НАЦИОНАЛЕН ЦЕНТЪР ПО РАДИОБИОЛОГИЯ И РАДИАЦИОННА ЗАЩИТА Лаборатория Молекулярна радиобиология и профилактика НЕВЕНА ЯНЧОВА АНЕВА РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРАН

Препис

1 НАЦИОНАЛЕН ЦЕНТЪР ПО РАДИОБИОЛОГИЯ И РАДИАЦИОННА ЗАЩИТА Лаборатория Молекулярна радиобиология и профилактика НЕВЕНА ЯНЧОВА АНЕВА РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРАН ВЪЗПАЛИТЕЛЕН ОТГОВОР АВТОРЕФЕРАТ на дисертация за присъждане на научна и образователна степен Доктор Научна специалност Радиобиология: шифър Научен ръководител: Проф. д-р РАЙНА БОТЕВА, дхн Научен консултант: Гл. асистент д-р ЕЛЕНА ЗАХАРИЕВА София, 2017

2 Дисертационният труд съдържа 140 страници, 46 фигури и 12 таблици разделени в 5 раздела. В библиографската справка са включени 229 литературни източника. Дисертационният труд е обсъден и насочен за защита на заседание на Научния колегиум при НЦРРЗ на г. Научно жури: 1. Доц. д-р Жана Николаева Джунова - Великова, дм 2. Доц. д-р Илона Михайлова Гюлева, дм 3. Проф. Райна Николаева Шипарова - Ботева, дхн 4. Проф. д-р Николай Василев Мънчев, дмн 5. Доц. Иванка Маринова Рупова - Танкова, дм Защитата на дисертационния труд ще се състои на.. от..часа в залата на НЦРРЗ, ул. Георги Софийски 3, сграда 7, София. Материалите по защитата са на разположение в отдел Научно-учебен на НЦРРЗ. 2

3 Съдържание УВОД... 4 ЦЕЛ И ЗАДАЧИ НА ДИСЕРТАЦИЯТА... 5 МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ... 6 РЕЗУЛТАТИ Анализ и сравнение на възпалителния отговор в професионално облъчена и контролна група Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина TNFα в кръвната плазма Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина IL-6 в кръвна плазма Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина IL-8 в кръвна плазма Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина IL-10 в кръвна плазма Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина MCP-1 в кръвна плазма Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по антиоксидантна активност на кръвна плазма (ТАS) Връзка между нивата на цитокините и TAS Радиационно-индуциран възпалителeн отговор след in vitro облъчване на периферни мононуклеарни клетки Комбиниран ефект на in vitro облъчване и бактериално-индуцирано възпаление върху секрецията на цитокини от периферни мононуклеарни клетки ДИСКУСИЯ Радиационно-индуциран възпалителен отговор, изследван при професионално облъчени с ниски дози ЙЛ работници от АЕЦ Козлодуй Антиоксидантната клетъчна защита като фактор за възпалителния отговор, оценен по нива на цитокини Зависимост на плазмените нива на цитокините от общоприети рискови фактори за здравето като възраст и хипертония Ефект на in vitro облъчване върху секрецията на цитокини от периферни мононуклеарни клетки Комбиниран ефект на in vitro облъчване и индуцирано възпаление върху секрецията на IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 от периферни мононуклеарни клетки ИЗВОДИ ПРИНОСИ НАУЧНИ ПУБЛИКАЦИИ УЧАСТИЯ В КОНФЕРЕНЦИИ ЛИТЕРАТУРА Summary

4 УВОД Йонизиращите лъчения (ЙЛ) могат да окажат както про-възпалително, така и анти-възпалително въздействие на клетъчно ниво. Под влияние на ЙЛ се активират транскрипционни фактори, които могат да модулират експресията на про- и анти-възпалителните цитокини, поради което тези протеини са подходящи и информативни молекулни маркери за радиационно-индуцирани ефекти. Цитокините са малки протеини, които участват в широк кръг важни клетъчни процеси, между които възпалителният и имунният отговор заемат централно място. Секрецията и активността на тези протеини са строго индивидуални, зависят от здравословното състояние и могат да бъдат съществено повлияни от голям брой фактори като възраст, пол, физическа активност, състояния на стрес, хранителни и други навици. Поради това те са подходящи молекулни маркери за охарактеризиране на индивидуалната лъчечувствителност при облъчване по професионални и/или медицински причини. Първата част на настоящото изследване представлява молекулярно епидемиологичен анализ, който има за цел да охарактеризира индивидуалния възпалителен отговор на работници от персонала на АЕЦ Козлодуй, професионално изложени на облъчване с ниски дози, като важен показател за индивидуалната лъчечувствителност. За целта са анализирани плазмените нива на панел от цитокини и хемокини, подходящи за охарактеризирането на радиационно-индуцирани промени, свързани с възпалителния и имунния отговор. Хроничното облъчване с ниски дози може да наруши клетъчния редокс баланс и да индуцира хроничен оксидантен стрес, поради което антиоксидантният клетъчен отговор също има важно значение за индивидуалната лъчечувствителност. Този фактор също беше изследван и беше анализирана евентуална връзка между стойностите на антиоксидантната активност на кръвната плазма и плазмените нива на цитокините. Клетките, върху които ЙЛ могат да окажат съществено влияние, са клетките на кръвоносната система. Те са силно лъчечувствителни и секретираните от тях молекули могат да окажат съществено влияние върху редица важни клетки в организма. Тези причини бяха основанието да изследваме ефектите на ЙЛ върху секрецията на възпалителни цитокини от мононуклеарни клетки, изолирани от периферна кръв. Известно е, че бактериалните инфекции могат да индуцират възпалителни процеси, които да модифицират радиационния отговор на молекулно и клетъчно ниво. Това ни накара да изследваме комбинирания ефект от предварително-индуцирано възпаление от бактериалния ендотоксин Липополизахарид (LPS) и in vitro облъчване на кръвните клетки, като анализирахме промените в нивата на секретираните от тях цитокини. Тези изследвания са включени във втората част на дисертационния труд, посветена на ефектите на ЙЛ и комбинацията от бактериално-индуцирано възпаление и ЙЛ върху възпалителния отговор на човешки кръвни клетки. 4

5 ЦЕЛ И ЗАДАЧИ НА ДИСЕРТАЦИЯТА Основната цел на дисертационния труд е да анализира радиационноиндуцирания възпалителен отговор по нива на цитокини и хемокини и да се изследва влиянието на ниски дози ЙЛ върху възпалителния отговор на професионално облъчени лица от АЕЦ Козлодуй. За осъществяване на тази цел бяха поставени следните задачи: 1. Въвеждане на имунохимичен метод (ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay-Ензимно-свързан имунохимичен анализ), подходящ за количествен анализ на протеинови нива на цитокините IL-6, IL-8, IL- 10, TNFα и MCP-1, като молекулни маркери за възпалителен отговор. 2. Радиационно-индуциран възпалителен отговор при професионално облъчени работници от АЕЦ Козлодуй, анализиран по плазмените нива на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP Ефект на хронично облъчване с ниски дози ЙЛ върху антиоксидантния статус на кръвна плазма (ТАS) и изследване на потенциалната връзка между антиоксидантен и възпалителен отговор при професионално облъчени лица. 4. Ефект на in vitro облъчване върху секрецията на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 от човешки периферни мононуклеарни клетки. 5. Комбиниран ефект на in vitro облъчване и бактериално-индуцирано възпаление върху секрецията на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 от човешки периферни мононуклеарни клетки. 5

6 МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 1. Радиационно-индуциран възпалителен и антиоксидантен отговор при професионално облъчени работници от АЕЦ Козлодуй и необлъчени контроли Дизайн на изследването и формиране на групите. В изследването бяха включени две групи: облъчена от 33ма професионално облъчени с ниски дози работника от АЕЦ Козлодуй с кумулирани дози в интервала от 0.11 до msv и контролна от 42 лица, за които няма данни за професионално облъчване. Участниците в двете групи са мъже, сравними по възраст, медицинско облъчване, социален статус и навици като тютюнопушене и употреба на алкохол Изолиране на плазма от периферна кръв на изследваните лица Колориметрично определяне на антиоксидантна активност на плазма (ТАS) Имунохимичен анализ (ELISA) на плазмените нива на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP Статистически анализ на експерименталните данни 2. Нива на екзогенни цитокини, секретирани от in vitro облъчени периферни мононуклеарни клетки. Ефект на бактериално-индуцирано възпаление върху секрецията на цитокини от облъчени и необлъчени клетки Изолиране на мононуклеарни клетки от периферна кръв Облъчване на клетките с 0.5 или 3 Gy гама ЙЛ (мощност на дозата 0.5 Gy/min) Имунохимичен анализ (ELISA) на екстрацелуларните нива на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 в клетъчна супернатанта 20 мин и 24 часа след облъчването на клетките Определяне на оптималната концентрация на LPS, която може да за индуцира възпалителен отговор в периферни мононуклеарни клетки Имунохимичен анализ (ELISA) на екстрацелуларните нива на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 след стимулиране на мононуклеарните клетки с LPS в продължение на 4 часа и in vitro облъчването им с 0.5 или 3 Gy гама ЙЛ (мощност на дозата 0.5 Gy/min) Статистически анализ на данните. 6

7 РЕЗУЛТАТИ 1. Анализ и сравнение на възпалителния отговор в професионално облъчена и контролна група За охарактеризиране на възпалителния отговор на професионално облъчени с ниски дози работници от АЕЦ Козлодуй беше проведен молекулярно епидемиологичен анализ и бяха сравнени протеиновите нива на цитокините TNFα, IL-6, IL-10 и хемокините IL-8 и MCP-1 в кръвна плазма, изолирана от периферна кръв на облъчените професионално лица и необлъчените контроли. В облъчената група бяха включени 33ма клинично здрави работници от АЕЦ Козлодуй със средна възраст 44.5 години и кумулирани дози в интервала от 0.11 msv до msv. Участниците в контролната група бяха 42ма клинично здрави, необлъчени лица, със средна възраст 46.9 години. Лицата в двете изследвани групи са сравнително хомогенни по показатели като медицинско облъчване, тютюнопушене и употреба на алкохол. За анализ и сравнения на получените стойности за протеиновите нива на TNFα, IL-6, IL-10, IL-8 и MCP-1 в кръвните проби на лицата от облъчената и контролната група беше използван непараметричния метод на Ман-Уитни, а при сравнението на повече от две групи, образувани след допълнително разделяне на двете основни групи на подгрупи по възраст или кумулирана доза, беше използван теста на Крускал-Уолис и Тъки тест за определяне на достоверни разлики (p<0.05). За целите на статистическата обработка на резултатите, всяка стойност, която беше по-ниска от долната гранична стойност, която можеше да бъде определена с приложения от нас имунохимичен метод и не можеше да бъде експериментално отчетена, беше заменена с константа, чиято стойност определихме като разделихме на 2 долната гранична стойност за всеки от изследваните цитокини. Така бяха получени следните константи: 1.42 pg/ml за IL-6, IL-8 и IL-10; 2.8 pg/ml за TNFα и 4.96 pg/ml за MCP-1. По този начин стойностите, получени за съответните цитокини, които бяха под долната граница на детекция, бяха заменени с изчислените константи и това допринесе за по-достоверната статистическа обработка на получените резултати. Общоприети референтни нива за изследваните цитокини в здрава популация не са установени и публикувани. Това наложи определяне на референтни граници за целите на настоящото изследване. За целта използвахме получените от нас данни за нивата на цитокините на контролната група. Стойностите за всеки про-възпалителен цитокин на контролите бяха разделени на четири равни части. За нива в норма бяха приети първите три четвъртини от стойностите. Най-високите стойности, които попадат в останалата една четвърт, бяха счетени за стойности над нормата. По този начин беше определено, че стойностите >9.65 pg/ml за IL-6, >10.9 pg/ml за IL-8, >5.5 pg/ml за TNFα и >193 pg/ml за MCP-1, са по-високи от референтните. Единствено за анти-възпалителния IL-10 за нормални бяха приети стойности 7

8 от втората, третата и четвъртата четвъртина на контролната група, а тези от първата четвърт с най-ниските експериментални данни, под 6.5 pg/ml, бяха счетени за стойности под нормата. По този начин 25% от контролите бяха с високи, извън норма нива на про-възпалителните цитокини IL-6, IL-8, TNFα и MCP-1 и 25% с ниски, извън референтната граница нива на анти-възпалителния цитокин IL Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина TNFα в кръвната плазма Измерените в настоящето изследване стойности за протеиновите нива на цитокина TNFα бяха над референтната стойност от 5.5 pg/ml при 25% от лицата, включени в контролната група и при 55% от работниците, включени в облъчената група. Сравнението на облъчената и контролната група по нива на TNFα показа статистически достоверна разлика между двете групи (р<0.05). По-високите стойности на TNFα, измерени за професионално облъчените работници са индикация за повишен риск от възпаление в тази група. За попрецизно изследване на влиянието на кумулираната доза върху стойностите на цитокина TNFα облъчената група беше разделена на две подгрупи, като едната от тях включваше лица с много ниски кумулирани дози, които не надвишават 50 msv включително (означена като msv на фигура ), а втората подгрупа беше съставена от лица с кумулирани дози над 50 msv, т.е. от 50 до msv и беше означена като msv на същата фигура. Сравнението на контролната група с тези две подгрупи на облъчената група с помощта на статистическия тест на Крускал-Уолис не показа статистически достоверна разлика, въпреки че такава беше установена при сравнението на контролната група с цялата облъчена група, означена като msv на фигура (р<0.05). Предположението за повишен възпалителен статус на работниците в резултат от хроничното им облъчване с ниски дози ЙЛ, беше потвърдено и от изследването за корелация на стойностите за протеиновите нива на TNFα и кумулираната доза на работниците. Линейният регресионен анализ на данните установи статистически значима връзка между експериментално получените стойности за нивата на TNFα и дозата, кумулирана по време на трудовия стаж на работниците, р=0.03 (Фигура ). Анализът показа, че протеиновите нива на TNFα като про-възпалителен маркер, нарастват с увеличаване на дозата, което е индикатор за повишена вероятност от радиационно-индуциран възпалителен отговор. Освен дозовото натоварване, възрастта също би могла да бъде фактор, който оказва влияние върху плазмените нива на TNFα. С цел по-детайлно изследване на зависимостта на нивата на TNFα от възрастта на изследваните лица, контролите и облъчените лица бяха разделени в две възрастови подгрупи с условна граница от 46 години. Сравнението на отделните възрастови подгрупи с помощта на теста на Крускал-Уолис не показа статистически достоверна разлика между подгрупите. 8

9 TNF alpha, pg/ml Кумулирана доза, msv Фигура Зависимост на нивата на TNFα от кумулираната доза. Облъчената група е представена като една обща група ( msv) и като две подгрупи, едната от които включва работници с кумулирани дози под 50 msv ( msv), а втората работници с повисоки от 50 msv ( msv) дози. *р< Фигура Линеен регресионен анализ на нива на TNFα като функция от кумулираната доза, р=0.03 (наклон 0.10; отрез от ординатата 6.74). С цел изследване на зависимостта на нивата на TNFα от възрастта на лицата, контролите и облъчените лица бяха разделени в две възрастови подгрупи с условна граница от 46 години. Сравнението на отделните възрастови подгрупи, с помощта на теста на Крускал-Уолис, не показа достоверна разлика между подгрупите. Комбинираният ефект на възраст и кумулирана доза беше изследван като контролната и облъчената група бяха разделени на подгрупи по възраст, под и над 46 години, а облъчената група и по кумулирана доза, под и над 50 msv. По този начин бяха оформени шест подгрупи, две от които включваха контроли и четири от професионално облъчени лица. Сравнението на шестте подгрупи с помощта на Крускал-Уолис теста не установи статистически достоверни различия между отделните подгрупи Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина IL-6 в кръвна плазма Измерените протеинови нива на IL-6 за повечето лица от облъчената група бяха по-ниски от референтната граница от 9.6 pg/ml. Само за пет човека, (15%) от всички работници, включени в облъчената група, бяха намерени повисоки нива на IL-6 от референтната стойност, докато в контролната група лицата с повишени нива бяха 25%. Сравнението на двете изследвани групи по нива на IL-6 не установи статистически достоверни разлики между групите. Всички останали анализи на експерименталните данни, при които беше изследвана вероятна зависимост на цитокина от дозата, кумулирана по време на работа в среда на ЙЛ и/или възрастта на изследваните лица, също не показаха статистически достоверни разлики между облъчената и контролната група.

10 1.3. Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина IL-8 в кръвна плазма Сравнението на облъчената и контролната група по нива на IL-8 не установи статистически достоверни разлики между групите (р=0.067). Лицата в контролната група, за които бяха намерени повишени нива на IL-8 над референтната граница от 10.7 pg/ml представляваха 25% и бяха значително повече от тези в облъчената група, които съставляват 6%. Анализите на експерименталните данни, които имаха за цел да установят вероятна зависимост на IL-8 от кумулираната доза и/или възрастта на изследваните лица, също не показаха статистически достоверни разлики между облъчената и контролната група Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина IL-10 в кръвна плазма Сравнението на облъчената и контролната група по плазмени нива на антивъзпалителния IL-10 показа статистически достоверна разлика между групите, р<0.001 (Фигура 1.4.1). При значително по-висок брой на работници от АЕЦ, 25 (76%) бяха намерени понижени, под референтната граница нива на IL-10 в сравнение с контролите, за които бяха отчетени стойности на IL-10 под референтната граница от 6.5 pg/ml при 10 човека (25%). Като се вземе предвид факта, че IL-10 е анти-възпалителен цитокин, по-ниските нива, които бяха определени за лицата от облъчената група, могат да се считат за индикация за повишен риск от възпалителни процеси в резултат от хроничното облъчване с ниски дози предимно гама лъчи. Достоверни различия бяха установени и при сравнението на двете подгрупи, образувани по кумулирана доза под или над 50 msv, с контролната група (Фигура 1.4.1). Въз основа на тези резултати може да се предположи, че лицата, облъчени с ниски дози ЙЛ по професионални причини, секретират по-големи количества про-възпалителни цитокини, докато секрецията на анти-възпалителния IL-10 е редуцирана. Линейният регресионен анализ за евентуална корелация на протеиновите нивата на IL-10 с кумулираната доза показа статистически значима връзка между нивата на IL-10 и кумулираната доза, р=0.004 (Фигура ). Наблюдава се значително понижение на нивата на IL-10 с увеличаване на дозата, което потвърждава извода за вероятност от радиационно-индуцирано понижение на анти-възпалителния отговор на професионално облъчените лица. 10

11 50 40 IL-10, pg/ml Кумулирана доза, msv Фигура Зависимост на нивата на IL-10 от кумулираната доза. Облъчената група е представена като една обща група ( msv) и като две подгрупи, едната от които включва работници с кумулирани дози под 50 msv ( msv), а втората работници с повисоки от 50 msv ( msv) дози. * p<0.05; **p<0.01; ***p< Фигура Линеен регресионен анализ на нивата на IL-10 като функция от кумулираната доза, р=0.004 (наклон , отрез от ординатата 8.85). Сравнението на нивата на IL-10 във възрастови подгрупи на контролната и на облъчената група, формирани от лица по-млади или по-възрастни от 46 години, с помощта на теста на Крускал-Уолис показа, че има статистически достоверни разлики между възрастовите подгрупи (р=0,001, Фигура ). За да бъдат идентифицирани подгрупите, между които може да бъде установена достоверна разлика беше приложен теста на Тъки. Бяха установени статистически значими разлики между облъчената група от лица по-възрастни от 46 години и двете контролни групи, съответно от лица по-възрастни (р=0.036) и по-млади от 46 години (р=0.004). Комбинираното влияние на възрастта и кумулираната доза върху нивата на IL-10, изследвано в шест подгрупи, също показа статистически достоверни разлики между отделните подгрупи, р<0.001 (Фигура ). С Тъки тест бяха идентифицирани отделните подгрупи, за които бяха установени статистически значими разлики. Такива бяха контролната подгрупа от лица под 46 години и облъчените подгрупи от работници над 46 години с ниски кумулирани дози под 50 msv (р=0.029) и тези под 46 години с по-високи кумулирани дози, надвишаващи 50 msv (р=0.039). 11

12 IL-10, pg/ml # /# IL-10, pg/ml /# # 0 0 Контролна група <46г. Контролна група >46г. Облъчена група <46г. Облъчена група >46г. Фигура Сравнение на нивата на IL-10 (pg/ml) във възрастовите подгрупи от облъчени и контроли под и над от 46 години, р< статистически достоверна разлика между контроли под 46 г. (<46г.) и облъчената подгрупа от лица над 46 г. (>46г); # - статистически достоверна разлика между контроли над 46 г. (>46) г. и лица от облъчената подгрупа, също над 46 г. (>46г.). Контролна група <46 г. Контролна група >46 г. Облъчена група >46 г., <50mSv Облъчена група <46 г., <50 msv Облъчена група <46 г., >50 msv Облъчена група >46 г., >50 msv Фигура Комбиниран ефект на възраст и професионално облъчване с ниски дози ЙЛ върху нивата на IL-10 (pg/ml), р< статистически достоверна разлика между контроли под 46 години и облъчената подгрупа от лица над 46 години с кумулирани дози под 50 msv; # - статистически достоверна разлика между контроли под 46 години и облъчената подгрупа от лица над 46 години с кумулирани дози над 50 msv. За осем от работниците от облъчената група (24%) и 14 човека от контролната група (33%) имаше данни за повишено кръвно налягане. Всички облъчени и контроли с повишено кръвно налягане бяха обединени в една група, а останалите лицата с нормално кръвно налягане бяха включени във втора група. При сравнението на тези две групи по нива на IL-10 беше установено, че те се различават статистически достоверно (Фигура ). Интересен е фактът, че лицата с хипертония секретират значително по-големи количества IL-10, както и това, че за четири от осем професионално облъчени лица с хипертония, бяха измерени ниски нива на IL-10, сравними със стойностите на същия цитокин, измерени за 19 от общо 25 рабтници от АЕЦ с нормално кръвно налягане. Това би могло да бъде индикация за съществуването на вероятен компенсаторен механизъм при професионално облъчените лица, какъвто не е установен при необлъчените контроли. 12

13 Фигура Сравнително изследване на нивата на IL-10, измерени в група с високо кръвно налягане и група с нормално кръвно налягане лица. Лицата от облъчената група са означени със запълнени символи, а лицата от контролната група, с празни символи. *р< Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по протеинови нива на цитокина MCP-1 в кръвна плазма Сравнението на облъчената и контролна група по плазмени нива на протеина MCP-1 показа значително по-високи нива на MCP-1 в облъчената група в сравнение с тези на контролната група (Фигура 1.5.1). За 76% от всички работници от АЕЦ стойностите за MCP-1 бяха по-високи от референтната граница от 193 pg/ml в сравнение с 25% от участниците в контролната група. Трикратно по-високият брой лица в облъчената група с по-високи от референтната граница стойности на MCP-1, са индикатор за повишена вероятност от възпалителни процеси в резултат от хронично облъчване с ниски дози ЙЛ. Анализът на дозовите ефекти върху нивата на MCP-1 (Фигура 1.5.1) също показа статистически достоверни разлики между контролната и всяка от облъчените групи, с дози под и над 50 msv. Този резултат означава, че много ниски дози хронично облъчване биха могли да стимулират секрецията на МСР- 1. Корелацията на протеиновите нивата на MCP-1 с кумулираната доза беше потвърдена и с линеен регресионен анализ, който също показа статистически значима връзка между експериментално измерените нива на MCP-1 и кумулираната доза, р=0.005 (Фигура ). Този резултат потвърждава погорния извод за повишена вероятност от възпалителни процеси с повишаване на кумулираните дози на работниците. Освен хроничното облъчване, възрастта на изследваните лица също беше изследвана като фактор, който може да окаже ефект върху плазмените нива на MCP-1. Както се вижда на фигура , анализът на възрастовите подгрупи по нива на МСР-1 с теста на Крускал-Уолис показа, че двете контролни подгрупи статистически достоверно се различават от двете облъчени подгрупи (р<0.001). С помощта на Тъки тест беше установено, че достоверни разлики се наблюдават както между контролната подгрупа от лица на възраст под 46 години и двете облъчени подгрупи, по-млади (р=0.02) или по-възрастни от 46 години (р=0.0001), така и между контролната подгрупа от лица, по-възрастни от 46 години и двете облъчени подгрупи от работници под (р=0.02) и над 46 години (р=0.0002). 13

14 MCP-1, pg/ml Кумулирана доза, msv Фигура Зависимост на нивата на MCP-1 от кумулираната доза. Облъчената група е представена като една обща група ( msv) и като две подгрупи, едната от които включва работници с кумулирани дози под 50 msv ( msv), а втората работници с повисоки от 50 msv ( msv) дози. *p<0.001; **p< Фигура Линеен регресионен анализ на нивата на MCP-1 като функция от кумулираната доза, р=0.005 (наклон 1.20; отрез от ординатата ). Комбинираният ефект на възрастта и професионалното облъчване върху плазмените нива на MCP-1 също беше изследван след формиране на шест подгрупи, които включват две подгрупи от контроли, под и над 46 години и четири подгрупи от професионално облъчени работници, също под и над 46 години, с кумулирани дози по-ниски или по-високи от 50 msv. Сравнението на тези шест подгрупи с помощта на Крускал-Уолис тест показа статистически достоверни различия между отделните подгрупи, р<0.001 (Фигура ). С помощта на Тъки тест беше установено, че съществени разлики в нивата на МСР-1 има между контролната подгрупа от лица под 46 години и облъчената подгрупа от работници по-възрастни от 46 години с кумулирани дози над 50 msv (р=0.02), както и между контролната подгрупа от по-възрастни от 46 години лица и двете облъчени подгрупи по-възрастни от 46 години с кумулирани дози под 50 msv (р=0.03) и тези с дози над 50 msv (р=0.002). Тези резултати потвърдиха извода, че вероятността от възпалителни процеси при повъзрастните работници е по-висока в сравнение с необлъчените контроли. 14

15 MCP-1, pg/ml /ǂ #/ʘ /# ǂ/ʘ MCP-1, pg/ml #/ǂ # /ǂ 0 0 Контролна група <46г. Контролна група >46г. Облъчена група <46г. Облъчена група >46г. Фигура Сравнение на нивата на MCP-1 (pg/ml) във възрастови подгрупи от облъчени и контроли под и над 46 години, р< статистически достоверна разлика между контролната и облъчената подгрупа, под 46 г. (<46г.); ǂ - статистически достоверна разлика между контроли под 46 г. (<46 г.) и облъчена подгрупа от лица над 46 г. (>46г.); # - статистически достоверна разлика между контроли под 46 г. (>46 г.) и облъчената подгрупа от лица под 46 г. (<46г.); ʘ - статистически достоверна разлика между контролната и облъчената подгрупа от лица над 46 г. (>46 г.). Контролна група <46 г. Контролна група >46 г. Облъчена група >46 г., <50mSv Облъчена група <46 г., <50 msv Облъчена група >46 г., >50 msv Облъчена група <46 г., >50 msv Фигура Комбиниран ефект на възраст и професионално облъчване с ниски дози ЙЛ върху нивата на MCP-1 (pg/ml), р< статистически достоверна разлика между контроли под 46 години (<46 г.) и облъчената подгрупа от лица над 46 години (>46г.) с кумулирани дози над 50 msv (>50 msv); # - статистически достоверна разлика между контроли над 46 г.(>46 г.) и облъчената подгрупа от лица над 46 г. (>46г.) с кумулирани дози, които под 50 msv (<50 msv); ǂ - статистически достоверна разлика между контроли над 46 г.(>46 г.) и облъчени лица над 46 г. (>46г.) с кумулирани дози над 50 msv (>50 msv). 2. Анализ и сравнение на облъчената и контролната група по антиоксидантна активност на кръвна плазма (ТАS) Хроничното облъчване с ниски дози предимно гама ЙЛ може да наруши клетъчния редокс баланс и да индуцира хроничен оксидантен стрес, поради което антиоксидантният отговор на клетъчно и молекулно ниво има важно значение за индивидуалната лъчечувствителност. Плазмените нива на параметъра антиоксидантна активност на кръвната плазма (ТАS) са подходящ биомаркер за индивидуалната антиоксидантна клетъчна защита, определящ фактор за индивидуалния отговор към радиационно въздействие. Ефектите на ниски дози ЙЛ върху клетъчния редокс баланс бяха изследвани по плазмените нива на TAS в облъчената група от 33 работника и в контролна група от 20 необлъчени лица, част от контролната група, избрани на случаен принцип. 15

16 За определяне на референтни граници на изследвания показател за българската популация, бяха използвани данните за TAS, получени за 167 лица от югозападна България. Резултатите бяха разделени на четири четвъртини и за нормални, референтни нива бяха определени стойностите на TAS от втората и третата четвъртина. Тези от първата четвъртина, с най-ниски стойности бяха счетени за по-ниски от нормалните, а стойностите от последната четвъртина бяха определени за по-високи от референтните нива. По-този начин като референтни граници, за региона на югозападна България, бяха приети стойности за ТАS в диапазон от 1.39 до 2.22 mmol/l. Сравнението на двете изследвани групи по нива на TAS показа, че докато стойностите на TAS в контролната група попадат в референтните граници, за 17 човека от облъчената група (52%) те надвишават горната граница от 2.22 mmol/l. Този резултат може да бъде интерпретиран като повишена антиоксидантна защита на клетъчно ниво, стимулирана от хроничното въздействие с ниски дози ЙЛ. Разлика между облъчената и контролна група беше достоверна (р<0.001) и беше регистрирана както при сравнението на контролната група с цялата облъчена група, така и с двете облъчени подгрупи (Фигура 2.1.). Анализът на нивата на TAS като функция от възрастта на изследваните лица показа достоверни разлики между контролната подгрупа от лица под 46 години и облъчената подгрупа от лица под 46 години (р=0.02) и над 46 години (р=0.0001), както и между по-възрастната контролна подгрупа и двете облъчени подгрупи от работници по-млади (р=0.02) или по-възрастни от 46 г. (р=0.0002) (Фигура 2.2.). Фигура 2.1. Зависимост на нивата на TAS от кумулираната доза. Облъчената група е представена като една обща група ( msv) и като две подгрупи, едната от които включва работници с кумулирани дози под 50 msv ( msv), а втората работници с по-високи от 50 msv ( msv) дози. *p<0.001 и **p<

17 TAS mmol/l 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 Контролна група <46г. /ǂ Контролна група >46г. #/ʘ Облъчена група <46г. /# Облъчена група >46г. ǂ/ʘ 3. Връзка между нивата на цитокините и TAS Фигура 2.2. Сравнение на нивата на TAS (mmol/l) във възрастови подгрупи от облъчени и контроли под и над 46 години (р<0.001). - статистически достоверна разлика между контроли под 46г. (<46г.) и работници също под 46г. (<46г.); ǂ - статистически достоверна разлика между контроли под 46г. (<46г.) и работници над 46г. (>46г.); # - статистически достоверна разлика между контроли над 46г. (>46г.) и работници под 46г. (<46г.); ʘ - статистически достоверна разлика между контролната и облъчената подгрупа с лица над 46г (>46г.). От литературни източници е известно, че някой цитокини, между които са изследваните от нас TNFα и IL-6, могат да окажат съществено влияние върху експресията на други цитокини и по този начин да участват в регулацията на възпалителния отговор (Hayden and Ghosh, 2014, Hunter and Jones, 2015). Както вече беше отбелязано, за професионално облъчените работници беше установено повишение в плазмените нива на TNFα. Поради това може да се предположи, че съществува вероятност, повишената секреция на TNFα да окаже ефект върху секрецията и на други цитокини, обект на това изследване. За да изследваме тази вероятност контролната и облъчената група бяха разделени на подгрупи в зависимост от нивата на TNFα, като за гранична стойност беше приета референтната граница от 5.5 pg/ml, определена за TNFα. Тези подгрупи бяха сравнени по нива на MCP-1, IL-6 и IL-10, изчислени за лицата от съответните подгрупи. Резултатите показаха, че за облъчената група нивата на MCP-1 и IL-6 не зависят от стойностите за TNFα, докато за контролната подгрупа от лица с повишени нива на TNFα, бяха намерени също така и по-високи стойности за нивата за MCP-1 и IL-6. Сравнението на TNFα подгрупите показа статистически значима разлика единствено за нивата на MCP-1, определени между двете облъчени подгрупи с TNFα нива в норма (<5.5 pg/ml) или над норма (>5.5 pg/ml) и контролната подгрупа с TNFα нива по-ниски от 5.5 pg/ml (<5.5 pg/ml) (Фигура 3.1.А). Сравнението на TNFα подгрупите по нива на IL-10 (Фигура 3.1.Б) показа, че тези подгрупи не се различават в рамките на контролната или облъчената група. Статистически достоверни разлики бяха намерени обаче между отделните подгрупи като всяка контролна TNFα подгрупа се различаваше съществено от всяка облъчена TNFα подгрупа (Фигура 3.1.Б). 17

18 А Б Фигура 3.1. Корелация на нивата на TNFα с нивата на MCP-1 (А) и IL-10 (Б). Контролната и облъчената група бяха разделени на подгрупи в зависимост от нивата на TNFα, с гранична стойност от 5.5 pg/ml, които бяха сравнени по нива на МСР-1 и IL-10. * p<0.05; ***p<0.001; ****p< За изследване на вероятна корелация между нивата на IL-10 и MCP-1 бяха формирани четири подгрупи от контролни и облъчени лица по нива на IL-10 с гранична стойност 6.5 pg/ml, която е референтната граница определена за IL-10. Статистически достоверни разлики между нивата на MCP-1 в двете подгрупи на контролите и облъчените лица не бяха установени (Фигура 3.2.), но такива бяха регистрирани при сравнението на контролната подгрупа с нива на IL-10 >6.5 pg/ml и двете облъчени подгрупи с нива на IL-10 по-високи (>6.5 pg/ml) или по-ниски (<6.5 pg/ml) от приетата граница от 6.5 pg/ml, както и между контролната подгрупа с нива на IL-10 по-ниски от 6.5 pg/ml (<6.5 pg/ml) и облъчената подгрупа също с нива на IL-10 по-ниски от 6.5 pg/ml (<6.5 pg/ml). Интересен е фактът, че разпределението на нивата на МСР-1 е почти идентично, независимо от това дали те са изследвани по отношение на TNFα или по отношение на IL-10 (Фигури 3.1.А и 3.2.). От този резултат може да се предположи, че въздействието на про-възпалителния цитокин MCP-1 е независимо от останалите изследвани цитокини, отговорни за възпалителния профил на изследваните лица. 18

19 Фигура 3.2. Корелация между нивата на IL-10 с нивата на MCP-1. Контролната и облъчената група бяха разделени на подгрупи в зависимост от нивата на IL-10, с гранична стойност от 6.5 pg/ml, които бяха сравнени по нивата на МСР-1. * p<0.05; **p< Евентуална зависимост между възпалителния и антиоксидантния клетъчен отговор беше анализиран като нивата на цитокините IL-10 и MCP-1 бяха изследвани като функция от нивата на ТАS. Двата цитокина показаха достоверно понижение и повишение съответно при професионално облъчени лица с нормални нива на TAS, по-ниски от 2.22 mmol/l (Фигури 3.4.А и Б). За целта лицата от облъчената група бяха разделени на две подгрупи, едната от които включваше работници с нормални нива на TAS (<2.22 mmol/l), а другата беше съставена от работници, за които бяха измерени стойности на TAS над горната референтна граница от 2.22 mmol/l ( 2.22 mmol/l). За контролите, както вече беше споменато, бяха измерени нива на TAS в референтните граници и тази група също беше означена като <2.22 mmol/l. Прави впечатление силната корелация между параметрите TAS и MCP-1 (Фигура 3.4.Б). Този резултат ясно показва, че професионалното хронично облъчване може да индуцира съществено повишение в нивата на МСР-1, независимо от антиоксидантния клетъчен отговор. Сравнението на контролната група с облъчената подгрупа, за която нивата на TAS бяха в норма по нива на IL-10 (Фигура 3.4.А) показа, че независимо от нормалните нива на TAS за тези групи, при професионално облъчените лица са регистрирани значително по-ниски стойности на IL-10. Разликата между двете групи е статистически достоверна (p<0.01) и може да се интерпретира като показател за радиационно-индуцирано понижение на антивъзпалителния отговор. Това е поредното доказателство, че професионалното облъчване с ниски дози ЙЛ може да повлияе и модифицира възпалителния отговор. Интересно е да се отбележи, че медианите и на двете облъчени подгрупи с нива на TAS, по-ниски или по-високи от горната референтна граница от 2.22 mmol/l, бяха с по-ниски стойности от медианата на контролата. Това показва, че ЙЛ може да редуцира анти-възпалителния клетъчен капацитет, независимо от антиоксидантния статус на изследваните лица. 19

20 А Б Фигура 3.4. Корелация на нивата на IL-10 (А) и MCP-1 (Б) с нивата на TAS. Сравнение на контролната група от лица с нива на TAS в норма с двете облъчени подгрупи, формирани в зависимост от TAS нивата, които бяха в норма (<2.22 mmol/l) или надвишаваха референтната граница (>2.22 mmol/l) по нива на MCP-1. * p < 0.05; **p < Радиационно-индуциран възпалителeн отговор след in vitro облъчване на периферни мононуклеарни клетки За изследване на радиационно-индуцирани промени във възпалителния отговор, бяха изследвани нивата на цитокини TNFα, IL-6, IL-8, IL-10 и MCP-1 от периферни мононуклеарни клетки, 20 мин или 24 часа след in vitro облъчване с 0.5 или 3 Gy гама ЙЛ. Резултатите не показаха промени в секрецията на цитокините IL-6, IL-8 IL-10 и TNFα вследствие на облъчването, но беше установено натрупване на IL-6 и IL-8 с времето и 24 часа по-късно нивата на цитокините надвишаваха многократно тези, измерени 20 мин след облъчването. Протеиновите нива на IL-10 и TNFα, регистрирани 20 мин след облъчването на клетките, бяха приблизително еднакви с нивата им измерени 24 часа по-късно, независимо от това дали бяха облъчени с 0.5 или 3 Gy. Секрецията на MCP-1 от мононуклеарни клетки, облъчени in vitro и измерена 24 часа след облъчването, беше дозово-зависима (Фигура 4.1.). Сравнението на секретираните количества MCP-1 от необлъчените или облъчените с 0.5 или с 3 Gy гама ЙЛ клетки показа, че повишаването на дозата ЙЛ оказва по-силен редуциращ ефект върху секрецията на цитокина. Достоверна разлика беше регистрирана както между нивата на MCP-1, секретиран от необлъчените лимфоцити и тези, облъчени с 3 Gy, така и между нивата на MCP-1 секретирани от облъчените с 0.5 Gy или с 3 Gy (Фигура 4.1.). Като се вземе предвид факта, че този цитокин е молекулен маркер за възпалителен отговор, резултатът може да се интерпретира като радиационноиндуциран инхибиторен ефект на ЙЛ върху синтеза на МСР-1 в периферни кръвни клетки, а следователно и върху възпалителния клетъчен отговор. 20

21 MCP-1, pg/ml Contr 0.5Gy 3Gy * ** */** мин 24 часа Време Фигура 4.1. Сравнение на нивата на МСР-1, секретиран от необлъчени (контроли) и облъчени с 0.5 или 3 Gy клетки, измерени 20 мин или 24 часа след облъчването. * Статистически достоверна разлика между нивата на МСР-1, секретирани от облъчени с 3 Gy клетки и необлъчени клетки (контрола), р=0.006; ** Статистически достоверна разлика между нивата на МСР-1, секретирани от облъчените клетки с 3 Gy или с 0.5 Gy гама лъчи, р= Комбиниран ефект на in vitro облъчване и бактериално-индуцирано възпаление върху секрецията на цитокини от периферни мононуклеарни клетки Ефектът на бактериално-индуцирания възпалителен отговор върху радиационния отговор на клетъчно ниво беше изследван по промени в нивата на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1, секретирани от клетки, предварително стимулирани с LPS (20 pg/ml), а след това облъчени с 0.5 или 3 Gy гама ЙЛ. Нивата на изследваните цитокини бяха измерени 20 мин и 24 часа след in vitro облъчването на клетките. Радиационно-индуцирани промени в секрецията на цитокините IL-6, IL-8 и IL-10 не бяха установени. За разлика от IL-6, IL-8 и IL-10, секрецията на TNFα от периферни мононуклеарни клетки, стимулирани с LPS и облъчени, показа дозово-зависимо увеличение. Комбинацията от LPS и in vitro облъчване с 0.5 или с 3 Gy гама ЙЛ драстично повиши нивата на цитокина, съответно с около три и шест пъти и това повишение беше част от ранния радиационен отговор, измерен 20 мин след облъчването. 24 часа по-късно нивата на TNFα, секретиран от клетките, in vitro облъчени с 0.5 или с 3 Gy гама ЙЛ, бяха значително по-ниски, близки до тези, секретирани от необлъчените клетки (Фигура 5.1.). Вероятната хипотеза, която може да обясни този резултат се основава на споменатата вече сигнална и регулаторна роля на цитокина. TNFα, който беше измерен в екстрацелуларното пространство след облъчването на стимулираните с LPS клетки, най-вероятно се импортира обратно в клетките, за да вземе участие в регулацията на синтеза на други цитокини след активиране на NF-kB транскрипционния път (Hayden and Ghosh, 2014, Hunter and Jones, 2015) и това вероятно е причина за понижените нива, измерени 24 часа по-късно. 21

22 MCP-1, pg/ml TNF α, pg/ml */** LPS (no IR) LPS+0.5Gy LPS+3Gy * */** 0 20 мин Време 24 часа Фигура 5.1. Промени в секрецията на TNFα в периферни мононуклеарни клетки третирани с LPS и in vitro облъчени с 0.5 или 3 Gy гама ЙЛ. * Статистически достоверни разлики между необлъчени клетки, третирани с LPS и клетки, третирани с LPS и облъчени с 0.5 Gy (p=0.04) или 3 Gy (p=0.009); ** Статистически достоверни разлики между клетки, третирани с LPS и облъчени с 0,5 Gy или 3 Gy (p=0.03). За разлика от TNFα, който се натрупва много бързо след облъчване на стимулирани с LPS клетки, промените в нивата на MCP-1 бяха регистрирани 24 часа след облъчването с 3 Gy гама ЙЛ на третираните с LPS клетки (Фигура 5.2.). Достоверна разлика беше регистрирана между нивата на цитокина, секретиран от облъчените с 3 Gy клетки и тези облъчени с 0.5 Gy, както и от необлъчените клетки. Подобна зависимост на нивата на МСР-1 беше характерна и за секрецията на цитокина от нестимулирани с LPS клетки. Този резултат е доказателство за радиационно-индуцирано понижение на секрецията на МСР-1 и подчертава важната роля на ЙЛ за промените в нивата на този цитокин LPS (no IR) LPS+0.5Gy LPS+3Gy * ** */** мин Време 24 часа Фигура 5.2. Промени в секрецията на MCP-1 в периферни мононуклеарни клетки третирани с LPS и in vitro облъчени с 0.5 или 3 Gy гама ЙЛ. * Статистически достоверна разлика между клетки, третирани с LPS и облъчени с 3 Gy и необлъчени клетки третирани с LPS, 24 часа след облъчването на клетките; ** Статистически достоверна разлика между клетки, третирани с LPS и облъчени с 3 Gy и клетки третирани с LPS и облъчени с 0.5 Gy, 24 часа след облъчването им. 22

23 ДИСКУСИЯ 1. Радиационно-индуциран възпалителен отговор, изследван при професионално облъчени с ниски дози ЙЛ работници от АЕЦ Козлодуй Настоящето молекулярно епидемиологично проучване анализира и сравнява плазмените нива на пет цитокина: IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 в периферна кръв на група от 33 работника от АЕЦ Козлодуй и 42 необлъчени контроли, за да установи дали тези цитокини са подходящи молекулни маркери за радиационно-индуцирани промени във възпалителния отговор на клетъчно ниво. От литературни данни е известно, че ЙЛ могат да предизвикат съществени промени в експресията на про- и анти-възпалителни цитокини, което да индуцира възпалителен отговор и да доведе до сериозни последици, свързани с възникването и развитието на различни заболявания, включително и сърдечно-съдовите болести (Akbaraly et al., 2013). При сравнението на нивата на цитокините на лицата от облъчената група и от контролната група, за облъчената група бяха измерени по-високи нива на про-възпалителните цитокини MCP-1 и TNFα и по-ниски стойности за антивъзпалителния цитокин IL-10. Този резултат свидетелства за повишен възпалителен отговор, който най-вероятно е индуциран от хроничното професионално облъчване с ниски дози на работниците от АЕЦ Козлодуй. Стойностите за MCP-1 за облъчената група надвишаваха около пет пъти тези на контролната. Съществена разлика между двете групи, повече от четири пъти, беше установена и за нивата на анти-възпалителния цитокин IL-10. За този протеин в групата на професионално облъчените работници преобладаваха ниски стойности, което е индикация за понижена анти-възпалителна защита, най-вероятно като следствие от хроничното облъчване на работниците. Изводът се подкрепя и от измерените стойности за протеиновите нива на цитокина TNFα, за който бяха измерени стойности над референтна граница в плазмата на два пъти по-голям брой работници от АЕЦ, в сравнение с броя на контролите. Това също е индикация за повишен риск от радиационно-индуцирано възпаление за хората от облъчената група. В медицинската практика липсват клинични референтни нива за цитокините, което се дължи основно на факта, че в здрава популация нивата на тези протеини са силно вариабилни и могат да бъдат повлияни от редица фактори (Stowe et al., 2010). За целите на настоящия анализ, нормалните нива на цитокините IL-6, IL-8, IL-10, TNFα и MCP-1 бяха определени, като бяха взети предвид стойностите, получени за лицата от контролната група. 25% от най-високите стойности за про-възпалителните цитокини IL-6, IL-8, MCP-1 и TNFα бяха приети за по-високи от нормата, а за анти-възпалителния цитокин IL-10 25% от най-ниските стойности бяха счетени за извън нормата. Следователно, по дефиниция, за 25% от контролите нивата на IL-6, IL-8, MCP-1 и TNFα бяха по-високи от референтните стойности за тях и 25% от контролите бяха с по-ниски от референтната стойност за IL-10. Сравнението на облъчената 23

24 и контролна група показа, че за разлика от контролите, при които нивата на MCP-1 и TNFα надвишаваха референтните стойности при 25%, процентът на облъчените лица с по-високи нива на същите цитокини беше значително повисок - 76% и 50%, съответно. Освен това, за 76% от облъчените работници бяха определени и по-ниски нива на анти-възпалителния цитокин IL-10. Независимо от това, че за другите два изследвани про-възпалителни цитокина IL-6 и IL-8 не бяха установени достоверни различия между групите, експерименталните резултати позволяват да се направи извод за повишен възпалителен профил на работниците от ядрената електроцентрала. Повишената секреция на про-възпалителните цитокини MCP-1 и TNFα и ниските нива на анти-възпалителния цитокин IL-10, в сравнение с нивата на същите протеини в плазмата на контролите, са доказателство за радиационноиндуциран възпалителен отговор, най-вероятно в резултат от продължителното хронично облъчване на работниците с ниски дози ЙЛ. Изследвания са показали, че MCP-1 играе важна роля за адхезията на моноцити към стените на кръвоносните съдове и участва във формирането на атеросклеротични плаки и лезии (Gonzalez-Quesada and Frangogiannis, 2009). Показано е и участие на MCP-1 в дестабилизирането и ремоделирането на плаките след миокарден инфаркт. Тези резултати са предпоставка за охарактеризирането на MCP-1 като предклиничен маркер за сърдечно-съдови заболявания, в съгласие с данните и на други автори (Hayden and Ghosh, 2014), които показват, че цитокинът е свързан и с други заболявания на сърдечносъдовата система Има експериментални доказателства, че IL-10, за разлика от MCP-1, може да потисне активирането на моноцитите и макрофагите, индуцирано от възпалителни процеси, в резултат от транскрипционно инхибиране на някои про-възпалителни цитокини. По този начин IL-10 има важен принос за регулирането на възпалителния отговор и защитата от атеросклеротични заболявания на молекулно ниво (de Waal Malefyt et al., 1991). Понастоящем обаче липсват достатъчно убедителни доказателства, които да позволят IL-10 да бъде окачествен и общоприет като предклиничен маркер. Както вече беше споменато, TNFα може да участва в индукцията на редица стресови сигнални пътища, които да стимулират и засилят възпалителния отговор, свързан с повишена секреция на различни адхезионни молекули и възпалителни цитокини. Повишени нива на TNFα са установени за широк спектър от хронични възпалителни заболявания, между които са атеросклероза, сърдечна недостатъчност и Алцхаймер. Повишеният риск от възникване на здравни, възрастово-обусловени проблеми и увреждания, също се свързва с промени в нивата на този цитокин (de Gonzalo-Calvo et al., 2010). Както вече беше отбелязано, в настоящето изследване бяха измерени повишени стойности за плазмените нива и на двата про-възпалителни цитокина TNFα и MCP-1 за лица от облъчената група. Независимо от това обаче, беше установена слаба корелация между плазмените нива на тези два цитокина. Стойностите за нивата на MCP-1 не се различаваха значително между двете 24

25 подгрупи на облъчената група, в които бяха включени работници с нива на TNFα над референтната граница или работници с ниски, в норма нива на TNFα. Това на пръв поглед противоречие може да се обясни с установения от други автори факт, че експресията на някои цитокини, между които е и MCP-1, може да се повиши без съпътстващо повишение в ниватa на TNFα и това зависи от конкретния стресов фактор или механизъм, които се активират (Patrone et al., 2006). 2. Антиоксидантната клетъчна защита като фактор за възпалителния отговор, оценен по нива на цитокини Хроничното облъчване с ниски дози ЙЛ, характерно за работниците от АЕЦ Козлодуй, може да индуцира хроничен оксидантен стрес и трайно нарушение на равновесието между ендогенните нива на АФК в клетките и клетъчната антиоксидантна защита, което да предизвика съществени промени в клетъчния редокс баланс. Показано е, че редица заболявания като невродегенеративни (Halliwell, 2006), кардиоваскуларни (Aviram, 2000) и ревматоиден артрит (Hitchon and El-Gabalawy, 2004), са придружени от дисбаланс между оксидантния стрес и клетъчната антиоксидантна защита. Поради това данните за тотална антиоксидантна активност на кръвна плазма (TAS) представляват важен индикатор за индивидуалните възможности за преодоляване на радиационно-индуцирания оксидантен стрес. Референтните граници на TAS за население от югозападна България, определени експериментално от нас, включват стойности от 1.39 mmol/l до 2.22 mmol/l. Стойностите за TAS, които бяха измерени в кръвна плазма на половината от лицата в облъчената група бяха значително по-високи от горната референтна граница от 2.22 mmol/l, за разлика от тези на лицата от контролната група, за коитовсички стойности на TAS бяха в референтните граници. Сравнението на две подгрупи от облъчени лица, формирани в зависимост от стойностите на TAS - под или над референтната граница от 2.22 mmol/l с контролната група по нива на MCP-1 и IL-10 показа съществени различия между контролата и подгрупата от работници с нива на TAS в референтни граници, както и различия в плазмените нива на MCP-1 в двете облъчени подгрупи. Добре е да се отбележи, че за подгрупата, включваща облъчени лица с нива на TAS в референтни граници, стойностите за MCP-1 бяха значително по-високи от тези на контролите. Този резултат е в съгласие с експериментални резултати на други автори, които при изследвания на възпалителния статус и оксидантния стрес на пациенти със сърдечен синдром намират връзка между антиоксидантен капацитет и плазмените нива на MCP-1 (On et al., 2005). 3. Зависимост на плазмените нива на цитокините от общоприети рискови фактори за здравето като възраст и хипертония Литературни данни показват, че в резултат от възрастови изменения могат да настъпят значителни промени в нивата на цитокините (Akbaraly et al., 2013). Освен това има доказателства за връзката на редица хронични възпалителни процеси с типични старчески заболявания като диабет, 25