Immucor GTI Diagnostics, Inc. 20925 Crossroads Circle, Waukesha, WI 53186 САЩ Тел.: +1 (855) 466-8267 WWW.IMMUCOR.COM Документацията и преводите за продукта са на разположение на: www.immucor.com LIFECODES HLA-SSO КИТОВЕ ЗА ТИПИЗИРАНЕ За ин витро диагностика СЪДЪРЖАНИЕ Определения на символите..... 1 Инструкции за употреба..... 6 Китове/реактиви по каталожен номер. 2 A. Пречистване на геномна ДНК. 6 Предназначение.. 4 Б. Амплификация... 6 Резюме и обяснение... 4 В. Хибридизация. 7 Принципи на процедурата 4 Г. Анализ с апарат Luminex. 7 и. 5 Резултати 8 A. Идентифициране.. 5 Качествен контрол... 8 Б. Предупреждения и предпазни мерки... 5 Ограничения на процедурата... 9 В. Инструкции за съхранение.. 5 Отстраняване на проблеми.. 9 Г. Пречистване или обработка за употреба.. 5 Очаквани стойности 9 Д. Показания за нестабилност 5 Специфични работни характеристики. 10 Изисквания към апарата 5 Литература.. 10 Вземане и подготовка на. 5 Ограничени лицензи... 10 Процедура... 5 Информация за производителя.. 10 A. Доставяни материали.. 5 Използвани търговски марки.. 10 Б. Необходими, но не доставяни материали, реактиви и оборудване.. 5 В. Допълнителни материали за осигуряване от потребителя... 6 Приложение A 11 Гел електрофореза.... 11 Интерпретация на гела. 11 ОПРЕДЕЛЕНИЯ НА СИМВОЛИТЕ (Етикети на продуктите и допълнителни документи) Код на партидата Използвайдо дата Предупреждение - вижте указанията за употреба Л И С Т О В К А С У К А З А Н И Я Каталожен номер Да се съхранява далеч от светлина Консултирайте се с инструкциите за употреба Температурни ограничения Достатъчен за N тестове Производител Горна граница на температурата Да не се замразява Упълномощен представител в Европейската общност Опасно Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текст Страница 1 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
КИТОВЕ/РЕАКТИВИ ПО КАТАЛОЖЕН НОМЕР LCT-A LIFECODES HLA-A SSO Кит за типизиране, каталожен 628911 LM-A LIFECODES HLA-A Кит за типизиране за употреба с Luminex Продукт 628410-50 MX-A LIFECODES HLA-A Мастер микс 628405 870 µl от 2 до 8 C BM-A LIFECODES HLA-A микс за 628453 810 µl от 2 до 8 C DS Разтвор за разреждане 628515 9,9 ml от 18 до 30ºC TAG LIFECODES Tag полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC LCT-AЕ LIFECODES HLA-A eres SSO Кит за типизиране, каталожен 628913 LC-AE LIFECODES HLA-A eres Кит за типизиране за употреба с Luminex Продукт 628459-50 MX-A LIFECODES HLA-A Мастер микс 628405 870 µl от 2 до 8 C BM-A LIFECODES HLA-A микс за 628453 810 µl BM-AeRES LIFECODES HLA-A eres микс за 628455 810 µl DS Разтвор за разреждане 628515 19,7 ml Ото18 до 30ºC TAG LIFECODES Tag полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC LCT-B LIFECODES HLA-B SSO Кит за типизиране, каталожен 628915 LM-B LIFECODES HLA-B Кит за типизиране за използване с Luminex Продукт 628510-50 MX-B LIFECODES HLA-B Мастер микс 628556 870 µl от 2 до 8 C BM-B LIFECODES HLA-B микс за 628553 810 µl от 2 до 8 C DS Разтвор за разреждане 628155 9,9 ml от 18 до 30ºC TAG LIFECODES Tag полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC LCT-BE LIFECODES HLA-B eres SSO Кит за типизиране, каталожен 628917 LC-BE LIFECODES HLA-B eres Кит за типизиране за използване с Luminex Продукт 628559-50 MX-B LIFECODES HLA-B Мастер микс 628556 870 µl от 2 до 8 C BM-B LIFECODES HLA-B микс за 628553 810 µl BM-BeRES LIFECODES HLA-B eres микс за 628554 810 µl DS Разтвор за разреждане 628515 19,7mL от 18 до 30ºC TAG LIFECODES Tag полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текст Страница 2 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
Миксовете за сонди са чувствителни към светлина: подлагайте ги на минимално въздействие на светлина ВНИМАНИЕ: Не използвайте компонентите след изтичане на сроковете им на годност. ВНИМАНИЕ: Отклонения от препоръчителните протокол и необходими материали, в т.ч. LIFECODES Taq полимераза не са били одобрени. КИТОВЕ/РЕАКТИВИ ПО КАТАЛОЖЕН НОМЕР LCT-СE LIFECODES HLA-С eres SSO Кит за типизиране, каталожен 628921 LC-CE LIFECODES HLA-C eres Кит за типизиране за използване с Luminex Продукт 628850-50 продукта Съхранение напълване 50 MX-C LIFECODES HLA-C Мастер микс 628803 870 µl от 2 до 8 C BM-CeRES LIFECODES HLA-C eres1 микс за 628804 810 µl от 2 to 8 C DS Разтвор за разреждане 628515 19,7 ml от 18 до 30ºC TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl от -10ºC до -30ºC LCT-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 SSO Кит за типизиране, каталожен 628923 LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Кит за типизиране за използване с Luminex Продукт 628751-50 MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Мастер микс 628753 870 µl от 2 до 8 C BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 микс за 628752 810 µl от 2 до 8 C DS Разтвор за разреждане 628155 9,9 ml от 18 до 30ºC TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC LCT-DR1Е LIFECODES HLA-DRB1 eres SSO Кит за типизиране, каталожен 628925 LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eres Кит за типизиране за използване с Luminex Продукт 628759-50 MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Мастер микс 628753 870 µl от 2 до 8 C BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 микс за 628752 810 µl Да се пази от светлина BM-DR1eRES LIFECODES HLA-DRB1 eres микс за 628755 810 µl Да се пази от светлина DS Разтвор за разреждане 628515 19,7mL от 18 до 30ºC TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC LCT-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 SSO Кит за типизиране, каталожен 628927 LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Кит за типизиране за използване с Luminex Product 629200-50 MX-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Мастер микс 629201 870 µl от 2 до 8 C LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 микс за BM-DRB3,4,5 629202 810 µl Да се пази от светлина DS Разтвор за разреждане 628515 19,7 ml от 18 до 30ºC TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl от -10 С до 30ºC Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текст Страница 3 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
Миксовете за сонди са чувствителни към светлина: подлагайте ги на минимално въздействие на светлина ВНИМАНИЕ: Не използвайте компонентите след изтичане на сроковете им на годност. ВНИМАНИЕ: Отклонения от препоръчителните протокол и необходими материали, в т.ч. LIFECODES Taq полимераза не са били одобрени. КИТОВЕ/РЕАКТИВИ ПО КАТАЛОЖЕН НОМЕР LCT-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 SSO Кит за типизиране, каталожен 628930 LC-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 Кит за типизиране за използване с Luminex Продуктов 200210-50 Достатъчен MX-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 Мастер микс 200200 870 µl от 2 до 8 C за 50 BM-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 микс за 200201 810 µl от 2 до 8 C Да се пази от светлина DS Разтвор за разреждане 628515 19,7 ml от 18 до 30ºC TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl от -10ºC до -30ºC LCT-DPAB LIFECODES HLA-DPA1/B1 SSO Кит за типизиране, каталожен 628936 LC-DPAB LIFECODES HLA-DPA1/B1 Кит за типизиране, за използване с Luminex Продуктов 200110-50 Съхранение MX-DPAB BM-DPAB LIFECODES HLA DPA1/B1 Мастер микс LIFECODES HLA DPA1/B1 микс за 200100 870 µl от 2 до 8 C 200101 810 µl от 2 до 8 C Да се пази от светлина Достатъчен за 50 DS Разтвор за разреждане 628515 19,7 ml от 18 до 30ºC TAQ LIFECODES Taq полимераза 628075 25 µl от -10ºC до -30ºC Миксовете за сонди са чувствителни към светлина: подлагайте ги на минимално въздействие на светлина ВНИМАНИЕ: Не използвайте компонентите след изтичане на сроковете им на годност. ВНИМАНИЕ: Отклонения от препоръчителните протокол и необходими материали, в т.ч. LIFECODES Taq полимераза не са били одобрени. ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ За ДНК типизиране на Клас І и Клас II HLA алели с цел подпомагане на трансфузията и съвпадението между донора и получателя на трансплантация. РЕЗЮМЕ И ОБЯСНЕНИЕ ДНК-базираното HLA тизипизиране с използване на амплифицирана с полимеразна верижна реакция (PCR) ДНК е обичайна лабораторна процедура. PCR амплификация на ДНК се използва като средство за обогатяване на избран ДНК регион. За HLA типизиране се използва последващ количествен анализ, за да се определят свойствата на амплифицираната ДНК. За HLA типизирането са използвани редица видове количествени анализи, като SSP (1), пряк SSOP (2), RFLP (3) и обратни SSOP dot blot технологии (4). Подобно на SSOP и обратните dot blot методи, китовете за типизиране LIFECODES HLA-SSO използват секвентно-специфични олигонуклеотиди (SSOs), за да идентифицират кои HLA алели са налични в PCR амплифицирана проба. Това е набор от използвани SSOs, а не методологии, които определят способността за разграничаване на различните налични алели в PCR амплификацията. Докато методите обратен dot blot и SSOP използват ензимни маркери и колориметрични субстрати, които изискват последващо проявяване, количественият анализ LIFECODES е хомогенна мултиплексна система. Това означава, че всички SSOs се анализират едновременно и целият количествен анализ се извършва в един реакционен съд с добавянето на един единствен реактив. ПРИНЦИПИ НА ПРОЦЕДУРАТА Процедурата LIFECODES HLA-SSO типизиране е базирана на хибридизацията на маркиран едноверижен PCR продукт за SSO сонди. Амплификацията на ДНК чрез PCR типично използва еквимоларни количества и прав и обратен праймер, за да генерира двуверижен ДНК продукт. Все пак, ако количеството на единия праймер е в излишък спрямо другия, реакцията ще генерира известно количество едноверижен ДНК продукт в допълнение към двойноверижния продукт. По време на първоначалните цикли на етапа на LIFECODES амплификацията се генерира двуверижна ДНК. Щом се изчерпи лимитиращия праймер, оставащият праймер използва двойноверижния продукт като шаблон за генериране на едноверижна ДНК. Този метод генерира както двойноверижен, така и едноверижен продукти, които при денатурация ще участват в реакцията за хибридизация. Всяка от различните сонди може да бъде хомоложна на секвенция в рамките на амплифицирана ДНК, която е уникална за алела или група алели. С други думи, тези сонди са проектирани така, че всяка сонда преференциално хибридизира към комплементарен регион, който може да е представен Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текст Страница 4 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
или не в амплифицираната ДНК. В допълнение, амплифицираната ДНК също е хибридизирана към една или повече консесусни сонди, хомоложни на наличните секвенции във всички алели на локуса. SSO типизирането може да бъде повлияно от вида на биологичния материал, метода на пречистване, количеството и целостта на геномната ДНК. Следователно, сигналът, получен за консенсусна(и) сонда(и), може да служи като индикатор за успеха на процедурите за амплификация и хибридизация. Също така, сигналът, получен с консенсусна сонда, може да бъде използван за нормализиране на сигнала от специфични за алелите сонди и за неутрализиране на вариации в количеството на амплифицирания продукт при реакцията за хибридизация. Анализът на резултатите, генерирани от SSO типизирането, може да бъде използван за определяне на присъствието или отсъствието на специфични ДНК секвенции и да идентифицира възможните алели в пробата. За процедурата на LIFECODES HLA-SSO типизиране, сондите се прикрепват към Luminex 100 или 200 микросфери, предназначени за използване с апарата Luminex. До 100 различни популации на Luminex микросфери могат да бъдат миксирани заедно и анализирани с апарата Luminex 100 или 200, защото всяка популация от микросфери може да бъде различена чрез своята уникална флуоресцентна сигнатура или цвят. Към всяка оцветена микросфера може да бъде прикачена различна SSO сонда. Ето защо, комбинираните различни сонди могат да бъдат разграничени една от друга въз основа на тяхната връзка със специфични оцветени микросфери. Апаратът Luminex е в състояние да определи относителното количество маркиран PCR продукт, хибридизиран към всяка Luminex 100 или 200 микросфера. Следователно, относителният сигнал, получен със SSO сондите при количествения LIFECODES анализ, както и при други SSOP методи, може да бъде използван за задаване на положителна или отрицателна реактивност на сондите с амплифицираната ДНК проба (вижте раздела Резултати). Това, от своя страна, осигурява необходимата информация за определяне на HLA фенотипа на пробата. РЕАКТИВИ А. Идентифициране Вижте таблиците в раздела Китове/и по каталожен номер за пълния списък на продуктите и каталожните номера. Б. Предупреждения и предпазни мерки 1. За ин витро диагностика. 2. За предварителните и последващите PCR манипулации трябва да се използват отделни пипети. 3. Биологична опасност: всички биологични и кръвни трябва да бъдат третирани като потенциално инфекциозни. Използвайте универсалните предпазни мерки при манипулации. 4. Разтворът за разреждане, миксовете за сонди, TAQ полимеразата и R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин съдържат опасни съединения. Избягвайте контакт с кожата и очите и изхвърлете всички материали след употреба в съответствие с местните разпоредби. Вижте Информационните листове за безопасност за допълнителна информация. 5. Резултатите от тези китове не трябва да бъдат използвани като единствено основание за вземане на клинично решение за пациента. В. Инструкции за съхранение 1. Вижте етикета на опаковката на компонента на кита за подходящите температури на съхранение. 2. Миксовете за сонди и R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин са чувствителни към светлина, ПАЗЕТЕ ОТ СВЕТЛИНА; НЕ ЗАМРАЗЯВАЙТЕ. 3. Не използвайте компоненти след изтичане на срока им на годност. Г. Пречистване или обработка, необходими за употреба Вижте "Вземане и подготовка на " Д. Показания за нестабилност 1. Ако по време на транспортиране или съхранение са се утаили соли от разтвора, разтворете го напълно отново преди употреба чрез разбъркване при стайна температура (от 18 до 30 C). 2. Не използвайте R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин, който е бил замразен по време на транспортиране или съхранение. 3. Китовете са стабилни в продължение на минимум 6 месеца след отваряне, когато се съхраняват според препоръките. ИЗИСКВАНИЯ КЪМ АПАРАТА 1. Апарат Luminex 100 или 200 и XY платформа (Продуктов 888300, 888302) 2. Били са одобрени следните термоциклери: 96-ямкова GeneAmp PCR система 9700 с настройка за режим MAX (основен кат. N8050200, Gold Block кат. 4314878), Veriti 96-ямков термоциклер с настройка за режим 9700 MAX (кат. 4375786). Вижте в Таблица 2 минималните линейни скорости. Внимание: други термоциклери и линейни скорости не са били одобрени. ВЗЕМАНЕ И ПОДГОТОВКА НА ПРОБИ а. Човешка ДНК може да бъде пречистена от цяла кръв, левкоцитен слой и букална намазка, като се използва утвърден метод, който покрива по-долните критерии. б. ДНК, извлечена от кръв, консервирана в EDTA и ACD (лимонено-кисела декстроза), е била тествана и е показала, че носи очакваната производителност за този анализ. ДНК, извлечена от кръв, консервирана в хепарин, не може да бъде използвана за този анализ. Други консерванти не са тествани. в. Изолираната ДНК трябва да бъде в 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 или във вода без нуклеаза. Ако е налице хелатиращ агент, като например EDTA, крайната концентрация на хелатиращия агент не трябва да надвишава 0,5 mm. г. Наличието на алкохол, почистващи препарати или соли може да повлияе неблагоприятно върху амплификацията на ДНК. д. Крайната концентрация на ДНК трябва да бъде от 10 до 200 ng/µl. е. Измерванията на абсорбцията на ДНК пробата при 260 и 280nm трябва да покажат съотношение от 1,65 до 2,0. ж. ДНК може да се използва незабавно след изолация или да се съхранява до 1 година при -20ºC. Повторното замразяване/размразяване трябва да се избягва, тъй като може да доведе до деградация на ДНК. ПРОЦЕДУРА Внимание: Отклонения от препоръчителните протокол и необходими материали не са били одобрени. A. Доставяни материали (Вижте таблиците в раздел Китове/и по каталожен номер за конкретна информация) Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текст Страница 5 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
Подходящ мастер микс (MX) Подходящ микс за сонди (BM) Разтвор за разреждане (DS) Таблица на праговете, диаграма(и) на попаденията на сондата LIFECODES Tag полимераза (LIFECODES кат. 628075) Б. Необходими, но не доставяни материали За одобряването на кита бяха използвани следните материали:luminex проточна течност (1x Lifecodes кат. 628005) Вода без нуклеаза (Lifecodes кат. 757003; 20mL) PCR епруветки и капачки - Corning Thermowell ленти за епруветки (Costar кат. 6542, LIFECODES кат. 888640) или Axygen 8-Strip PCR Епруветки (Axygen кат. PCR0208CPC) или Applied Biosystems MicroAmp 8- Епруветки Strip И MicroAmp 8-Cap Strip (ABI кат. N8010580 И N8010535) или Corning Thermowell PCR 96 ямкови плаки (кат. CLS6551) или Thermo Scientific AB Gene Super Plate 96-ямкова PCR плака (кат. AB-2100) Costar плака (Costar кат. 6509, LIFECODES кат. 888630) Прозрачна полиетиленова лента за Thermowell (Costar 6524 (LIFECODES кат. 888635 ) R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин (SA-PE), 1mg/mL (LIFECODES кат. 628511) Luminex китове за калибриране (Luminex 100/200 кит за калибриране, Luminex 100/200 кит за валидиране на работата, LIFECODES кат. 628018 и 628019 съответно) В. Допълнителни материали за осигуряване от потребителя Вортекс миксер Силиконов компресионен слой. Axygen Scientific CM-FLAT или еквивалентен Соникатор за вана Накрайници за бариерен филтър на микроцентрофуга Пипетори, многоканални пипетори и накрайници (1-20µL, 20-200µL, 1000µL) Софтуер за анализ на електронни таблици Термоблок 70% изопропанол или 20% обезцветител Фиксираща тава - Applied Biosystems 403081 (за употреба само с термоциклер 9700) ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА ЗАБЕЛЕЖКИ: Миксовете за сонди и SA-PE са светочувствителни: да се пазят от светлина и да не се замразяват. Затоплете сферите от 55º до 60ºC в продължение на поне 5-10 минути, за да направите разтворими компонентите на сместа в сондата. Диспергирайте за кратко с ултразвук (~15 сек.), а след това разбъркайте с вортекс миксер сместа за сонди за около 15 секунди, за да суспендирате напълно сферите. Обърнете специално внимание при разпределянето на аликвоти, като използвате калибрирани пипети. Неспазването на това може да доведе до загуба на реактив и провал на пробата. Всички температури трябва да бъдат поддържани точно. Флуктуации дори в рамките на +/- 0,5 C могат да повлияят на резултатите. По време на етапа на хибридизация те не трябва да остават в разредено състояние при 56 C за повече от 5 мин. (вижте раздел Резултати). Препоръчително е амплифицираните да се анализират възможно най-скоро. Ако те на могат да бъдат обработени с апарата Luminex същия ден, амплифицираният продукт може да бъде съхраняван до 3 дена при 2-8ºC преди употреба. За по-продължителен период, съхранявайте при -20ºC до една седмица, докато сте готови за анализиране. Амплифицираният продукт може да бъде замразен и размразен еднократно. Повторното замразяване и размразяване ще доведе до влошаване на амплифицираните и лоши резултати, ако се подложи на количествен анализ. A. Пречистете геномна ДНК, като използвате метод по избор; крайната концентрация трябва да бъде от 10 до 200 ng/µl. Регулирайте, ако е необходимо, с вода без нуклеаза. Поддържайте сходни концентрации за всички. Б. ДНК амплификация (PCR) 1. Оставете мастер микса да се загрее до стайна температура (от 18 до 30 C). 2. Внимателно разбъркайте с вортекс миксер за около 10 секунди. Това ще гарантира присъствието на солите в разтвора. Центрофугирайте за кратко (от 5 до 10 секунди) в микроцентрофуга, за да стигне съдържанието до дъното на епруветката. 3. Като използвате Таблица 1 по-долу, подгответе компонентите за амплификация на n+1 реакции, като използвате посоченото количество от всеки компонент за реакция (с изключение на ДНК). Доведете до краен обем от 20µL за реакция с вода без нуклеаза. Внимателно разбъркайте с вортекс миксер. 4. Дозирайте с пипета подходящото количество геномна ДНК (от 40 до 120ng) в PCR епруветки. 5. Разпределете на аликвотни части амплифицираният микс в PCR епруветки, съдържащи геномна ДНК. (Общият обем на микс за амплификация и геномна ДНК трябва да бъде равен на 20µL за всяка реакция на проба.) 6. Затворете плътно капачетата на епруветките, за да предотвратите изпаряване по време на PCR. 7. Поставете те в термоциклера и изпълнете програмата, вижте Таблица 2 и Таблица 3. Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 6 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
Таблица 1. Компоненти на реакция за амплификация Компонент Количество за PCR реакция на проба LIFECODES мастер микс 6µL Геномна ДНК 10-200ng/µL Общо ~80ng Taq полимераза 0,2µL (1U) Вода без нуклеаза До 20µL краен обем Таблица 2. Условия за амплификация на термоциклера Термоциклер GeneAmp PCR System 9700 Veriti 96-ямков термоциклер Режим (линейна скорост) режимmax (3,9 C/секунда) режим 9700 MAX (3,9 C/секунда) Таблица 3. Условия в термоциклера за амплификация Стъпка Температура и време на инкубация Брой цикли 1 95º C за 3 минути 1 2 3 95º C за 15 секунди 60º C за 30 секунди 72º C за 30 секунди 95º C за 10 секунди 63º C за 30 секунди 72º C за 30 секунди 4 72º C за 2 минути 1 5 4º C постоянно 1 12 28 Забележка: За да сте сигурни в амплификацията на пробата, вижте за справка Гел електрофореза на продукт (Приложение А). B. Хибридизация Уверете се, че компонентите на буфера за хибридизация на LIFECODES микс за сонди са разтворими и че сферите са напълно суспендирани. Включете апарата Luminex 100 или 200 и XY платформата за 30 минутно загряване. 1. Загрейте микса за сонди от 55ºC до 60ºC в термоблок за поне 5-10 минути, за да направите разтворими компонентите на сместа в сондата. 2. Диспергирайте за кратко с ултразвук (~15 сек.), а след това разбъркайте с вортекс миксер сместа за сонди за около 15 секунди, за да суспендирате напълно сферите. 3. Смесете 15 µl от съответния микс за сонди с 5 µl локус специфичен PCR продукт във всяка една ямка на термоциклер с 96- ямкова плака (Costar 6509). Имайте предвид, че А eres, В eres и DRB1 eres китовете изискват две ямки за проба, една за eres микс за сонди и една за стандартния микс за сонди. eres миксът за сонди и стандартният микс за сонди не трябва да се изпълняват в една и съща програма. И двата микса за сонди са необходими за получаване на eres резултати. Китовете С eres съдържат само един стандартен микс за сонда. Когато разпределяте аликвотни части от микса за сонди в повече от 10 ямки, леко разбърквайте с вортекс миксер микса за сонди след всеки десет ямки. Затворете херметично с полиетиленова лента (Costar 6524). 4. Поставете отгоре върху плаката силиконов компресионен слой преди хибридизация. 5. Хибридизирайте те при следните инкубационни условия: Таблица 4. Условия в термоциклера за хибридизация 97ºC за 2 минути 47ºC за 10 минути 56ºC за 8 минути 56 ºC ЗАДЪРЖАНЕ Убедете се, че детекторният лазер на инструмента Luminex 100 или 200 е бил включен поне 30 минути преди края на хибридизацията. Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 7 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
6. Докато те се хибридизират, подгответе 200:1 разтвор за разреждане/sa-pe смес. Комбинирайте 170µL разтвор за разреждане (DS) и 0,85 µl 1mg/mL SA-PE за проба. Препоръчва се да приготвите достатъчно разтвор за разреждане за n+1, за да се отчете загубата при дозиране с пипета. (вижте Таблица 5) 7. Пазете разтвора за разреждане/ SA-PE сместа на тъмно, при стайна температура; SA-PE е чувствителен на светлина! Разтворът за разреждане може да бъде нагрят до 45ºC за 5 минути и разбъркан с вортекс миксер, за да се гарантира, че всички компоненти са в разтвора. Разтворът за разреждане трябва да е със стайна температура (от 18 до 30 C) преди да приготвите сместа. Пригответе преди употреба и изхвърлете останалата част. Таблица 5. Подготовка на обеми от разтвора за разреждане Бр. Разтвор за SA-PE разреждане (DS) 1 170µL 0,85µL 5 850µL 4,25µL 10 1700µL 8,5µL 20 3400µL 17µL 50 8500µL 42,5µL Забележка: НЕ ОТМЕНЯЙТЕ ПРОГРАМАТА ЗА ХИБРИДИЗАЦИЯ ПРЕДИ ДА ИЗВАДИТЕ ТАБЛАТА ОТ ТЕРМОЦИКЛЕРА! 8. При задържане при 56ºC, докато таблата е в термоциклера, разредете всяка проба със 170µL от приготвения разтвор за разреждане/ SA-PE смес. Много е важно да се разредят всички в рамките на 5 минути (след стъпката от 8 минути задържане при 56 C). 9. Извадете таблата с от термоциклера и я поставете в апарата Luminex 100 или 200. Г. Анализ с апарат Luminex 100 или 200* За най-добри резултати, анализирайте те незабавно, като използвате апарата Luminex 100 или 200. Проби могат да се отчитат до 30 минути след като са били разредени. Ако не са отчетат незабавно, защитете те от въздействието на светлина. 1. Включете апарата Luminex 100 или 200 между 30 минути и 4 часа преди анализиране на те. 2. Преди анализиране на те с апарата Luminex 100 или 200, настройте партидна обработка, с която ще бъдат анализирани те. а) Изберете Create a New Batch (Създаване на нова партида) от менюто File (Файл). Например, ако анализирате за HLA-DRB1, добавете Batch (Партида) за HLA-DRB1. Предоставя се и се дава име на Шаблон за партида, в този случай, HLA-DRB1. Моля, обърнете внимание, че версиите на шаблона са специфични за партидни номера и съответстват на партидните номера на кита. Следвайте стъпка по стъпка инструкциите, които се появяват на екрана за създаване на партиди. Когато давате име на партидата, не включвайте запетаи в името, защото информацията след запетаята ще се загуби при експортиране на данните. За по-нататъшни инструкции относно създаването на партиди или многобройни партиди, вижте ръководството за потребителя на Luminex б) Щракнете върху иконата за изваждане, за да извадите носача на плаки. Поставете 96-ямковата плака на термоциклера, съдържаща те, в XYP термоблока, който се намира върху носача на плаки. в) Щракнете върху иконата Retract (Прибирам). Пробите сега са готови да бъдат анализирани. Първата стъпка трябва да бъде изпълнена преди да стартирате изпълнението. г) След преминаване на те през апарата, трябва да се пусне цикъл за почистване с 70% изопропанол или 20% домашна белина, последван от два цикъла на миене. В този момент апаратът може да бъде изключен, ако няма да се използва през остатъка от деня. 3. След приключване на обработката на партидата, данните се експортират като файл с разделени със запетая стойности (csv). Тези файлове получават имена OUTPUT.CSV и се записват в папка с името на партидата. След това тези данни са достъпни за извършване на задачи за типизиране, както е описано по-долу. *За експлоатацията на апарата се обърнете към Ръководството на потребителя на Luminex, включително относно процедурите за ежедневно стартиране, калибриране, поддръжка и изключване. РЕЗУЛТАТИ Софтуерът MATCH IT! DNA е предвиден като помощно средство за анализа на китовете за типизиране LIFECODES SSO. Типизирането на проба може да се направи както следва: Генерираният CSV файл може да бъде отворен и данните обработени с общи програми за електронна таблица, като Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro или аналогичен софтуер. Анализът се състои от следните стъпки: 1) Уверете се, че е постигнат минималния брой от 60 събития за всяко SSO във всяка проба. Тази информация се намира в раздела DataType: Count на CSV файла. 2) Установете, че стойностите за консенсусните сонди за всяка проба са над техните минимални медиани на интензитет на флуоресцентно излъчване (Median Fluorescent Intensity) или MFI. Минималните прагове са специфични за партида и могат да бъдат намерени в Таблицата за праговете. Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 8 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
Внимание: За да получите надеждни резултати, трябва да има достатъчно данни, събрани с апарата Luminex 100 или 200. Съберете най-малко 40 събития за HLA-DQA1/B1 (Кат. 628930) и HLA-DPA1/B1 (Кат. 628936). Съберете най-малко 60 събития за останалите китове, изброени в раздела КИТОВЕ/РЕАКТИВИ ПО КАТАЛОЖЕН НОМЕР, или минималния брой събития, посочен в специфичните за партидата документи. 3) Извадете стойността на Background Control (контрол на фона) за всяка сонда от стойностите на пробата, за да изведете коригиран набор от данни. Стойностите на Background Control (контрол на фона) се намират в Таблицата на праговете и са специфични за партида. Фоновите стойности са средните MFI стойности за всяка сфера, за да компенсират фоновия шум, дължащ се на вариациите на сферите. 4) За всяка проба, разделете коригираните с фона данни за всяка сонда на коригираните с фона стойности за консенсусната сонда, за да получите нормализиран набор от данни. MFI (сонда) MFI (контролен празен за сонда) MFI (консенсусен) MFI (контролен празен за консенсусен) 5) За всяка сонда запишете нормализираната стойност в Работната таблица за праговете. 6) След като всички стойности са определени, структурата на попаденията на сондата (т.е. комбинацията на всички положителни и отрицателни присвоявания за дадена проба) могат да бъдат сравнени с предоставената(ите) Таблица(и) на попаденията на сондата. Внимание: Има отделна таблица на праговете за всеки локус и всеки микс за сонди. Тези таблици на праговете са специфични за партида; уверете се, че партидния номер в таблиците на праговете отговаря на партидния номер на кита за типизиране. Ако нормализираната стойност за определена проба попада над максималния праг за отрицателно присвояване и под минималната стойност за положително присвояване, пробата трябва да бъде разглеждана като неопределена за тази сонда. Пробата трябва да бъде типизирана, като се допусне първо, че стойността е отрицателна и след това отново, допускайки че стойността е положителна. Вижте раздела ОЧАКВАНИ СТОЙНОСТИ за допълнителна информация относно праговите стойности. КАЧЕСТВЕН КОНТРОЛ Препоръчва се да изпълните един положителен и един отрицателен контрол с всеки тест, като например, чиста вода и предварително типизирана проба съответно. Консенсусни SSO сонди, описани в Таблицата на праговете, хибридизират съответните им локус специфични алели. Стойностите, получени с консенсусни SSOs от положителен контрол, трябва да надвишават праговата стойност за SSO, предвидена в Работния лист на таблицата на праговете. Стойностите, получени с консенсусни SSOs от чиста вода трябва да бъдат под праговата стойност за SSO, предвидена в Работния лист на таблицата на праговете. LIFECODES миксът(овете) за сонди съдържа една или повече консенсусни SSO сонди, определени в работните листове на типизиращите китове. Тези консенсусни сонди хибридизират всички алели и действат като вътрешен контрол, за да се провери амплификацията и да се потвърди, че хибридизацията е настъпила. Ако не се получи минималната стойност за тези SSOs, пробата може да не покаже правилна типизация и пробният тест трябва да бъде повторен. Анализът трябва да се изпълни така, както се препоръчва в листовката, както и да се изпълни заедно снякоя друга процедура за контрол на качеството, която е в съответствие с изискванията на местните, щатските, федералните и/или акредитационните агенции. ОГРАНИЧЕНИЯ НА ПРОЦЕДУРАТА Описаните PCR условия и условия на анализ изискват точно контролирани условия. Отклонения от тези параметри могат да доведат до повреда на продукта. Всички апарати трябва да бъдат калибрирани в съответствие с препоръките на производителя и да се експлоатират в рамките на предписаните от производителя параметри. 1) Сферите трябва да бъдат предварително затоплени и добре суспендирани преди употреба. Това гарантира наличието на хибридизационните буферни компоненти в разтвора. 2) Инкубациите при 47ºC и 56ºC изискват висока степен на точност (+/- 0,5ºC). Термоциклерът трябва да бъде използван. Температурата в ямките на 96-ямковата плака на термоциклера трябва да бъде проверена с помощта на термодвойка (например Bio-Rad, модел VPT- 0300 или еквивалентен). Температурата в ямките и между ямките не трябва да варира с повече от +/- 0,5ºC. 3) Времето при 56ºC е критично и не трябва да надвишава общо 13 минути. Това включва 8-минутна инкубация плюс не повече от 5 минути за разреждане на всички с разтвор за разреждане/ SA-PE смес. 4) Веднъж разредени, те са стабилни при стайна температура (от 18 до 30 C) до 2 часа (да се пазят от светлина). Тъй като преминаването на пълна 96-ямкова плака през апарата Luminex 100 или 200 може да отнеме до 1,5 ч., анализът трябва да започне не повече от 30 минути след разреждане, за да се гарантира, че последната проба е анализирана в рамките на 2- часовия лимит. 5) Не смесвайте компоненти от други китове и партиди. Поради комплексния характер на HLA типизацията, квалифициран персонал трябва да прегледа интерпретацията на данните и задачите за типизиране. Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 9 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
ОТСТРАНЯВАНЕ НА ПРОБЛЕМИ ПРОБЛЕМ ВЪЗМОЖНА ПРИЧИНА РАЗТВОР Малък брой Миксът за сонди не е добре суспендиран Подгрейте, диспергирайте с ултразвук и сфери разбъркайте с вортекс микса за сонди и повторете CON прагов отказ Многократни SSO откази или пробата не може да даде резултат за HLA типизиране Апарата не функционира правилно Пробата не успява да се апмплифицира или се амплифицира лошо Нарушена калибровка Пътят на движение на пробата е блокиран Ниска ДНК Солите в мастер микса са извън разтвора Лоша Taq полимераза Условията за амплификация не са в рамките на определените параметри Ниска медиана на интензитет на флуоресцентното излъчване (MFI) Специфична амплификация на алели ДНК пробата е замърсена ДНК е частично деградирала Условията за амплификация не са в рамките на определените параметри Изпарения по време на стъпката хибридизация * PCR амплификацията може да бъде проверена чрез гел елекрофореза (вижте Приложение A). анализа. Калибрирайте апарата. (вижте Ръководството за експлоатация на Luminex IS.) Свалете и обработете с ултразвук иглата. Промийте с обратен поток. Обадете се на Immucor GTI Diagnostics, Inc., ако проблемът остава. +1 (855) 466-8267 Проверете концентрацията на ДНК и пречистете. Загрейте мастер микса до 37ºC за 5 минути, разбъркайте леко с вортекс и спрете въртенето за кратко време. Използвайте одобрената LIFECODES Taq полимераза с кат. 628075. Стартирайте температурния профил на термоциклера, за да проверите дали параметрите са в рамките на определените стойности. Затоплете разтвора за разреждане до 45ºC за 5 минути преди употреба и разбъркайте с вортекс. Съхранявайте при стайна температура. Заменете R-фикоеритрин конюгиран стрептавидин. Стартирайте температурния профил на термоциклера, за да проверите дали параметрите са в рамките на определените стойности. Изолирайте отново ДНК от кръвна проба. Ако не използвате цялата плака, оставете един празен ред от всяка страна на анализираните, за да позволите плътно затваряне на плаката. ОЧАКВАНИ СТОЙНОСТИ Стойностите обикновено могат да бъдат разделени на положителни и отрицателни. В някои редки случаи, стойностите могат да бъдат неопределени. "Неопределена стойност" представлява обхват, в който не са били наблюдавани нито положителни, нито отрицателни стойности. Ако пробата съдържа неопределени стойности за определена SSO сонда, пробата трябва да бъде типизирана със сондата като отрицателна и отново със сондата като положителна. Могат да възникнат три случая: 1. Един от изборите (т.е. положителен или отрицателен) дава съвпадение. 2. И двата избора дават съвпадения. Пробата може да бъде анализирана повторно или получените алели от двете типизации могат да бъдат отчетени. 3. Нито един избор не дава съвпадение. В този случай, вероятно има други сонди, които са неправилно определени. Тази проба се нуждае от повторен анализ и евентуално повторна амплификация. Ако повече от две сонди са неопределени, пробата трябва да бъде анализирана повторно. Ако структурата на попаденията на сондата не дава HLA тип, пробата трябва да бъде амплифицирана и анализирана повторно. Също така може да се наложи да се изолира отново ДНК от пробата и тя да се амплифицира и анализира повторно. Както е отбелязано в раздела Ограничения на процедурата, това е много важно за точното спазване на протокола. Всяко отклонение може да доведе до провал на типизацията на пробата. СПЕЦИФИЧНИ РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ Когато кит за типизиране LIFECODES HLA SSO се използва в съответствие с описаната в листовката процедура, могат да бъдат определени клас І и клас ІІ HLA тип на ДНК. Кит А на HLA (каталожен 628911) показва 98,46% съвпадение на HLA A алели (95,24% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 10 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
Кит А eres на HLA (каталожен 628913) показва 98,46% съвпадение на HLA A алели (95,24% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Кит B на HLA (каталожен 628915) показва 99,23% съвпадение на HLA B алели (96,40% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Кит B eres на HLA (каталожен 628917) показва 100% съвпадение на HLA B алели (97,72% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Кит C eres на HLA (каталожен 628921) показва 99,23% съвпадение на HLA C алели (96,40% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Кит DRB1 на HLA (каталожен 628923) показва 98,46% съвпадение на HLA DRB1 алели (95,24% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Кит DRB1 eres на HLA (каталожен 628925) показва 100% съвпадение на HLA DRB1 алели (97,72% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Кит DRB 3, 4, 5 на HLA (каталожен 628927) показва 100% съвпадение на HLA DRB 3, 4, 5 алели (97,72% по-ниска граница на 95% доверителен интервал, използвайки едностранен точен метод) при сравнение на резултатите от типизиране на 2 полета на HLA в 130 добре характеризирани. Китът HLA-DQA1/B1 (Кат. 628930) показва 99,2% съответствие за DQA алели (96,2% долна граница, с използване на едностранен точен метод при 95% доверителен интервал) и 98,4% съответствие за DQB алели (95,2% долна граница, с използване на едностранен точен метод при 95% доверителен интервал), когато се сравняват резултатите за HLA типизиране в 2 полета на със 123 и 130 характеризирани ямки съответно. Китът HLA-DPA1/B1 (Кат. 628936) показва 100% съответствие за DQA алели (97,7% долна граница, с използване на едностранен точен метод при 95% доверителен интервал) и 98,5% съответствие за DQB алели (95,4% долна граница, с използване на едностранен точен метод при 95% доверителен интервал), когато се сравняват резултатите за HLA типизиране в 2 полета на със 133 и 135 характеризирани ямки съответно. При лабораторно тестване следните вещества демонстрират известно инхибиране, когато се оценяват с китовете за типизиране LIFECODES HLA-DQA1/B1 и LIFECODES HLA-DPA1/B1 SSO. С най-висока концентрация на смущение при веществата без инхибиране са натриев додецил сулфат (0,005% (w/v)), етанол (500mM), фенол (0,125% (v/v)), сукроза (0,1М), EDTA (500 µm), ACD, (0,1% (v/v)), холестерол (3 µg/ml), билирубин (16,4 µm), хемоглобин (0,0156 mg/ml) и хемолизирана кръв (0,1 % (v/v)). ЛИТЕРАТУРА 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163 3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 ОГРАНИЧЕНИ ЛИЦЕНЗИ Tag полимеразата се произвежда от Promega Corp. за компанията Immucor GTI Diagnostics. Лицензът принадлежи на Promega съгласно патенти на САЩ 5,338,671 и 5,587,287 и съответстващите им чуждестранни патенти. Закупуването на този продукт включва ограничен, непрехвърляем лиценз съгласно патент на САЩ 5,981,180 или неговите чуждестранни аналози, собственост на Luminex Corporation, за извършване на мултиплексен анализ на клинични за HLA типизиране. УПЪЛНОМОЩЕН ПРЕДСТАВИТЕЛ Упълномощен представител: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32, 63303 Dreieich, Германия Европейска техническа служба: тел.: +32/3 385 4791 Последна редакция и публикуване на документа: 2019-07-24 ИЗПОЛЗВАНИ ТЪРГОВСКИ МАРКИ AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Gene Amp Veriti LIFECODES Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 11 от 12 LC1436IVDBG Rev. K
ПРИЛОЖЕНИЕ А Гел електрофореза PCR реакциите, изпълнени в LIFECODES HLA-SSO китовете за типизиране, са предназначени за производство на двуверижни и едноверижни продукти, които са преобладаващите продукти, които хибридизират към SSOs. За осигуряване на качеството или за отстраняване на проблеми при експеримент, възможно е да се наложи провеждане на гел електрофореза, за да се изследва присъствието на амплифицирана ДНК в PCR реакцията. Необходими материали (както са изброени или еквивалентни) Агароза за електрофореза (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose 50170) Апарат за електрофореза/ захранване 1X гел буфер (40xTAE, Promega V4281) GelStar гелов оцветител на нуклеинова киселина (Lonza Group, Ltd. 50535) УВ трансилюминатор (ChromatoVUE, UVP Inc. модел TM36) Система за фотографска визуализация Относителната миграция на едноверижен продукт зависи от концентрацията на гела и използваната буферна система. Приблизителни миграции за всяка амплификация са описани по-долу за, анализирани в 2% агарозни гелове в буфер 1X TAE. Условия за електрофореза Забележка: Неприложима за HLA-DQA1/B1 (Кат. 628930), HLA-DRB 3,4,5 (Кат. 628927) и HLA-DPA1/B1 (Кат. 628936), тъй като индивидуални ленти не могат да бъдат различени в сложна комбинация. 1. Извадете GelStar оцветителя за нуклеинова киселина (Lonza Group, Ltd. 50535) от фризера, за да се размрази. Съхранявайте на тъмно. 2. Гелът, използван за тази процедура трябва да бъде 2%, т.е. за 200ml носител на гела се използват 4 г агароза за 200mL 1X TAE (разреден от 40X TAE). Добавете 10µL GelStar оцветител за нуклеинова киселина към разтопената агароза. Когато изливате гела, уверете се, че оставяте достатъчно място за ДНК (от 1 до 2 инча), за да може да мигрира. БЪДЕТЕ ВНИМАТЕЛНИ: GelStar е потенциален канцероген. ЗАБЕЛЕЖКА: Възможно е да се използват гелове с 20µL от 10mg/mL етидиев бромид вместо GelStar Nucleic Acid Stain. Лентата на интензивността на продукта ще бъде по-малка в гелове, съдържащи етидиев бромид, отколкото в гелове, съдържащи GelStar. БЪДЕТЕ ВНИМАТЕЛНИ: етидиев бромид (Ethidium Bromide) е известен канцероген. 3. Съхранявайте гела на тъмно и го оставете да се втвърди. 4. Заредете смес от 2,5µL от всеки PCR продукт и 2,5µL 2X зареждащ буфер с видима боя за проба, за амплификация. Оставете гела да стои на тъмно при приблизително 160 V в продължение на 45 минути или докато пробата стои достатъчно дълго, за да видите разделени ивици за едноверижен и двуверижен продукт (ивица от бромфенол синьо или друг видим маркер мигрира от 1 до 2 инча от ямките). 5. Снимайте с УВ трансилюминатор, със сложен GelStar жълт фотографски филтър (Lonza Group, Ltd. 50536). ВНИМАНИЕ: Носете предпазни средства, когато работите с GelStar оцветител за нуклеинова киселина или етидиев бромид и когато фотографирате гела, използвайки УВ трансилюминатор. 6. Анализ на гела HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1 Двуверижен(ни) (bp) ~420 ~370, ~340 ~476, ~447 ~280 Едноверижен(ни) (bp) ~240 ~200 ~250, ~200 ~180 Интерпретация на гела Амплификация Ямка Липса на амплификация Двуверижна ДНК Едноверижна ДНК ----(Ярко) --------(по-малко ярко) Ивица на праймер Ключ: Подчертано = Допълнение или значителна промяна; = Изтриване на текстстраница 12 от 12 LC1436IVDBG Rev. K