Immucor GTI Diagnostics, Inc. 20925 Crossroads Circle, Waukesha, WI 53186 САЩ Tel: +1 (855) 466-8267 WWW.IMMUCOR.COM Документацията и преводите за продукта са на разположение на: www.immucor.com LIFECODES SSO КИТ за ТИПИЗИРАНЕ на HLА-нулев алел За ин витро диагностика СЪДЪРЖАНИЕ Определения на символите..... 1 Инструкции за употреба..... 4 Китове/реактиви по каталожен номер. 2 A. Пречистване на геномна ДНК. 4 Предназначение.. 2 Б. Амплификация... 4 Резюме и обяснение... 2 В. Хибридизация. 5 Принципи на процедурата 2 Г. Анализ на проба с апарат Luminex.. 6 Реактиви. 3 Резултати 6 A. Идентифициране. 3 Качествен контрол... 7 Б. Предупреждения и предпазни мерки... 3 Ограничения на процедурата... 7 В. Инструкции за съхранение. 3 Отстраняване на проблеми... 8 Г. Пречистване или обработка Очаквани стойности. 8 за употреба. 3 Д. Показания за нестабилност.. 3 Специфични работни характеристики. 8 Изисквания към апарата.. 3 Литература. 8 Вземане и подготовка на проби. 3 Ограничени лицензи... 8 Процедура.. 3 Използвани търговски марки... 9 A. Доставяни материали.. 3 Приложение A 9 Б. Необходими, но не доставяни материали, реактиви и оборудване.. 3 В. Допълнителни материали за осигуряване от потребителя... 3 Гел електрофореза. 9 Интерпретация на гела.. 9 ОПРЕДЕЛЕНИЯ НА СИМВОЛИТЕ (Етикети на продуктите и допълнителни документи) Код на партидата Използвайте по дата Предупреждение - вижте указанията за употреба Опасно Л И С Т О В К А С У К А З А Н И Я Каталожен номер Да се съхранява далеч от светлина Консултирайте се с инструкциите за употреба Температурни ограничения Достатъчен за N тестове Производител Горна граница на температурата Да не се замразява Упълномощен представител в Европейската общност Страница 1 от 9 LC1437CEBG Rev. G
РЕАКТИВИ ПО КАТАЛОЖЕН НОМЕР LCT -N LIFECODES SSO кит за типизиране на HLA-нулев алел, Продукт 628939 LC-N LIFECODES HLA кит за типизиране на нулев алел за използване с Luminex Продукт 629100-50 Номер на Обем за Реактив Съхранение продукта напълване 50 LIFECODES мастер микс за MX-N1 нулев алел клас 1 629001 870 µl от 2 до 8 C MX-N2 BM-N LIFECODES мастер микс за нулев алел клас 2 629002 870 µl от 2 до 8 C LIFECODES микс за сонди за нулев алел 629003 810 µl x 2 от 2 до 8 C Да се пази от светлина DS Разтвор за разреждане 628515 19,7 ml от 18 до 30ºC Достатъчен за 50 теста TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl x 2-10ºC to -30ºC Миксовете за сонди са чувствителни към светлина: подлагайте ги на минимално въздействие на светлина ВНИМАНИЕ: Не използвайте компонентите след изтичане на сроковете им на годност. ВНИМАНИЕ: Отклонения от препоръчителните протокол и необходими материали, в т.ч. LIFECODES Taq полимераза не са били одобрени. ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ За ДНК типизиране на Клас І и Клас ІІ алели заедно с LIFECODES HLA SSO китове за типизиране. РЕЗЮМЕ И ОБЯСНЕНИЕ ДНК-базираното HLA тизипизиране с използване на амплифицирана с полимеразна верижна реакция (PCR) ДНК е обичайна лабораторна процедура. PCR амплификация на ДНК се използва като средство за обогатяване на избран ДНК регион. За HLA типизиране се използва последващ количествен анализ, за да се определят свойствата на амплифицираната ДНК. За HLA типизирането са използвани редица видове количествени анализи, като SSP (1), пряк SSOP (2), RFLP (3) и обратни SSOP dot blot технологии (4). Подобно на SSOP и обратните dot blot методи, китовете за типизиране LIFECODES HLA-SSO използват секвентно-специфични олигонуклеотиди (SSOs), за да идентифицират кои HLA алели са налични в PCR амплифицирана проба. Това е набор от използвани SSOs, а не методологии, които определят способността за разграничаване на различните налични алели в PCR амплификацията. Докато методите обратен dot blot и SSOP използват ензимни маркери и колориметрични субстрати, които изискват последващо проявяване, количественият анализ LIFECODES е хомогенна мултиплексна система. Това означава, че всички SSOs се анализират едновременно и целият количествен анализ се извършва в един реакционен съд с добавянето на един единствен реактив. ПРИНЦИПИ НА ПРОЦЕДУРАТА Процедурата LIFECODES HLA-SSO типизиране е базирана на хибридизацията на маркиран едноверижен PCR продукт за SSO сонди. Амплификацията на ДНК чрез PCR типично използва еквимоларни количества и прав и обратен праймер, за да генерира двуверижен ДНК продукт. Все пак, ако количеството на единия праймер е в излишък спрямо другия, реакцията ще генерира известно количество едноверижен ДНК продукт в допълнение към двойноверижния продукт. По време на първоначалните цикли на етапа на LIFECODES амплификацията се генерира двуверижна ДНК. Щом се изчерпи лимитиращия праймер, оставащият праймер използва двойноверижния продукт като шаблон за генериране на едноверижна ДНК. Този метод генерира както двойноверижен, така и едноверижен продукти, които при денатурация ще участват в реакцията за хибридизация. Всяка от различните сонди може да бъде хомоложна на секвенция в рамките на амплифицирана ДНК, която е уникална за алела или група алели. С други думи, тези сонди са проектирани така, че всяка сонда преференциално хибридизира към комплементарен регион, който може да е представен или не в амплифицираната ДНК. В допълнение, амплифицираната ДНК също е хибридизирана към една или повече консесусни сонди, хомоложни на наличните секвенции във всички алели на локуса. SSO типизирането може да бъде повлияно от вида на биологичния материал, метода на пречистване, количеството и целостта на геномната ДНК. Следователно, сигналът, получен за консенсусна(и) сонда(и), може да служи като индикатор за успеха на процедурите за амплификация и хибридизация. Също така, сигналът, получен с консенсусна сонда, може да бъде използван за нормализиране на сигнала от специфични за алелите сонди и за неутрализиране на вариации в количеството на амплифицирания продукт при реакцията за хибридизация. Анализът на резултатите, генерирани от SSO типизирането, може да бъде използван за определяне на присъствието или отсъствието на специфични ДНК секвенции и да идентифицира възможните алели в пробата. За процедурата на LIFECODES HLA-SSO типизиране, сондите се прикрепват към Luminex микросфери, предназначени за използване с апарата Luminex. До 100 различни популации на Luminex микросфери могат да бъдат миксирани заедно и анализирани с апарата Luminex, защото всяка популация от микросфери може да бъде различена чрез своята уникална флуоресцентна сигнатура или цвят. Към всяка оцветена микросфера може да бъде прикачена различна SSO сонда. Ето защо, комбинираните различни сонди могат да бъдат разграничени една от друга въз основа на тяхната връзка със специфични оцветени микросфери. Апаратът Luminex е в състояние да определи относителното количество маркиран PCR продукт, хибридизиран към всяка Luminex микросфера. Следователно, относителният сигнал, получен със SSO сондите при количественият LIFECODES анализ, както и при други SSOP методи, може да бъде използван за задаване на положителна или отрицателна реактивност на сондите с амплифицираната ДНК проба (вижте раздела Резултати). Това, от своя страна, осигурява необходимата информация за определяне на HLA фенотипа на пробата. Нула 1 се използва като допълнителен количествен анализ за увеличаване на резолюцията на количествените анализи LIFECODES HLA-A, HLA-B, HLA-C, решавайки по този начин неопределеността на алели между A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N и C*04:01/04:09N. Нула 2 се използва като допълнителен количествен анализ за увеличаване на резолюцията на количествените анализи LIFECODES HLA-DRB3,4,5, решавайки по този начин неопределеността на алели между DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N и DRB5*01:02/DRB5*01:08N. Обединяването на информацията от количествените анализи Нула 1 или 2 със съответните локус-специфични резултати от количествения анализ с LIFECODES SSO кит за типизиране за генериране на предполагаемо типизиране на проба може да бъде извършено чрез ръчен или софтуерен анализ. При ръчен анализ, резултатът от количествените анализи Нула 1 или 2 определя наличието или липсата на специфични нулеви алели. Резултатът от съответните локус-специфични LIFECODES SSO китове за типизиране може да съдържа неопределености, включващи тези нулеви алели (напр. A*24:02/24:09N, B*51:01/51:11N, C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N или DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Ако нулевият алел е определен с нулев продукт, всички алелни комбинации, които не включват нулевия алел, могат да бъдат елиминирани от резултатите, получени от Страница 2 от 9 LC1437CEBG Rev. G
съответния локус-специфичен LIFECODES SSO кит за типизиране. Ако нулевият алел липсва в резултата за нулевия продукт, всички алелни комбинации, които включват нулевия алел, могат да бъдат елиминирани от резултатите, получени от съответния локус-специфичен LIFECODES SSO кит за типизиране. Този процес на комбиниране на резултатите от два продукта се описва като обединяване на резултатите в листовката на продукта и в софтуера. РЕАКТИВИ А. Идентифициране Вижте таблиците в раздела Реактиви по каталожен номер за пълния списък на каталожните номера. Б. Предупреждения и предпазни мерки 1. За ин витро диагностика. 2. За предварителните и последващите PCR манипулации трябва да се използват отделни пипети. 3. Биологична опасност: всички биологични и кръвни проби трябва да бъдат третирани като потенциално инфекциозни. Използвайте универсалните предпазни мерки при манипулации. 4. Разтворът за разреждане, миксовете за сонди, TAQ полимеразата и R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин съдържат опасни съединения. Избягвайте контакт с кожата и очите и изхвърлете всички материали след употреба в съответствие с местните разпоредби. Вижте Информационните листове за безопасност за допълнителна информация. В. Инструкции за съхранение 5. Вижте етикета на опаковката на компонента на кита за подходящите температури на съхранение. 6. Миксовете за сонди и R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин са чувствителни към светлина, ПАЗЕТЕ ОТ СВЕТЛИНА; НЕ ЗАМРАЗЯВАЙТЕ. 7. Не използвайте компоненти след изтичане на срока им на годност. Г. Пречистване или обработка, необходими за употреба Вижте "Вземане и подготовка на проби" Д. Показания за нестабилност 8. Ако по време на транспортиране или съхранение са се утаили соли от разтвора, разтворете го напълно отново преди употреба чрез разбъркване при стайна температура (от 18 до 30 C). 9. Не използвайте R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин, който е бил замразен по време на транспортиране или съхранение. ИЗИСКВАНИЯ КЪМ АПАРАТА 1. Апарат Luminex и XY платформа (Продуктов 888300, 888302) 2. Били са одобрени следните термоциклери: 96-ямкова GeneAmp PCR система 9700 с настройка за режим MAX (основен кат. N8050200, Gold Block кат. 4314878), Veriti 96-ямков термоциклер с настройка за режим 9700 MAX (кат. 4375786). Вижте в Таблица 2 минималните линейни скорости. Внимание: други термоциклери и линейни скорости не са били одобрени. ВЗЕМАНЕ И ПОДГОТОВКА НА ПРОБИ А. Човешка ДНК може да бъде пречистена от цяла кръв, левкоцитен слой и букална намазка, като се използва утвърден метод, който покрива по-долните критерии. ДНК, извлечена от кръв, консервирана в EDTA и ACD (лимонено-кисела декстроза), е била тествана и е показала, че действа в този количествен анализ. Б. ДНК, извлечена от кръв, консервирана в хепарин, не може да бъде използвана за този анализ. Други консерванти не са тествани. В. Изолираната ДНК трябва да бъде в 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 или във вода без нуклеаза. Ако е налице хелатиращ агент, като например EDTA, крайната концентрация на хелатиращия агент не трябва да надвишава 0,5 mm. Г. Наличието на алкохол, почистващи препарати или соли може да повлияе неблагоприятно върху амплификацията на ДНК. Д. Крайната концентрация на ДНК трябва да бъде от 10 до 200 ng/µl. Е. Измерванията на абсорбцията на ДНК пробата при 260 и 280nm трябва да покажат съотношение от 1,65 до 2,0. Ж. ДНК може да се използва незабавно след изолация или да се съхранява до 1 година при -20ºC. Повторното замразяване/размразяване трябва да се избягва, тъй като може да доведе до деградация на ДНК. ПРОЦЕДУРА Внимание: Отклонения от препоръчителните протокол и необходими материали не са били одобрени. A. Доставяни материали (Вижте таблиците в раздел Китове/Реактиви по каталожен номер за конкретна информация) Подходящ мастер микс (MX) Подходящ микс за сонди (BM) Разтвор за разреждане (DS) Б. Необходими, но не доставяни материали За одобряването на кита бяха използвани следните материали: Luminex проточна течност (1x Lifecodes кат. 628005) Вода без нуклеаза (Lifecodes кат. 757003; 20mL) PCR епруветки и капачки - Corning Thermowell ленти за епруветки за (Costar кат. 6542, LIFECODES кат. 888640) или Axygen 8-Strip PCR Епруветки (Axygen кат. PCR0208CPC) или Applied Biosystems MicroAmp 8- Епруветки Strip И MicroAmp 8-Cap Strip (ABI кат. N8010580 И N8010535) или Corning Thermowell PCR 96 ямкови плаки (кат. CLS6551) или Themoscientific AB Gene Superplate 96-ямкова PCR плака (кат. AB-2100) В. Допълнителни материали за осигуряване от потребителя Вортекс миксер Силиконов компресионен слой. Axygen Scientific CM-FLAT или еквивалентен Таблица на праговете, диаграма(и) на попаденията на сондата LIFECODES Tag полимераза (LIFECODES кат. 628075) x 2 Costar плака (Costar кат. 6509, LIFECODES кат. 888630) Прозрачна полиетиленова лента за Thermowell (Costar 6524 (LIFECODES кат. 888635 ) R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин (SA-PE), 1mg/mL (LIFECODES кат. 628511) Luminex китове за калибриране (Luminex 100/200 кит за калибриране, Luminex 100/200 кит за валидиране на работата, LIFECODES кат. 628018 и 628019 съответно) Соникатор за вана Страница 3 от 9 LC1437CEBG Rev. G
Накрайници за бариерен филтър на микроцентрофуга Пипетори, многоканални пипетори и накрайници (1-20µL, 20-200µL, 1000µL) Софтуер за анализ на електронни таблици Термоблок 70% изопропанол или 20% обезцветител Фиксираща тава - Applied Biosystems 403081 (за употреба само с термоциклер 9700) ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА ЗАБЕЛЕЖКИ: Миксовете за сонди и SA-PE са светочувствителни: да се пазят от светлина и да не се замразяват. Затоплете сферите от 55º до 60ºC в продължение на поне 5-10 минути, за да направите разтворими компонентите на сместа в сондата. Диспергирайте за кратко с ултразвук (~15 сек.), а след това разбъркайте с вортекс миксер сместа за сонди за около 15 секунди, за да суспендирате напълно сферите. Обърнете специално внимание при разпределянето на аликвоти, като използвате калибрирани пипети. Неспазването на това може да доведе до загуба на реактив и провал на пробата. Всички температури трябва да бъдат поддържани точно. Флуктуации дори в рамките на +/- 0,5 C могат да повлияят на резултатите. По време на етапа на хибридизация пробите не трябва да остават в разредено състояние при 56 C за повече от 5 мин. (вижте раздел Резултати). Препоръчително е амплифицираните проби да се анализират възможно най-скоро. Ако пробите на могат да бъдат обработени с апарата Luminex същия ден, амплифицираният продукт може да бъде съхраняван до 3 дена при 2-8ºC преди употреба. За по-продължителен период, съхранявайте при -20ºC до една седмица, докато сте готови за анализиране. Амплифицираният продукт може да бъде замразен и размразен еднократно. Повторното замразяване и размразяване ще доведе до влошаване на амплифицираните проби и лоши резултати, ако се подложи на количествен анализ. A. Пречистете геномна ДНК, като използвате метод по избор; крайната концентрация трябва да бъде от 10 до 200 ng/µl. Регулирайте, ако е необходимо, с вода без нуклеаза. Поддържайте сходни концентрации за всички проби. Б. ДНК амплификация (PCR) 1. Оставете мастер микса да се загрее до стайна температура (от 18 до 30 C). 2. Внимателно разбъркайте с вортекс миксер за около 10 секунди. Това ще гарантира присъствието на солите в разтвора. Центрофугирайте за кратко (от 5 до 10 секунди) в микроцентрофуга, за да стигне съдържанието до дъното на епруветката. 3. Като използвате Таблица 1 по-долу, подгответе компонентите за амплификация на n+1 реакции, като използвате посоченото количество от всеки компонент за реакция (с изключение на ДНК). Доведете до краен обем от 20µL за реакция с вода без нуклеаза. Внимателно разбъркайте с вортекс миксер. 4. Дозирайте с пипета подходящото количество геномна ДНК (от 40 до 120ng) в PCR епруветки. 5. Разпределете на аликвотни части амплифицираният микс в PCR епруветки, съдържащи геномна ДНК. (Общият обем на микс за амплификация и геномна ДНК трябва да бъде равен на 20µL за всяка реакция на проба.) 6. Затворете плътно капачетата на епруветките, за да предотвратите изпаряване по време на PCR. 7. Поставете пробите в термоциклера и изпълнете програмата, вижте Таблица 2 и Таблица 3. Таблица 1. Компоненти на реакция за амплификация Компонент Количество за PCR реакция на проба LIFECODES мастер микс 6µL Геномна ДНК 10-200ng/µL Общо ~80ng Taq полимераза 0,2µL (1U) Вода без нуклеаза До 20µL краен обем Таблица 2. Условия за амплификация на термоциклера Термоциклер GeneAmp PCR System 9700 Veriti 96-ямков термоциклер Режим (линейна скорост) режимmax (3,9 C/секунда) режим 9700 MAX (3,9 C/секунда) Страница 4 от 9 LC1437CEBG Rev. G
Таблица 3. Условия в термоциклера за амплификация Стъпка Температура и време на инкубация Брой цикли 1 95º C за 3 минути 1 2 3 95º C за 15 секунди 60º C за 30 секунди 72º C за 30 секунди 95º C за 10 секунди 63º C за 30 секунди 72º C за 30 секунди 4 72º C за 2 минути 1 5 4º C постоянно 1 12 28 Забележка: За да сте сигурни в амплификацията на пробата, вижте за справка Гел електрофореза на продукт (Приложение А). B. Хибридизация Уверете се, че компонентите на буфера за хибридизация на LIFECODES микс за сонди са разтворими и че сферите са напълно суспендирани. Включете апарата Luminex и XY платформата за 30 минутно загряване. 1. Загрейте микса за сонди от 55ºC до 60ºC в термоблок за поне 5-10 минути, за да направите разтворими компонентите на сместа в сондата. 2. Диспергирайте за кратко с ултразвук (~15 сек.), а след това разбъркайте с вортекс миксер сместа за сонди за около 15 секунди, за да суспендирате напълно сферите. 3. Смесете 15 µl от съответния микс за сонди с 5 µl локус специфичен PCR продукт във всяка една ямка на термоциклер с 96-ямкова плака (Costar 6509). Когато разпределяте аликвотни части от микса за сонди в повече от 10 ямки, леко разбърквайте с вортекс миксер микса за сонди след всеки десет ямки. Затворете херметично с полиетиленова лента (Costar 6524). 4. Поставете отгоре върху плаката силиконов компресионен слой преди хибридизация. 5. Хибридизирайте пробите при следните инкубационни условия: Таблица 4. Условия в термоциклера за хибридизация 97ºC за 2 минути 47ºC за 10 минути 56ºC за 8 минути 56 ºC ЗАДЪРЖАНЕ Убедете се, че детекторният лазер на инструмента Luminex е бил включен поне 30 минути преди края на хибридизацията. 6. Докато пробите се хибридизират, подгответе 1:200 SA-PE смес/разтвор за разреждане. Комбинирайте 170µL разтвор за разреждане (DS) и 0,85 µl 1mg/mL SA-PE за проба. Препоръчва се да приготвите достатъчно разтвор за разреждане за n+1 проби, за да се отчете загубата при дозиране с пипета. (вижте Таблица 5) 7. Пазете разтвора за разреждане/ SA-PE сместа на тъмно, при стайна температура; SA-PE е чувствителен на светлина! Разтворът за разреждане може да бъде нагрят до 45ºC за 5 минути и разбъркан с вортекс миксер, за да се гарантира, че всички компоненти са в разтвора. Разтворът за разреждане трябва да е със стайна температура (от 18 до 30 C) преди да приготвите сместа. Пригответе преди употреба и изхвърлете останалата част. Таблица 5. Подготовка на обеми от разтвора за разреждане Бр. проби Разтвор за SA-PE разреждане (DS) 1 170µL 0,85µL 5 850µL 4,25µL 10 1700µL 8,5µL 20 3400µL 17µL 50 8500µL 42,5µL Страница 5 от 9 LC1437CEBG Rev. G
Забележка: НЕ ОТМЕНЯЙТЕ ПРОГРАМАТА ЗА ХИБРИДИЗАЦИЯ ПРЕДИ ДА ИЗВАДИТЕ ТАБЛАТА ОТ ТЕРМОЦИКЛЕРА! При задържане при 56ºC, докато таблата е в термоциклера, разредете всяка проба със 170µL от приготвения разтвор за разреждане/ SA-PE смес. Много е важно да се разредят всички проби в рамките на 5 минути (след стъпката от 8 минути задържане при 56 C). Извадете таблата с проби от термоциклера и я поставете в апарата Luminex. Г. Анализ на проба с апарат Luminex* За най-добри резултати, анализирайте пробите незабавно, като използвате апарата Luminex 1. Включете апарата Luminex между 30 минути и 4 часа преди анализиране на пробите. 2. Преди анализиране на пробите с апарата Luminex, настройте партидна обработка, с която ще бъдат анализирани пробите. а) Изберете Create a New Batch (Създаване на нова партида) от менюто File (Файл). Например, ако анализирате за нулев клас І, добавете партида за нулев клас І Шаблонът за партида се предоставя в уебсайта и се нарича, в този случай, Нула1 хххххх( на партида). Моля, обърнете внимание, че версиите на шаблона са специфични за партидни номера и съответстват на партидните номера на микса за сонди. Следвайте стъпка по стъпка инструкциите, които се появяват на екрана за създаване на партиди. Когато давате име на партидата, не включвайте запетаи в името, защото информацията след запетаята ще се загуби при експортиране на данните. За по-нататъшни инструкции относно създаването на партиди или многобройни партиди, вижте ръководството за потребителя на Luminex б) Щракнете върху иконата за изваждане, за да извадите носача на плаки. Поставете 96-ямковата плака на термоциклера, съдържаща пробите, в XYP термоблока, който се намира върху носача на плаки. в) Щракнете върху иконата Retract (Прибирам). Пробите сега са готови да бъдат анализирани. Първата стъпка трябва да бъде изпълнена преди да стартирате изпълнението. г) След преминаване на пробите през апарата, трябва да се пусне цикъл за почистване с 70% изопропанол или 20% домашна белина, последван от два цикъла на миене. В този момент апаратът може да бъде изключен, ако няма да се използва през остатъка от деня. 3. След приключване на обработката на партидата, данните се експортират като файл с разделени със запетая стойности (csv). Тези файлове получават имена OUTPUT.CSV и се записват в папка с името на партидата. След това тези данни са достъпни за извършване на задачи за типизиране, както е описано по-долу. *За експлоатацията на апарата се обърнете към Ръководството на потребителя на Luminex, включително относно процедурите за ежедневно стартиране, калибриране, поддръжка и изключване. РЕЗУЛТАТИ Типизирането на проба може да се направи както следва: Генерираният CSV файл може да бъде отворен и данните обработени с общи програми за електронна таблица, като Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro или аналогичен софтуер. Анализът се състои от следните стъпки: 1) Уверете се, че броят на събитията за всяко SSO във всяка проба е най-малко 60. Тази информация се намира в раздела DataType: Count на CSV файла. 2) Установете, че стойностите за консенсусните сонди за всяка проба са над техните минимални медиани на интензитет на флуоресцентно излъчване (Median Fluorescent Intensity) или MFI. Минималните прагове са специфични за партида и могат да бъдат намерени в Таблицата за праговете. Внимание: За да получите надеждни резултати, трябва да има достатъчно данни, събрани с апарата Luminex. Съберете най-малко 60 събития за всяко SSO. 3) Извадете стойността на Background Control (контрол на фона) за всяка сонда от стойностите на пробата, за да изведете коригиран набор от данни. Стойностите на Background Control (контрол на фона) се намират в Таблицата на праговете и са специфични за партида. Фоновите стойности са средните MFI стойности за всяка сфера, за да компенсират фоновия шум, дължащ се на вариациите на сферите. 4) За всяка проба, разделете коригираните с фона данни за всяка сонда на коригираните с фона стойности за консенсусната сонда, за да получите нормализиран набор от данни. MFI (сонда) MFI (контролен празен за сонда) MFI (консенсусен) MFI (контролен празен за консенсусен) 5) За всяка сонда запишете нормализираната стойност в Работната таблица за праговете. 6) След като всички стойности са определени, структурата на попаденията на сондата (т.е. комбинацията на всички положителни и отрицателни присвоявания за дадена проба) могат да бъдат сравнени с предоставената в уебсайта диаграма за попаденията на сондата (LC1024). Внимание: Има отделна таблица на праговете за всеки локус. Страница 6 от 9 LC1437CEBG Rev. G
Тези таблици на праговете са специфични за партида; уверете се, че партидния номер в таблиците на праговете отговаря на партидния номер на кита за типизиране. Ако нормализираната стойност за определена проба попада над максималния праг за отрицателно присвояване и под минималната стойност за положително присвояване, пробата трябва да бъде разглеждана като неопределена за тази сонда. Пробата трябва да бъде типизирана, като се допусне първо, че стойността е отрицателна и след това отново, допускайки че стойността е положителна. Вижте раздела ОЧАКВАНИ СТОЙНОСТИ за допълнителна информация относно праговите стойности. КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ Препоръчва се да изпълните един положителен и един отрицателен контрол с всеки тест, като например, чиста вода и предварително типизирана проба съответно. Консенсусни SSO сонди, описани в Таблицата на праговете, хибридизират съответните им локус специфични алели. Стойностите, получени с консенсусни SSOs от положителен контрол, трябва да надвишават праговата стойност за SSO, предвидена в Работния лист на таблицата на праговете. LIFECODES миксът(овете) за сонди съдържа една или повече консенсусни SSO сонди, определени в работните листове на типизиращите китове. Тези консенсусни сонди хибридизират всички алели и действат като вътрешен контрол, за да се провери амплификацията и да се потвърди, че хибридизацията е настъпила. Ако не се получи минималната стойност за тези SSOs, пробата може да не покаже правилна типизация и пробният тест трябва да бъде повторен. Анализът трябва да се изпълни така, както се препоръчва в листовката, както и да се изпълни заедно снякоя друга процедура за контрол на качеството, която е в съответствие с изискванията на местните, щатските, федералните и/или акредитационните агенции. ОГРАНИЧЕНИЯ НА ПРОЦЕДУРАТА Описаните PCR условия и условия на анализ изискват точно контролирани условия. Отклонения от тези параметри могат да доведат до повреда на продукта. Всички апарати трябва да бъдат калибрирани в съответствие с препоръките на производителя и да се експлоатират в рамките на предписаните от производителя параметри. 1) Сферите трябва да бъдат предварително затоплени и добре суспендирани преди употреба. Това гарантира наличието на хибридизационните буферни компоненти в разтвора. 2) Инкубациите при 47ºC и 56ºC изискват висока степен на точност (+/- 0,5ºC). Термоциклерът трябва да бъде използван. Температурата в ямките на 96-ямковата плака на термоциклера трябва да бъде проверена с помощта на термодвойка (например Bio-Rad, модел VPT- 0300 или еквивалентен). Температурата в ямките и между ямките не трябва да варира с повече от +/- 0,5ºC. 3) Времето при 56ºC е критично и не трябва да надвишава общо 13 минути. Това включва 8-минутна инкубация плюс не повече от 5 минути за разреждане на всички проби с разтвор за разреждане/ SA-PE смес. 4) Веднъж разредена, пробата трябва да бъде анализирана в рамките на 1 час (да се пази от светлина). 5) Не смесвайте компоненти от други китове и партиди. Поради комплексния характер на HLA типизацията, квалифициран персонал трябва да прегледа интерпретацията на данните и задачите за типизиране. Страница 7 от 9 LC1437CEBG Rev. G
ОТСТРАНЯВАНЕ НА ПРОБЛЕМИ ПРОБЛЕМ ВЪЗМОЖНА ПРИЧИНА РАЗТВОР Малък брой Миксът за сонди не е добре суспендиран Подгрейте, диспергирайте с ултразвук и сфери разбъркайте с вортекс микса за сонди и повторете CON прагов отказ Многократни SSO откази или пробата не може да даде резултат за HLA типизиране Апарата не функционира правилно Пробата не успява да се апмплифицира или се амплифицира лошо Нарушена калибровка Пътят на движение на пробата е блокиран Ниска ДНК Солите в мастер микса са извън разтвора Лоша Taq полимераза Условията за амплификация не са в рамките на определените параметри Ниска медиана на интензитет на флуоресцентното излъчване (MFI) Специфична амплификация на алели ДНК пробата е замърсена ДНК е частично деградирала Условията за амплификация не са в рамките на определените параметри Изпарения по време на стъпката хибридизация * PCR амплификацията може да бъде проверена чрез гел елекрофореза (вижте Приложение A). анализа. Калибрирайте апарата. (вижте Ръководството за експлоатация на Luminex IS.) Свалете и обработете с ултразвук иглата. Промийте с обратен поток. Обадете се на Immucor GTI Diagnostics, Inc., ако проблемът остава. +1 (855) 466-8267 Проверете концентрацията на ДНК и пречистете. Загрейте мастер микса до 37ºC за 5 минути, разбъркайте леко с вортекс и спрете въртенето за кратко време. Използвайте одобрената LIFECODES Taq полимераза, каталожен 628075. Стартирайте температурния профил на термоциклера, за да проверите дали параметрите са в рамките на определените стойности. Затоплете разтвора за разреждане до 45ºC за 5 минути преди употреба и разбъркайте с вортекс. Съхранявайте при стайна температура. Заменете R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин. Стартирайте температурния профил на термоциклера, за да проверите дали параметрите са в рамките на определените стойности. Изолирайте отново ДНК от кръвна проба. Ако не използвате цялата плака, оставете един празен ред от всяка страна на анализираните проби, за да позволите плътно затваряне на плаката. ОЧАКВАНИ СТОЙНОСТИ Всеки локус има една CON сонда и две SSO сонди. Ако проба съдържа един от анализираните локуси, консенсусната сонда и поне една от SSO сондите за този локус трябва да са положителни. Стойностите на сондите обикновено могат да бъдат определени като положителни и отрицателни. В някои редки случаи стойността може да попадне в диапазона между критичните за положителни или отрицателни стойности и, следователно, да се разглежда като неопределена. Ако пробата съдържа неопределени стойности за определена SSO сонда, пробата трябва да бъде типизирана със сондата като отрицателна и отново със сондата като положителна. Ако двете SSO сонди за локус са неопределени, пробата не може да бъде типизирана и трябва да се извърши повторен анализ. Както е отбелязано в раздела Ограничения на процедурата, това е много важно за точното следване на протокола. Всяко отклонение може да доведе до провал на типизацията на пробата. СПЕЦИФИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПРОИЗВОДИТЕЛНОСТТА Когато се използват LIFECODES HLA SSO китове за типизиране на нулев алел в съответствие с описаната в листовката процедура, могат да бъдат определени Клас 1 и Клас ІІ HLA тип на ДНК проби. Анализът HLA нулев алел Клас І (Нула1) показва 100% съответствие (97,4% долна граница от 95% доверителен интервал) за А локус, 100% съответствие (97,4% долна граница от 95% доверителен интервал) за В локус и 100% съответствие (97,4% долна граница от 95% доверителен интервал) за С локус за 139 оценени проби, когато се сравнява с резултатите, получени с двупосочно секвениране. Анализът HLA нулев алел Клас 2 (Нула2) показва 97,1% съответствие (92,7% долна граница от 95% доверителен интервал) за DRB 4 локус и 98,5% съответствие (94,8% долна граница от 95% доверителен интервал) за DRB 5 локус за 137 оценени проби, когато се сравнява с резултатите, получени с двупосочно секвениране.. ЛИТЕРАТУРА 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163 3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 ОГРАНИЧЕНИ ЛИЦЕНЗИ Tag полимеразата се произвежда от Promega Corp. за компанията Immucor GTI Diagnostics. Лицензът принадлежи на Promega съгласно патенти на САЩ 5,338,671 и 5,587,287 и съответстващите им чуждестранни патенти. Закупуването на този продукт включва ограничен, непрехвърляем лиценз съгласно патент на САЩ 5,981,180 или неговите чуждестранни аналози, собственост на Luminex Corporation, за извършване на мултиплексен анализ на клинични проби за HLA типизиране. Упълномощен представител: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32, 63303 Dreieich, Germany Страница 8 от 9 LC1437CEBG Rev. G
Европейска техническа служба: тел.: +32/3 385 4791 Последна редакция и публикуване на документа: 2019-05-30 ИЗПОЛЗВАНИ ТЪРГОВСКИ МАРКИ AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. ПРИЛОЖЕНИЕ А Гел електрофореза PCR реакциите, изпълнени в LIFECODES HLA-SSO китовете за типизиране, са предназначени за производство на двуверижни и едноверижни продукти, които са преобладаващите продукти, които хибридизират към SSOs. За осигуряване на качеството или за отстраняване на проблеми при експеримент, възможно е да се наложи провеждане на гел електрофореза, за да се изследва присъствието на амплифицирана ДНК в PCR реакцията. Необходими материали (както са изброени или еквивалентни) Агароза за електрофореза (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose 50170) Апарат за електрофореза/ захранване 1X гел буфер (40xTAE, Promega V4281) GelStar гелов оцветител на нуклеинова киселина (Lonza Group, Ltd. 50535) УВ трансилюминатор (ChromatoVUE, UVP Inc. модел TM36) Система за фотографска визуализация Относителната миграция на едноверижен продукт зависи от концентрацията на гела и използваната буферна система. Приблизителни миграции за всяка амплификация са описани по-долу за проби, анализирани в 2% агарозни гелове в буфер 1X TAE. Условия за електрофореза 1. Извадете GelStar оцветителя за нуклеинова киселина (Lonza Group, Ltd. 50535) от фризера, за да се размрази. Съхранявайте на тъмно. 2. Гелът, използван за тази процедура трябва да бъде 2%, т.е. за 200ml носител на гела се използват 4 г агароза за 200mL 1X TAE (разреден от 40X TAE). Добавете 10µL GelStar оцветител за нуклеинова киселина към разтопената агароза. Когато изливате гела, уверете се, че оставяте достатъчно място за ДНК (от 1 до 2 инча), за да може да мигрира. БЪДЕТЕ ВНИМАТЕЛНИ: GelStar е потенциален канцероген. ЗАБЕЛЕЖКА: Възможно е да се използват гелове с 20µL от 10mg/mL етидиев бромид вместо GelStar Nucleic Acid Stain. Лентата на интензивността на продукта ще бъде по-малка в гелове, съдържащи етидиев бромид, отколкото в гелове, съдържащи GelStar. БЪДЕТЕ ВНИМАТЕЛНИ: етидиев бромид (Ethidium Bromide) е известен канцероген. 3. Съхранявайте гела на тъмно и го оставете да се втвърди. 4. Заредете смес от 2,5µL от всеки PCR продукт и 2,5µL 2X зареждащ буфер с видима боя за проба, за амплификация. Оставете гела да стои на тъмно при приблизително 160 V в продължение на 45 минути или докато пробата стои достатъчно дълго, за да видите разделени ивици за едноверижен и двуверижен продукт (ивица от бромфенол синьо или друг видим маркер мигрира от 1 до 2 инча от ямките). 5. Снимайте с УВ трансилюминатор, със сложен GelStar жълт фотографски филтър (Lonza Group, Ltd. 50536). ВНИМАНИЕ: Носете предпазни средства, когато работите с GelStar оцветител за нуклеинова киселина или етидиев бромид и когато фотографирате гела, използвайки УВ трансилюминатор. 6. Анализ на гела Нулев клас 1 Нулев клас 2 Двуверижен(ни) (bp) ~210, ~280 ~180, ~280 Едноверижен(ни) (bp) ~150,~180 ~140,~180 Интерпретация на гела Амплификация Ямка Липса на амплификация Двуверижна ДНК Едноверижна ДНК ------- (Ярко) ------- (по-малко ярко) Ивица на праймер Страница 9 от 9 LC1437CEBG Rev. G