АНТИСЕРУМ SALMONELLA ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЕРОТИПА НА SALMONELLA 1- КЛИНИЧНА СТОЙНОСТ са причинители на остри инфекции, които са много разнообразни поради многото различни серотипове и множеството различни предизвиквани клинични синдроми. Родът включва 2 подвида: S. bongori (20 сероварианта) и S. enterica (2,415 сероварианта). Видът S. enterica се разделя на 6 подвида: - S. enterica subsp. enterica (I или 1) - S. enterica subsp. salamae (II или 2) - S. enterica subsp. arizonae (IIIa или 3a) - S. enterica subsp. diarizonae (IIIb или 3b) - S. enterica subsp. houtenae (IV или 4) - S. enterica subsp. indica (VI или 6). Серовариантите на подвидовете enterica (1,435 сероварианта) представляват 99.5% от изолираните щамове (1). В схемата на Кауфман-Уайт (Kauffmann-White scheme) (1) серовариантите са класифицирани според комбинацията на соматичните антигени (O) и флагеларните (камшичести) антигени (H) на. Тази антигенна формула се определя с помощта на аглутинационни серуми (анти-o и анти-h). Определяне на Група O Серовариантите на Група O, които трябва да се определят първи, бяха обозначавани с букви от азбуката, но след това трябваше да се продължи с цифри. Сега по-логично е всяка Група О да се обозначава чрез характерния O фактор. Еквивалентност между азбучната ация и характерния О фактор Азбучна ация на групата Група O антиген Азбучна ация на групата Група O антиген Азбучна ация на групата Група O антиген A 2 I 16 R 40 B 4 J 17 S 41 C1 C2 C3 6, 7, 8 K 18 T 42 D 9 L 21 U 43 E1 E2 3, 10 M 28 V 44 E4 1, 3, 19 N 30 W 45 F 11 O 35 X 47 G1 G2 13 P 38 Y 48 H 6, 14 Q 39 Z 50 2- ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ Антисеруми (анти-o и анти-h) са предназначени за серологична идентификация на култури от с епидемиологични и диагностични цели при използване на аглутинационния метод на предметно стъкло. 3- ПРИНЦИП Тестът се основава на аглутинация чрез специфични антисеруми (анти-o и анти-h) с бактерии, притежаващи съответните антигени. Тези антисеруми са получени чрез имунизиране на зайци с избрани щамове на. Моновалентните серуми са адсорбирани, за да се увеличи тяхната специфичност. Те са мембранно филтрирани и е добавен натриев азид в концентрация 0.01%.
1. Серуми за аглутинация на предметно стъкло a) O серуми Поливалентни O серуми за насочване при определяне на серотипа Тези поливалентни O серуми не са адсорбирани. Те са предназначени да насочват определянето на серотипа и се препоръчват изключително за откриване на в хранителни продукти и в околната среда. Много големият процент (около 98%) от, открита при човека и топлокръвните животни, съдържа O-антиген, който съответства на аглутинините, съдържащи се в серуми OMA и OMB. O серуми за определяне на антигенната формула Тези серуми са предназначени за идентификация на група O. Те трябва да се използват последователно в логичен ред (поливалентни, след това групово специфични моновалентни, и т.н.), възможно и като функция на конкретни биохимични характеристики (например, серотипове typhi и paratyphi A). Вторичните O фактори се изследват само на по-късен етап. Например: - фактори O:7 и O:8 се тестват, само когато се наблюдава аглутинация със серум O:6, 7, 8. - фактор O:15 се тества, само когато се наблюдава аглутинация със серум O:3, 10, 15. Единствено аглутинация с моновалентни O серуми позволява идентификация на група O. Анти-Vi серум Антигенът Vi е топлинно лабилен повърхностен антиген, който може да маскира соматичната антигенна активност. Той се проявява главно при щамове S. typhi и по-рядко при щамове S. paratyphi C. е, притежаващи този антиген, не се аглутинират със анти-о серуми. Когато един щам не се аглутинира с OMA "смес" или OMB "смес", се препоръчва този щам да се тества с Vi серум. Ако се наблюдава положителна реакция, бактериалната суспенсия трябва да се нагрее до 100 C в продължение на 30 минути, преди да се повтори теста с поливалентни OMA или OMB серуми и съответните моновалентин серуми. б) H серуми H серуми за насочване при определяне на серотипа Подобно на специфичните O серуми, те са изключително полезни, когато трябва да се идентифицират множество различни серотипове (бактериология на храните, бактериология на околната среда). H серуми за определяне на антигенната формула Тези серуми трябва да се използват съгласно същата логика, както и O серумите. Например: - моновалентни серуми H:2, H:5, H:6, H:7 се използват, когато се наблюдава аглутинация с поливалентен серум H1; - моновалентни серуми z10 и z15 се използват, когато се наблюдава аглутинация с поливалентен серум HE, и т.н. 2. Серуми за фазова инверсия Анти-H серуми за фазова инверсия (метод на Свен Гард): Ако бактериалната популация представлява балансирано разпределение на фази 1 и 2 на антиген H, те може да бъдат открити, което позволява идентификация на серовариантите. Ако обаче може да се идентифицира само едната от двете фази на антигена H, специфичността на втората фаза трябва да се определи с помощта на агар за фазова инверсия на Свен Гард с добавяне на капка SG антисерум, който съдържа аглутинина за вече определената фаза. Средата Свен-Гард (каталожен 53431) е достатъчно мек агар, който позволява подвижната, инокулирана в центъра на петрата, да се разпространи по повърхността на средата след инкубация в продължение на една нощ. 2
4- КАК СЕ ДОСТАВЯТ Поливалентните и моновалентните серуми се доставят в 3 мл. флакони с капкомер (60 теста). СЕРУМИ O Поливалентни O серуми за насочване при определяне на серотипа Поливалентни серуми Поливалентен OMA Поливалентен OMB Поливалентен OMС Поливалентен OMD Поливалентен OME Поливалентен OMF Поливалентен OMG Съдържа аглутинини за групи A, B, D, E, L C, F, G, H Съответстващ соматичен O антиген 1, 2,12 + 4, 5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3,19 +21 6, 7 + 6, 8 + 11 + 13, 22 + 13, 23 + 6, 14, 24 + 8, 20 I, J, K, M, N, O, P 16 + 17 + 18 + 28 + 30 + 35 + 38 Католожен 60801 60811 60821 Q, R, S, T, U, V, W 39 + 40 + 41 + 42 + 43 + 44 + 45 60831 X, Y, Z, 51-53 47 + 48 + 50 + 51 + 52 + 53 + 61 60841 54 + 55 + 56 + 57 + 58 + 59 60851 60 + 62 + 63 + 65 + 66 + 67 60861 Моновалентни серуми за определяне на антигенната формула Моновалентни серуми O:1, 2 O:4,5 O:6,7,8 O:7 O:8 O:9 Група Каталожен A 59031 B 59021 C 59062 59081 59091 D 59101 Моновалентни серуми O:3, 10, 15 O:15 O:1, 3, 19 O:11 O:13, 22, 23 O:6, 14, 24 Група Каталожен E1, E2 59112 59127 E4 59131 F 59141 G 59162 59171 Моновалентен Vi (каталожен 60951) СЕРУМИ H Поливалентни серуми за насочване при определяне на серотипа Поливалентни серуми Поливалентен HMA антисерум Поливалентен HMB антисерум Поливалентен HMC антисерум Поливалентен HMD антисерум Поливалентен HMIII антисерум Фактори H на подвид III (Аризона) Съответстващ флагеларен антиген Католожен a + b + c + d + i + z10 + z29 60451 e, h + e, n, x + e, n, z15 +G 60461 k + y + z + L + Z4 + r 60471 z35 + z36 + z38 + z39 + z41 + z42 + z44 + z60 60481 z52 + z53 + z54 + z55 + z57 + z61 60493 3
Поливалентни серуми за определяне на антигенната формула Поливалентни серуми Каталожен Поливалентен H1 H1 = 1,2 +1,5 + 1,6 + 1,7 + z6 60401 Поливалентен HL HL = l, v + l, w + l, z13 + l, z28 + l, z40 60411 Поливалентен HE HE = e, h + e, n, x + e, n, z15 60391 Поливалентен HZ4 HZ4 = z4,z23 + z4,z24 + z4,z32 60431 Поливалентен HG HG = f, g + g, p + g, m, s + g, m + m, t 60441 Моновалентни серуми за определяне на антигенната формула Моновалентни серуми Моновалентен H:a Моновалентен H:b Моновалентен H:c Моновалентен H:d Моновалентен H:g, m Моновалентен H:g, p Моновалентен H:h Моновалентен H:i Моновалентен H:k Моновалентен H:m Моновалентен H:p Каталожен 60111 60121 60131 60141 61121 61122 61119 60161 60171 61117 61118 H:r H:v H:w H:x H:y H:z H: z10 H: z15 H:2 H:5 H:6 H:7 60201 61115 61116 61123 60211 60221 60241 61120 61111 61112 61113 61114 Серуми за фазова инверсия анти-h (метод на Свен Гард) Поливалентни серуми Аглутинини Каталожен Антисерум SG1 a + b+ c+ z10 61011 Антисерум SG2 d + i + e, h 61021 Антисерум SG3 k + y + l, v + l, w + l, z13 + l, z28 61031 Антисерум SG4 r + z 61041 Антисерум SG5 e, n, x + e, n, z15 61051 Антисерум SG6 1, 2 + 1, 5 + 1, 6 + 1, 7 + z6 61061 5- СЪХРАНЕНИЕ Серумите, които се съхраняват при температура +2-8 C в отсъствие на замърсявания, са стабилни до изтичане на срока на годност, отбелязан на опаковката (дори ако са отворени). 6- НЕОБХОДИМ МАТЕРИАЛ, КОЙТО НЕ СЕ ДОСТАВЯ Стъклени предметни стъкла. Пластмасови или платинени уши (йозета) за инокулация. Физиологичен разтвор. 4
7- ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ ПРИ УПОТРЕБА Винаги спазвайте текущите техники и предпазни мерки, свързани със защитата от микробиологични опасности, при манипулиране и изхвърляне на материали и биологични продукти, използвани за аглутинационната реакция. Този серум съдържа < 0.1% натриев азид. Натриевият азид може да взаимодейства с оловото или медта, които се съдържат в материала на канализационните тръби, и да образува експлозивни метални азиди. Когато изхвърляте тези реагенти, изплаквайте обилно с вода, за да избегнете натрупването на азидни отлагания. Не разреждайте реагентите. 8- ПРОЦЕДУРА 1) Серуми за аглутинация на предметно стъкло Определянето на серотипа се извършва след идентификация на видовете на прясна, чиста култура от, изолирана на неселективна агарна среда. Извършете контролен тест на щама, който трябва да се тества, във физиологичен разтвор: Вземете с ухото една доза от културата на. Разтворете тези бактерии в капка физиологичен разтвор като хомогенизирате суспенсията. С физиологичния разтвор не трябва да се наблюдава аглутинация. Ако се наблюдава аглутинация, тя съответства на самоаглутинация на самия щам и с антисерумите не може да се извърши теста. Започнете с тестване на аглутинацията с поливалентни серуми, после със специфични серуми, съответстващи на сместа, която е дала забележима аглутинация (поливалентен О и моновалентен О серум, а после поливалентен Н и моновалентен Н серум). Поставете една капка от антисерума на предметното стъкло. Вземете с ухото една доза от културата на (от най-влажната зона на културата за откриване на антигени Н). Разтворете тези бактерии в капка антисерум, като осигурите хомогенност на суспенсията чрез постепенно прибавяне на бактериите към серума. Разклатете предметното стъкло с леки въртеливи движения. Изследвайте сместа с невъоръжено око върху тъмна повърхност или вдлъбнато огледало. 2) Фазова инверсия Добавете една капка SG серум, съдържащ аглутинин на вече определената фаза, в разтопен агар на Свен Гард, охладен до около 45 C. Разклатете средата с въртеливи движения, за да осигурите хомогенно смесване на серума, а след това го излейте в петра. Ако след втвърдяването на повърхността останат капки кондензирала вода, изсушете агара с полуотворен капак. В центъра на петрата инокулирайте обилно 3 до 4 колонии на e от чиста, прясна култура на агарна среда. Инкубирайте при температура 37 C в продължение на 18 часа (с капак на петрата, насочен нагоре). Потърсете аглутинация с анти-h серуми по периферията на зоната на инвазия на агара (съгласно описаната по-горе процедура). Пример: В, която трябва да се изследва, са открити антигени О:4,5 и H:1,2. За фазова инверсия се използва серум SG6 (1,2 + 1,5 + 1,7 + z6). Наблюдаваната на следващия ден аглутинация с: - анти-h:i серум показва наличие на typhimurium (O : 1, 4, [5], 12 H : i :1,2) - анти-h:b серум показва наличие на paratyphi B (O : 1, 4, [5], 12 H : b :1,2) 9- ИНТЕРПРЕТИРАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ Положителна реакция съответства на появата на аглутинация в рамките на максимум 1 минута. O- аглутинация е фина и правилна, и лесно може да бъде разграничена от всякакви налични лошо емулгирани фрагменти от бактериални колонии. 5
Забележка: Всяка култура на, която може да се аглутинира с О-серум, ще се аглутинира незабавно с един от поливалентните серуми. По-бавна и по-малко интензивна ко-аглутинация може да се наблюдава с един или няколко други серума. Когато един щам не се аглутинира или с OMA "смес" или с OMB "смес", се препоръчва този щам да се тества с Vi серум. S. typhi форма V на може да се аглутинира с О-серум, когато е в жив вид, и придобива способност за О-аглутинация, само след нагряване на суспенсията. Серумите HMA, HMB, HMC и HMD не съдържат О-аглутинини, но в серума HM III има О- аглутинини. Ако дадена култура се аглутинира с такъв серум, истинската същност на Н- аглутинацията може да се потвърди чрез добавяне на 1 капка HMIII серум в 1 мл. от бактериалната суспенсия. Ако щамът съдържа антиген, който съответства на антитялото в този серум, след 2 часа на водна баня с температура 37 C се наблюдава влакнеста аглутинация. Щам, съдържащ фактор H:g, се аглутинира с H:g,m серум, също така и с H:g,p серум. Серумът H1 се използва за откриване на щам с Н антиген в "неспецифична" фаза 2 (1, 2 или 1, 5 или 1, 7). 10- РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ТЕСТА / КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ Активността на поливалентните и моновалентните серуми на се контролира чрез използване на следните положителни щамове: СЕРУМИ O Серум Щам Структура на антигена OMA Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) OMB Newport (O:6,8,20 H:e,h : 1,2 [z67]) OMC Tel Aviv (O:28 H:y : e,n,z15) OMD Champaign (O:39 H:k :1,5) OME Bergen (O: 47, H: i : e,n,z15) OMF Uccle (O: 3,54 H: g,s,t : -) OMG IIIa (Arizona) (O:63 H: g, z51 : -) O:1, 2 Paratyphi A (O:1,2,12 H:a : [1,5]) O:4, 5 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H:i :1,2) O:6, 7, 8 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) O:7 Braenderup (O:6,7,14 H:e,h : e,n,z15) O:8 Blockley (O:6,8 H:k : 1,5) O:9 Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) O:3, 10, 15 London (O:3,10 [15] H:l,v : 1,6) O:15 Strasbourg (O:9,46 H:d : 1,7) O:1, 3, 19 Senftenberg (0:1,3,19 H:g,[s],t : -) O:11 Aberdeen (O:11 H: i : 1,2) O:13, 22, 23 Grumpensis (O:1,13,23 H:d :1,7) O:6, 14, 24 Carrau (O:6,14,[24] H:y :1,7) СЕРУМИ VI Серум Щам Структура на антигена Vi Typhi (0:9,12,[Vi] H:d : -) 6
СЕРУМИ ФАЗОВА ИНВЕРСИЯ Серум Щам Структура на антигена SG 1 Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) SG 2 Newport (O:6,8,20 H:e,h :1,2 [z67]) SG 3 Thompson (O:6,7,14 H:k :1,5) SG 4 Heidelberg (O:1,4,[5],12 H: r : 1,2) SG 5 Abortusequi (O:4,12 H: - : e,n,x) SG 6 Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i :1,2) СЕРУМИ H Серум Щам Структура на антигена HMA Paratyphi A (O:1,2,12H: a : [1,5]) HMB Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) HMC Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) HMD Fresno (O:9,46H: z38 : -) HM III IIIb (Arizona) (O:65 H: c: z53) H1 Bovismorbificans (O:6,8,20 H: r,[i] : 1,5) HL Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) HE Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2) HZ4 Dusseldorf (O:6,8 H: z4, z24 : -) HG Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) a Paratyphi A (O:1,2,12 H: a : [1,5]) b Paratyphi B (O:1,4,[5],12 H: b : 1,2) c Paratyphi C (O:6,7,[Vi] H: c: 1,5) d Livingstone (O:6,7,14 H: d : l,w) g, m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) g, p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) h Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) i Typhimurium (O:1,4,[5],12 H: i : 1,2) k Blockley (O:6,8 H: k : 1,5) m Enteritidis (O:1,9,12 H: g,m : -) p Dublin (O:1,9,12 [Vi] H: g,p : -) r Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) v London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) w Meleagridis (O:3,10 [15][15, 34] H: e,h : l,w) x Abony (O:1,4,[5],12,27 H: b : e,n,x) y Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) z Worthington (O:1,13,23 H: z :l,w) z10 Lexington (O:3,10,[15] [15,34]H: z10 :1,5) z15 Brandenburg (O:1,4,[5],12,27 H:l,v:e,n,z15) 2 Newport (O:6,8,20 H: e,h : 1,2 [z67]) 5 Infantis (O:6,7,14 H: r : 1,5) 6 London (O:3,10 [15] H: l,v : 1,6) 7 Carrau (O:6,14,[24] H: y :1,7) 7
11- КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ НА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ Всички произведени реагенти се приготвят съгласно нашата Система по Качеството, като се започне от получаването на суровините до окончателното пускане на продукта на пазара. Всяка партида се подлага на качествен контрол по оценяване и бива реализирана на пазара само след потвърждаване на предварително одобрените критерии. Записите, свързани с производството и контрола на всяка отделна партида, се съхраняват от Био-Рад. 12- ГРАНИЦИ НА УПОТРЕБА Идентификацията на бактериалните видове трябва да се извършва преди определяне на серотиповете. Само пълното определяне на сертотиповете на антигени O и H позволява сигурна серологична идентификация. 13- НАЙ-ЧЕСТО СРЕЩАНИ СЕРОТИПОВЕ Най-често изолираните серотипове на са enteritidis и typhimurium. Група B (O: 4) O H Група B (O: 4) Abony 1,4,[5],12,27 b e,n,x Agona 1,4,12,27 f,g,s [1,2] Brandenburg 1,4,[5],12,27 l,v e,n,z15 Bredeney 1,4,12,27 l,v 1,7 Coeln 1,4,[5],12 y 1,2 Derby 1,4,[5],12 f,g [1,2] Heidelberg 1,4,[5],12 r 1,2 Indiana 1,4,12 z 1,7 Paratyphi B 1,4,[5],12 b 1,2 Saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2 Schwarzengrund 1,4,12,27 d 1,7 Stanley 1,4,[5],12,27 d 1,2 Typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2 Група E1 - E2 (O: 3, 10-3, 15) Anatum 3,10 [15][15, 34] e,h 1,6 London 3,10 [15] l,v 1,6 Meleagridis 3,10 [15][15, 34] e,h l,w Muenster 3,10 [15][15, 34] e,h 1,5 Groupe E4 (O: 1, 3, 19) Senftenberg 1,3,19 g,[s],t - Група E4 (O: 1, 3, 19) Paratyphi A 1,2,12 a [1,5] 8
Група D1 (O: 9) O H Група D1 (O: 9) Dublin 1,9,12 [Vi] g,p Enteritidis 1,9,12 g,m - Napoli 1,9,12 l,z13 e,n,x Panama 1,9,12 l,v 1,5 Typhi 9,12,[Vi] d - Група C1 (O: 6, 7) Braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15 Infantis 6,7,14 r 1,5 Livingstone 6,7,14 d l,w Mbandaka 6,7,14 z10 e,n,z15 Montevideo 6,7,14 g,m,[p],s [1,2,7] Ohio 6,7,14 b l,w Thompson 6,7,14 k 1,5 Virchow 6,7 r 1,2 Група C2 - C3 (O: 6, 8) Blockley 6,8 k 1,5 Bovismorbificans 6,8,20 r,[i] 1,5 Goldcoast 6,8 r l,w Hadar 6,8 z10 e,n,x Kottbus 6,8 e,h 1,5 Litchfield 6,8 l,v 1,2 Muenchen 6,8 d 1,2 [z67] Newport 6,8,20 e,h 1,2 [z67] Подчертани O фактори (например 1, 4, 12): фактори, чието наличие се свързва с конверсия на бактериофаги. Те присъстват само, когато културите са лизогенизирани чрез съответния конвертиращ фаг. Фактори, показани в скоби (например 9, 12, [Vi]): хромозомно определен фактор, който може да присъства или да липсва, без да се промени класифицирането на серотипа. 14- РЕФЕРЕНЦИИ 1. POPOFF M. Y., LE MINOR L., 1997, Antigenic formulas of the serovars, 7th revision. WHO collaborating Centre for Reference and Research on. Institut Pasteur, Paris, France. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2011/08 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 www.bio-rad.com 9