Таксономиянагъби Молекулярни подходи за идентификация
Молекулярниподходиза идентификациянамикроорганизми Универсалност приложими към всеки вид Общ подход за изучаване на микробното разнообразиенанивомакромолекули: нуклеинови киселини и белтък Отразяватприроднитевзаимовръзки, кодирани от ДНК
Молекулярниподходиза идентификациянамикроорганизми
Основнипонятия Таксовид (taxospecies) група щамове с висока степен на сходство на фенотипните си характеристики Геномен вид (genomic species) група организми с висока степен на хомоложност на ДНК Геновид (genospecies) група организми, способни на генетичен обмен
Белтъчнипрофили Функционално разнообразие физически характеристики на белтъците Едновременнаекспресияна 1000 2000 гена За таксономични цели: Тотален клетъчен белтък; SDS-PAGE Мултилокусен ензимен анализ (МЕА); PAGE
Електрофоретичнипрофилина тоталенклетъченбелтък 1964 г., въвежданена електрофоретичната (ЕФ) техника 1971 г., Laemmli, SDS-PAGE, 10 % разделящ гел 1975 г., нумериченанализнаефпрофили Ограничаващи фактори: липса на общоприетаефтехника, наповторяемост; на обективни методи за сравнение
Електрофоретичнипрофилина тоталенклетъченбелтък Протокол за провеждане на анализа: Култивиране при стандартизирани условия Приготвяненапробите t o C + SDS + DTT Провеждане на ЕФ Анализ на профилите нумеричен таксономичен анализ на дензитометрично сканирани гелове Разделителна способност ниво вид
Електрофоретичнипрофилина тоталенклетъченбелтък Предимства: Всички характеристики се получават по едно и също време от 1 тест с автоматично отчитане бърза и обективна оценка на данните Универсалност по отношение на различни представители на царство Fungi
Мултилокусенензименанализ 1957 58 г., изозим ензимниактивности, носени от различни молекулярни видове 1977 г. три категории изоензими: Генетично независими белтъци, кодирани от множественни генни локуси (МТ-МДХ и ЦП-МДХ) Ензимни варианти, кодирани от различни алелни гени в 1 генен локус = алелоензими (Гл-6Ф-ДХ) Хетерополимери хибридни молекули на 2 или повече различни полипептидни вериги ( междинни форми на ЛДХ)
Мултилокусенензименанализ Методи за анализ на мултиензимни смеси Разделителни техники електрофореза ИЕФ разделяне на основата на молекулна маса Имунологични анализи антигенни различия между множествените форми на ензимите Неразделителни техники
Мултилокусенензименанализ Зимограма: Директно оцветяване за активност в сепариращата среда Директно отразява ензимната множественост Сравнение между Rm стойности Количествен анализ
Мултилокусенензименанализ Развитие на зимограмата: Гел + повърхностен слой субстрат Включване на субстрата в гела Реакции за специфично оцветяване на ензимите: Директни ензима генерира цветен продукт Индиректни субстанция, резултат от ензимно действие, е субстрат на екзогенно добавен ензим + индикатор
Мултилокусенензименанализ Реакции за специфично оцветяване на ензимите: Положителни цветно петно на светъл фон Негативни просветляване на оцветен фон Реакции за оцветяване на специфични ензими: Дехидрогенази Хидролази (естерази, пептидази) Оксидази/пероксидази Други реакции
ИдентификациянаосноватанаДНК анализи Тотален геномен анализ: Г + Ц % Хибридизация Рестрикционни профили (RFLP) ДНК отпечатъци (fingerprinting) Хромозомен анализ (кариотипиране) Анализ на специфични гени / генни клъстери: Техники на основата на PCR
Тоталенгеноменанализ Г + Ц % Класически генотипен метод Обхватнавариране 3 до 10 % зарод Хибридизация Принцип: денатурациянаматричнаднк; добавяне на сонда и хибридизация; детекция на хибридите с различни методи Среда: върху мембрана, в течна среда, in situ
Хибридизация Установяване на родство между видове и врамкитенаединвид: Хибридизация на два цели генома; % ДНК-ДНК хибридизация Термостабилност на хибридите количественамярказаподобност, термостабилността намалява с 1 2.2 % за 1% погрешно свързани бази
Хибридизация Недостатъци на метода: Изисква много време Изисква значително количество ДНК Пример: Полово съвместими щамове на някои видове базидиомицетни гъби показват 75 % подобност; Морфологично подобни, но полово несъвместими представители само до 37 % подобност
Рестрикционнипрофили (RFLP) RFLP = Restriction Fragments Length Polymorphism; полиморфизъм в дължината на рестрикционните фрагменти Принцип: Смилане на тотална ДНК с рестрикцонни ендонуклеази Разделяне и визуализиране на фрагментите чрез АГЕ
Рестрикционнипрофили (RFLP) Директна детекция на малки различия в генома на изследваните МО Голям брой фрагменти - картина смив Малъкброй, номногоголемифрагменти трудности при мигриране в стандартна АГЕ Подбор на правилна рестриктаза и метод за визуализация
Рестрикционнипрофили (RFLP) RFLP + хибридизация Сонди случайно клонирани фрагменти от същия геномен вид Визуализират се щамово-специфични вариации в позицията на рестрикционните места или инсерции/делеции между тези места Използването на набор от сонди за вътревидова диференциация МТДНК, генитезаррнк предпочитани субстрати
Рестрикционнипрофили (RFLP) А, ВиС 3 вариантанаднк; стрелките мястонадействие на ендонуклеаза; В се различава от А по допълнителното мястонасрязване; СимаинсерцияотекстраДНК; след хибридизация със сондата сигнали с различна дължина (плътните линии) сонда A B C
ДНКотпечатъци (fingerprinting) Всеки метод, показващ достатъчно разлики между организмите, за да се определят като индивиди Сонди към микросателитна ДНК микросателитна ДНК клъстери от прости, повтарящи се последователности Произход неправилна рекомбинация между хомоложни клъстери
ДНКотпечатъци (fingerprinting) Промяна в дължината на последователностите от микросателитна ДНК при рекомбинация + сонда
ДНКотпечатъци (fingerprinting) Използване на човешка микросателитна ДНКкатосондазаДНКотпечатъципри различни патотипове гъби Приложение на прости последователности (ГАЦА) 4 заднк отпечатъци при различни гъби