устойчивост на редуциращи агенти на СОД ензимите при метилотрофни дрожди от родовете Pichia и Hansenula. г) Динамика на ензимната компартментализация (публикации I-12A и I-12A ) Основна протектираща роля при обезвреждането на активните кислородни видове в клетката имат ензимите супероксид дисмутаза (СОД) и каталаза, чието кооперативно действие осигурява незабавното обезвреждане на ROS на мястото на тяхното възникване. Този феномен е в основата на настоящото изследване, а именно доказване локализацията на 4

5 такава двойка ензими в различни клетъчни участъци, които да осигуряват висока ефективност на процесите на детоксикация и възможно най-кратък живот на О2.- и Н2О2. Изследването на различни по своя тип метаболизъм дрождеви микроорганизми са получени следните резултати, които имат важен научен принос: За първи път е доказана възможност за двойно насочване на пероксизомалната каталаза и Mn СОД при метаболитно различни типове дрожди (факултативно ферментативни и обигатно окидативни) в два типа органели - пероксизоми и митохондрии, където тези ензими играят ключова роля при поддържане на редокс хомеостазата. Манипулиране синтезата преимуществено на пероксизоми и митохондрии е постигнато чрез управляемо култивиране на дрождевата популация съответно на хранителна среда съдържаща метанол и глицерол и етанол. Промяната в клетъчния метаболизъм води до изменение в насочването на каталазния и Mn СОД ензим към пероксизоми и митохондрии. В условия на индукция на пероксизомалната синтеза 60 % до 80 % от ензимната активност се локализира в пероксизомите, докато при активиране на процесите на митохондриално дишане 40 % до 65 % се установява в митохондрии. В контролни условия при наличие в средата на глюкоза, пероксизомалната каталаза и Mn СОД се разпределят относително равномерно между двата типа органели. Предложен е нов in situ модел за детоксикация на реактивни кислородни видове в дрождевата еукариотна клетка. Според този модел, основна роля в разграждането на О2.- и Н2О2, образувани в метаболитните процеси, протичащи в отделните клетъчни комлартменти (пероксизоми, митохондрии, цитоплазма), имат двойката ензими СОД и каталаза локализирани в тях. По този начин се осъществява разграждане на ROS на мястото на тяхното възникване. Това осигурява висока ефективност на процесите на детоксикация и възможно най-кратък живот на тези увреждащи клетъчните структури агенти. e) Генни мутации и регулация на стресовия отговор (публикации I-12A-2-2-6) Основен фактор на неензимната клетъчна защита от кислородния стрес при дрожди е глутатиона. Мутацията на URE2 гена, води до намаляване на вътреклетъчната 5

6 концентрация на глутатион. Нативният ген кодира белтък, който е изолиран и охарактеризиран като един от основните вътреклетъчни регулатори на азотната катаболитна репресия. Независимо от тази му функция обаче, той освен място за свързване с GATA транскрипционните фактори има и структурно и функционално сходство с глутатионтрансферазите (GSTs). От друга страна през последните години сложната система на генетичната регулация на усвояването на азотните източници в клетката все повече се свързва и с различни аспекти на клетъчния стресов отговор, и по-специално с хомеостазата на глутатион. Имайки предвид тези данни, нашите изследвания бяха насочени към установяване ролята на Ure2p белтъка в азотния метаболизъм и антиоксидантния клетъчен отговор. Въз основа на проведените изследвания е получен следният резултат с приносен характер: Доказано е за първи път, че Ure2p белтъкът при дрожди S. cerevisiae има основна роля в защитата на клетката срещу тиол-окисляващите агенти като Н2О2. Това се дължи на фактът, че URE2 мутацията води до намаляване на вътреклетъчната концентрация на глутатион и клетките се характеризират с нарушен антиоксидантен баланс и повишена белтъчна деградация. В процеса на регулация на глутатионовата синтеза, ключова роля има GATA сигналния път, който упражнява негативен контрол върху вътреклетъчното разграждане на глутатион. I.2. Изучаване на връзката между структура и функция при Cu/Zn СОД от дрожди Kluyveromyces marxianus: ключов биомаркер на оксидативния стрес (публикации I-12A-2-2-5, I-12A и I-12A ) Cu/Zn СОД е ключов ензим от антиоксидантната защитна система на клетката, който намира и широко приложение като ключов биомаркер на оксидативния стрес. Във връзка с това от важно значение е изясняването на особеностите на структурата и свързаните с нея функции на този белтък. За целта бе разработена бърза и ефективна схема на пречистване, включваща първоначално термично третиране на получения безклетъчен екстракт. Последващото пречистване на концентрираната СОД фракция става посредством йоннообменна хроматография. В резултат на проведените експериментални процедури става изолиране на чист продукт с активност 996 U / mg и добив от 53%. След изолирането на чист 6

7 препрат от Cu/Zn СОД последващите изследвания са насочени към неговото подробно химично характеризиране. За целта нативният белтък е анализиран мас-спектрометрично (ESI-MS) и с газ-хроматографска техника. Проведен е и сравнителен анализ на аминокиселинната последователност на изолираната Cu/Zn СОД с други дрождеви видове. Допълнително е характеризиран и адсорбционния спектър на ензима. Проучено е и влиянието на различни органични съединения, метални йони и ензимни инхибитори върху активността на СОД ензима от Kluyveromyces marxianus. В резултат на проведените изследвания могат да се посочат следните основни приноси с научен характер: Разработена е бърза, високо специфична и ефективна 3-стъпална процедура за получаване на пречистен Cu/Zn СОД ензим от дрожди Kluyveromyces marxianus. Cu/Zn СОД ензим при дрожди от вида K. marxianus е гликозилиран, като въглехидратният остатък е изграден изключително от манозни остатъци (GlcNAc2, Man5). Съгласно построеният 3-D модел на белтъка, въглехидратната верига е разположена на повърхността на молекулата. Установени са специфичните структурни характеристики на Cu/Zn СОД белтък, дължащи се на неговата гликопротеинова природа. Тя е термостабилна и устойчива на метални йони, детергенти и инхибитори. II. Приложна микробиология: ферментационни процеси, получаване на биологично активни вещества и патентоване II.1. Генетичен контрол на индустриални ферментации (публикации I-12A и I-12A-2-2-7) При индустриални ферментации дрождевите микроорганизми са подложени на разнообразни стресови условия, такива като повишени температури, оксидативен, хиперосмотичен или йонен шок. Това може да доведе до значителни промени в техния геном. Тези генетичните реорганизации могат да изменят първоначалните характеристики на производствените щамове по отношение на ефективност и продуктивност на 7

8 ферментационния процес. Предвид тази особеност, от съществено значение за микробиологичната индустрия е създаването на бърз и надежден метод за оценка на генетичната стабилност на индустриалните щамове. В проведените изследвания е създадена опростена процедура за изолиране, пречистване и анализ на митохондриална ДНК (мтднк), като времето за получаване на краен резултат е съкратено с 80%. Така изолираната и пречистена мтднк е използвана за изследване на генетичната стабилност на 5 щама Saccharomyces carlsbergensis, които се използват за получаване на 5 различни търговски марки бира. Получените резултати са сравнение с данните получени от 2 други класически подхода за генетично изследване на щамове Saccharomyces: кариотипиране и PCR анализ с δ-праймери. Проведеното изследване потвърди, че mtdna-rflp анализът е толкова надежден колкото другите конвенционални подходи, като същевременно е доста по-бърз и икономически обоснован. Приносният характер на направената разработка може да се обобщи в: Разработена е опростена процедура за генетичен контрол на индустриални дрождеви ферментации, основаваща се на mtdna-rflp анализ. Методът е лесен за изпълнение, икономически изгоден и получените данни са надеждни за интерпретация. Дава високо дискриминативни и възпроизводими резултати и може достоверно да се използва за оценка на влиянието на различни стресови фактори на средата върху генетичната стабилност на микробните популации. II.2. Биотехнология на термотолерантни лактозоусвояващи дрожди от р. Kluyveromuces продуценти на D-аминооксидаза и β-галактозидаза, α кетокиселини, β-галактоолигозахариди, хранителни добавки и ароматни вещества Лактозоусвояващите дрожди притежават разнообразни ферментативни активности и се използват за получаването на различни хранителни продукти. Те намират широко приложение като клетъчна фабрика при биотрансформацията на млечна суроватка (пермеат), страничен продукт от млекопреработването, притежаващ висок замърсяващ потенциал за околната среда. Лактозоусвояващите дрожди от род Kluyveromyces притежават значителен потенциал в този аспект, поради факта че усвояват лактозата ефективно, термотолерантни са, имат висока скорост на растеж и притежават GRAS статус - 8

9 характеристика от особено голямо значение с оглед съвременните изисквания за сигурност и безвредност на храните и технологиите. В процеса на усвояване на хранителни вещества от млечната суроватка (пермеат), дрождите синтезират и редица ензими, като от особен интерес са ß-галактозидазата и D-амино оксидазата, които могат да намерят приложение за получаване на галактоолигозахариди и α-кето киселини. Последните са продукти с голямо значение за създаването на функционални храни. Тези особености на дрождите от род Kluyveromyces са и в основата на провеждането на редица изследвания, които имат за цел да се селекционират лактозоусвояващи и термотолерантни дрожди с повишена биосинтеза на гореспоменатите ензими. В резултат на проведените комплексни изследвания са селекционирани щамове дрожди принадлижащи към род Klyuveromyces, които притежават важни биотехнологични предимства като добре развита технология, термотолерантност, способност да усвояват отпадъчната суроватка от млечната промишленост, имат GRAS статус и могат успешно да се използват за получаването на ценни за фармацевтичната и хранително-вкусовата промишленост вещества, а именно D-аминооксидаза и α-кетокиселини, както и β-галактозидаза и галактоолигозахариди и хранителни добавки. II.2.1. Биосинтеза и експресия на D-аминооксидаза, СОД, каталаза и β- галактозидаза, и получаване на ценните от биотехнологична гледна точка α-кето киселини и галактоолигозахариди (публикации I-12A-2-2-3, I-12A и патент I-12D- 1) Изследванията върху способността на држди от род Kluyveromyces да синтезират биологично ценни метаболити при култивиране на среда с млечна суроватка (пермеат) позволи получаването на следните резулти с принсен характер: Чрез оптимизиране на условията за култивиране, пермеабилизиране и имобилизиране с глутар-алдехид е постигната свръх-експресия на D-аминооксидаза, СОД, каталаза и β-галактозидаза. Осъществен е процес на биотрансформация на D-аланин до пируват с имобилизирани и пермеабилизирани клетки с ефективност на биоконверсия >98% и добив 16.6 mmol g 1 h 1. 9

10 Разработен е оригинален метод за получаване на D-аминооксидаза и съпътстващи ензими (СОД, каталаза и β-галактозидаза) от щам K. marxianus NBIMCC No 8362, защитен с патент Чрез оптимизиране на условията на култивиране и добавяне на глицерол в средата, като стимулант на трансгалактозидазните процеси, е постигнатата 50.3 % биоконверсия на лактоза до галактоолигозахариди и добив от mg ml -1 продукт. Чрез биоконверсия на лактоза са синтезирани три- и тетраолигозахариди, изградени предимно от галактоза. II.2.2. Селекция на дрожди с пробиотичен ефект Щамът продуцент K. marxianus 903 притежава GRAS статус и необходимите технологични качества (термотолерантност, висока асимилационна способност по отношение на лактоза и добив на биомаса). Установени са подходящи хранителни среди и условия за култивиране на селекционирания щам за обогатяване на биомасата на белтък/нуклеинови киселини или мазнини. Получената биомаса/дезинтеграт е богата на фибри, витамини и аминокиселини. Тези качества на препаратите позволяват тяхното ефективно приложение в медицината и хранително-вкусовата промишленост за повишаване качеството на живот, тъй като те съдържат компоненти с антихолестеролов ефект, антитуморна и имуномодулираща активност. Въз основа на проведените изследвания е получен пробиотичен препарат, представляващ суха биомаса/дезинтеграт от дрождеви щам Kluyveromyces marxianus 903, с повишено съдържание на белтък (45,5 %), есенциални аминокиселини (68 % от тоталния белтък) и витамини (0,046 %). Пробиотичният препарат, е с повишено съдържание на мазнини, обогатени на 3 и 6 мастни киселини (9,3 %), есенциални аминокиселини (68 % от тоталния белтък) и витамини (0,046 %). Разработен е метод за получаване на пробиотичен препарат описан в патентна заявка Пробиотичен препарат ЛАКТОСЕЛ 2745/

11 II.3. Биосинтеза и получаване на на ароматни съединения (2-фенилетанол) от дрожди принадлежащи към р. Saccharomyces и р. Kluyveromyces (статии I-12A и I- 12A ) Производството на естествени аромати традиционно се основава на пряката им екстракция от природни продукти, въпреки че този подход притежава множество недостатъци. От друга страна, използването на биотехнологични процеси, основаващи се на микробна "де ново" синтеза или на биотрансформация на прекурсори от микробни клетки или ензими, са удобна алтернатива за тяхната биосинтеза. В тази връзка, са проведени изследвания, които се фокусират върху способността на три щама дрожди, принадлежащи към родовете Saccharomyces и Kluyveromyces, да синтезират 2-фенилетанол. Определени са кинетичните им параметри, нивото на експресия на аминотрансфераза [ЕО: ], пируват декарбоксилаза [ЕО: ] и алкохол дехидрогеназа [ЕО: ], както и техните кодиращи последователности. Въз основа на проведените изследвания е получен научен резултат с важен приложен принос: Селекциониран е щам K. marxianus 35, който има висок капацитет за биотрансформация на L-Phe до 2-фенилетанол, както и притежава редица технологични предимства: Крабтри (-) тип на метаболизъм (не синтезира етанол) и GRAS статус. Установена е и връзката между генетичната характеристика на щама и неговия потенциал за биотехнологично производство на ароматни съединения. II.4. Биосинтеза, получаване и свойства на пигментни препарати от гъби, принадлежащи към р. Monascus (патентна заявка I-12D-3) Щам Monascus рilosus C1 Cit - НБПМКК 8656 е селекциониран като продуцент на биоактивни продукти, които имат приложение като комплексна хранителна добавка със здравословно действие. Той притежава необходимите технологични качества (цитринин неситезиращ, анаморфен, термотолерантен, с висока асимилационна способност по отношение на глюкоза и добив на биомаса). Установени са подходящи хранителни среди и условия за култивиране на селекционирания щам за биосинтезата на пигменти и съпътстващи биоактивни продукти. Полученият прахообразен, оранжево/червено оцветен водоразтворим продукт е нетоксичен и е обогатен на червени/оранжеви пигменти, монаколини, антиоксиданти, липиди и/или метилкетони. Характеризира се с 11

12 антибактериален и антъгъбен ефект. Обогатената на тези биологично активни компоненти биомаса, може директно да се прилага или да се използва за получаването на чисти биоактивни вещества, Полученият пигментен продукт може да намери приложение в медицината, козметиката и хранително-вкусовата промишленост. Регистриран е щам Monascus pilosus C1 Cit - продуцент в Национална банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури под регистрационен НБПМКК 8656, като продуцент на биомаса, пигменти и биоактивни продукти. Разработен е метод за получаване на прахообразна, оранжево-червено оцветена водоразтворима субстанция, с висока температурна и ph стабилност, обогатена на антиоксиданти и липиди, характеризираща се с антибактериален и антъгъбен ефект. Полученият препарат се характеризира с липса на остра и хронична токсичност, както и на негативно влияние върху репродукцията. Направена е патентна заявка Щам Monascus pilosus- продуцент на биоактивни продукти / III. Микробна биоинформатика: анализ на гени и генни клъстери, регулиращи биосинтезата на вторични метаболити и механизмите на защита при индусриален стрес Съвременните постижения на експерименталната и компютърна биология позволяват изучаването на комплексни проблеми в областта на еволюцията на биологичната адаптация и стресов отговор. Сравнителният анализ на съвкупността от тези биоинформатични данни предоставя възможност да се оцени ролята на генетичните елементи в определянето на клетъчна пластичност и устойчивост към различни стресови въздействия. III. 1. In silico анализ на механизмите на клетъчен отговор на индустриален стрес и адаптиране при гъби (публикации I-12A-2-2-9, I-12A , I-12A , I-12A , I-12A и I-12A ) III.1.1. Проведен е in silico анализ на гени, участващи в антиоксидантната защитна система, при дрожди от вида Saccharomyces cerevisiae. С помощта на биоинформатични 12

13 подходи е изследвана жизнеспособността на клетки, дефицитни по различни гени, кодиращи ключови ензими от антиоксидантанат защитата ( sod1-2, ctt1, cta1, gpx1-3, gtt1-2, ure2, ccp1, tsa1-2, prx1, glr1, trr1-2). Всеки анализиран ген е категоризиран като синглетон или дуплициран, и делецията в него като водеща до жизнеспособен или летален фенотип. Допълнително, изследваните гени са обозначени като жизнено важни, ако тяхната делеция или загуба на функция в резултат на мутация, води до смърт на организма. Изследвана е и вътреклетъчната локализация на анализираните антиоксидантни ензими. Наличието на различни сигнални последователности е проследено чрез PSORT II софтуер. Проведените изследвания имат фундаментален характер и допринасят за изясняване на редица приложни проблеми. В резултат на прведените анализи е устновен следният феномен, имащ приносен характер: Дупликацията на гените и появата на алтернативни метаболитни пътища са основни еволюционни механизми за адаптация на клетките и поддържане на клетъчния интегритет. За устойчивостта и гъвкавостта на ензимната антиоксидантна защитна система при дрожди от р. Saccharomyces, еволюционно преимуществено се постига чрез поява на алтернативни метаболитни пътища. III.1.2. С помощта на биоинформатични методи e проследена локализацията на Cu/Zn и Mn СОД при дрожди S. cerevisiae. Анализът на Sod1p и Sod2p аминокиселинни последователности разкри, че: Mn СОД при S. cerevisiae, притежава предполагаем PTS1 сигнал (GKI), който би могъл последователно да насочи протеина към допълнителен клетъчен компартмент - дрождевите пероксизоми. III.1.3. С помощта на биохимични и биоинформатични изследвания на 7 различни дрождеви вида (Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis и Rhodotorula graminis) са проучени механизмите за стресов отговор и придобиване на резистентност към токсични тежки метали - Cd 2+. Установено е, че видовете S. pombe и C. glabrata са устойчиви на високи концентрации на Cd 2+, като за първи път подобни характеристики са установени и при видовете H. polymorpha и R. graminis. III.1.4. Чрез сравнителния in silico анализ на ключови антиоксидантни ензими е доказано, че резистентността към този токсичен метал се дължи на генетично детерминирани особености на изследваните дрождеви микроорганизми.способността за преживяване в среди с високи концентрации на Cd 2+ се дължи на наличието на 13

14 дуплицирани копия на ключови антиоксидантни ензими, а именно - каталаза, глутатион пероксидаза и глутатион S-трансфераза, както и на възможността на тези белтъци да се насочват към различни клетъчни компартменти. III.1.5. Глутатионът е важна молекула от не-ензимната защита на клетката и присъства в повечето еукариотни организми. Този трипептид има ключова роля както в разграждането на екзогенни токсични вещества, така и при защита на клетката от оксидативен стрес. Във връзка с това при дрожди с различен тип на метаболизъм е проведен задълбочен in silico анализ на гените, участващи в биосинтезата на глутатион (синтетази) и тези кодиращи ензими, катализиращи конюгацията с различни ксенобиотици (трансферази). Получените данни имат следния научен принос: Доказана е висока еволюционна консервативност по отношение брой ортолози, кодиращи ензими от глутатионовия метаболизъм. Установена е и дивергенция в генната хомология и вътреклетъчна локализация. Тези фактори обуславят висока клетъчна метаболитна пластичност и адаптивност на изследваните дрождеви видове към различни стресови въздействия. III.1.6. Избрани щамове, принадлежащи към два вида Monascus (Monascus pilosus и Monascus purpureus), са използвани за изучаване на генетичните особености и експресионните профили на антиоксидантните ензими СОД и каталаза. Прилагането на компютърни подходи позволи идентифицирането на множество СОД и каталазни паралози в изследваните Monascus видове. М. pilosus се характеризира с два Cu / Zn СОД ензима, две Mn СОД-и и пет каталази, докато М. purpureus има три Mn СОД, две Cu / Zn СОД и пет каталази. Анализът на вътреклетъчната локализация на изследваните протеини показа, че освен типичните, те притежават и допълнителни сигнални последователности, които могат да ги насочват към различни клетъчни участъци. Получените резултати са потвърдени и биохимично чрез провеждането на изоензимен мултилокусен анализ. Като принос на изучения научен проблем може да се посочи: Създаване на подход за съвместно използване на биохимични и компютърни данни при еволюционен анализ на ключови за клетката гени. С разработването на този модел е доказано, че видовете принадлежащи към р. Monascus притежават няколко монофункционални СОД и каталазни ензими, експресиращи се асоциирано с растежа на клетката и в отговор на излагане на различни стресови въздействия. 14

15 III.1.7. Състоянието на покой (G0) е характерно за клетките на многоклетъчните организми, но за съжаление все още механизмите, които водят до неговото иницииране и поддържане са слабо изучени. С цел задълбочаване на познанията в тази област, са изследвани антиоксидантните ензими СОД и каталаза в експоненциално растящи и клетки в покой при две различни клетъчни линии - миши и човешки фибробласти. Чрез използването на биоинформатичен анализ и биохимични изследвания е демонстрирана висока степен на хомоложност на изследваните белтъци при човешки и миши клетки, както и десетократно повишаване на специфичната активност на СОД и каталаза в състояние на покой. Приносът за задълбочаване на познанията в областта на G0 клетките и особеностите на метаболитните процеси, обуславящи това състояние е: Демонстрирано е съществуването на обща програма, активираща се при клетки в покой, която води до намаляване нивото на реактивен кислородни видове и поддържане на редокс хомеостазата в клетката. Въз основа на всички описани по-горе резултати е създаден in silico модел за изследване и оценка на генетично детерминираните предимства (адаптивни стратегии) на еукариотната клетка, даващи възможност за бърз и координиран отговор на различни въздействия, свързани с оксидативния стрес. 2-14) III.2. In silico изследване на синтеза на ароматни алкохоли: (публикации I-12A-2- В последните десетилетия техниките за секвениране на генома се развиват с бързи темпове, което позволява бързото и лесно откриване на гени и прогнозиране на техните функции. Благодарение на това са разработени много подходи за клъстериране на анотирани гени въз основа на степента на хомология в тяхната нуклеотидна или аминокиселинна последователност. В настоящото сравнително геномно проучване е направен сравнителен анализ между набор от ARO гени, участващи в синтеза на ароматни алкохоли в два моделни дрождеви микроорганизма - Saccharomyces cerevisiae и Klyuveromyces lactis. Чрез комбинация, получена в резултат от сравнение на аминокиселинни последователности, използване на онлайн ресурси за хомология и топология на базирани клъстери, както и 15

16 софтуер за предсказване на вътреклетъчна локализация на протеини, са установени следните зависимости: Гените участващи в първите две стъпки от синтезата на 2-фенилетанол при К. lactis и S. cerevisiae са ортолози, като те притежават 40-62% идентичност на кодираните протеини и сходна клетъчна локализация. Изследваните щамове дрожди, имащи различен глюкозен метаболизъм, използват един и същи механизми за регулиране на процесите на биосинтеза на 2- фенилетанол. Наличието на втори ARO8 ортолог при K. lactis прави този вид екологично по-гъвкав и ефективен в производство на 2-фенилетанол. Въз основа на този експериментален подход и получените резултати е създаден in silico алгоритъм за охарактеризиране на щамове, продуценти на 2-фенилетанол, и предвиждане на техния потенциал за индустриално приложение. IV. Интегриране на научните изследвания в образователните програми за Магистърски степен по Микробиология и/или Биотехнология Създаден е електронен портал, обединяващ иновативни научни знания и практически казуси, реализирани с участието на автора. Представените обучителни материали са част от програми за онлайн обучение в различни научни и приложни области, в които са въведени съвременните европейски подходи за структуриране на учебната програма; прилагане на ИТ инструменти за обучение на учители /обучители по ПОО на секторно ниво; използване на подход за формално / неформално обучение с цел подобряване на качеството на квалификациите и компетенциите им и създаване на иновативно учебно съдържание, допринасящо за професионалното развитие на специалисти, работещи в областта на образованието, здравеопазването и индустрията. Учебното съдържание е организирано в обучителни резултати (OР), които се оценяват чрез придобитите знания, уменията и широки компетенции и чрез прилагането на ЕСТС/ECVET кредитни точки. Целта на разработените учебни помагала е да се подпомогне кариерното развитие на обучаващите се, което е основен приоритет за създаването на европейска икономика, основана на знания. 16

17 Авторът е участвал в разработката на следните учебни помагала, групирани съобразно ключовите направления от експертизата на кандидата и включващи научните постижения на автора и колектива. Направление Обща микробиология Dimova D., Petrova V., Hallet J.-N. Molecular methods of identification of pathogenic microorganisms (2004), Leonardo da Vinci Programme I Open and Distance Learning in Healthcare Microbiology and Immunology (ODL-HealthMI) BG/00BF/PP Резюме: Учебното помагало предоставя знания и умения в областта на молекулярната микробиология, повишавайки професионалната компетентност на бакалаври, магистри и/или специалисти, работещи в сферата на индустриалната и медицинска биотехнология. Описана е ролята на ДНК и РНК полиморфизма при разграничаване на микробните видове. Разгледани са и широк набор от молекулярни техники (включително пулсова електрофореза, клониране, блот анализ и хибридизация, белязане, амплификация на ДНК с различни праймери), намиращи приложение при молекулната идентификация на микроорганизмите. Представени са и различни стратегии за установяване на полиморфизма в бактериалния геном, плазмиди, рднки, геномни повтори, трансопзони и други важни секвенции. 17

18 Petrova V. and Kujumdzieva A. (2007) Genetics of industrial Saccharomyces and non-saccharomyces yeasts, Leonardo da Vinci Programme II Transitional Network of Biotechnology and Public Health (HelthBiotech) BG/02/B/F/NT Резюме: Учебното съдържание е посветено на съвременните познания върху основните приложения на дрождите в биотехнологиите. Внимание е отделено на дрождевия геном и основните аналитични процедури за клонирането, картирането и секвенирането му. Дискутирани са и ДНК рекомбионантни технологии, in vitro геномни манипулации, както и хетероложна експресия при дрожди. Представени са анализи с дрождеви системи, геномни и пост-геномни изследвания, целящи да изяснят генните функции. Разгледани са и съвременните приложения на рекомбинантните дрожди, като гостоприемници за експресия на чужди гени в биотехнологичните индустриални процеси. Курсът е предназначен за целеви сектори: индустриална и медицинска биотехнология, хранителна промишленост и земеделие. Потребители на учебения материал могат да бъдат университети, колежи и центрове за професионално обучение по биотехнология; МСП и технологични производствени единици в биотехнологичния сектор. Основни целеви групи са учащи и завършили студенти от университети и колежи, управители и управляващ персонал от МСП. Kujumdzieva A. and Petrova V. (2016) Genetically Modified Microorganisms - challenges and limitations. ERASMUS + program, Strategic Partnership project BG01-KA Резюме: Учебното съдържание предоставя информация относно подходите за оценка на риска на генно модифицирани (ГМ) и производни на тях продукти. Представена е концепцията на съществена еквивалентност на генно-модифицираните микроорганизми (ГММ), като са описани различни групи ГММ и продуктите, получени от тях. Предоставена е подробна информация, както и експериментални протоколи, за детекция на ГММ в околната среда. Описани са изискванията за оценка на риска от генетично модифицираните 18

19 микроорганизми и производните им продукти съгласно EFSA. Този курс е предназначен за целеви сектори: индустриална биотехнология, хранителна промишленост, земеделие, агрономство и опазване на околната среда. Основни целеви групи са учащи се и специалисти работещи в биотехнологични МСП. Направление Приложна микробиология Kujumdzieva A. and Petrova V. (2007) Public health and Genetically Modified Organisms, Leonardo da Vinci Programme II Transitional Network of Biotechnology and Public Health (HelthBiotech) BG/02/B/F/NT Резюме: Съдържанието е посветено на ГММ и тяхното приложение и ограничения в производството на храни. Представени са актуалните политики по отношение на ГМ технологиите в глобален мащаб и са очертани основните принципи за оценка на безопасността на ГММ в храните. Предоставена е и информация за здравните рискове от употребата на генетично модифицирани храни, както и основните подходи за оценка на тези рискове. Учебното помагало е разработено в подкрепа на научните изследвания в областта на образованието, прилагайки нови концепции и нова програма за гъвкаво обучение на широка група специалисти в областта на екологията и опазването на околната среда. Основните бенефициенти на програмата са учители, ментори и други образователни специалисти, които получават възможност да придобият актуални умения и компетентности, които са търсени на пазара на труда. 19

20 Petrova V., Kujumdzieva А. New regulations under decision in EU member state Leonardo da Vinci II pilot project BG/05/B/F/PP Innovative e-learning in reparative medicine (NOVAe-MED) ; Резюме: Курсът предоставя информация за етичния и правен статут относно използването на стволови клетки и тъканно инженерство в Европа. Представени са някои основни и специфични проблеми свързани със социалните измерения на изследванията и приложението на стволови клетки: ползата за общественото здравеопазване и обществената подкрепа за тези изследвания. Обучителният материал разкрива и някои икономически аспекти на научните изследвания и приложение на стволови клетки, с акцент върху водещите фирми на пазара в тази област и настоящите / бъдещи търговски приложения на продуктите от стволови клетки и терапията с тях. Представеният материал е предназначен за продължаващо обучение и повишаване на квалификацията на студенти от колежи и университети; възпитаници на центрове за неформално обучение в областта на общественото здравеопазване; млади специалисти от сектори здравеопазване, обществено здраве, биомедицина. Kujumdzieva A. and Petrova V. (2015) Food science and technology - New/improved approaches development for preserving, processing, packaging, storing, and delivering of foods. LLP ToI Project ES1-LEO Резюме: Курсът е в областта на хранителните технологии, създаден за придобиване на нови зелени компетенции и умения при разработването на подобрени подходи за запазване, преработка, пакетиране, съхранение и предоставяне на храни. Той предлага знания за това как различните материали, използвани в опаковките и дизайна на храните, повлияват характерните свойства на последния и възможните процеси на взаимодействие на опаковката с опакования продукт. Представени са специфичните процеси по опаковане, включително и опаковки за храни, адаптирани към новите технологии и преработки, а така също и активни и интелигентни опаковки на течни и твърди храни. Основните бенефициенти на програмата са учители, ментори и други образователни специалисти, 20

21 които получават възможност да придобият актуални умения и компетентности, съизмеримис нуждите на трудовия пазар. Заключение: Разработените он/оф-лайн учебни помагала, включващи иновативни знания, обобщени чрез системата на съставените от 3 елемента (знания, умения и широки компетенции) обучителни резултати, представляват принос за иновативното развитие на системата на образованието в страната и в частност в Софийски университет. Те са в унисон с непосредсвената цел на СУ, да се превърне в изследователски университет, където иновативните, смесени форми на обучение са предоставени като свободна, достъпна и акредитирана форма за кариерно развитие на широк кръг ползватели. /гл. ас. д-р В. Петрова/ 21