ДИНАМИКА НА РАЗВИТИЕТО И АНТИБИОТИЧНАТА АКТИВНОСТ НА BACILLUS SUBTILIS TS 01 В ДВЕ ОПТИМИЗИРАНИ ХРАНИТЕЛНИ СРЕДИ

ДИНАМИКА НА РАЗВИТИЕТО И АНТИБИОТИЧНАТА АКТИВНОСТ НА BACILLUS SUBTILIS TS 01 В ДВЕ ОПТИМИЗИРАНИ ХРАНИТЕЛНИ СРЕДИ Любка Кожухарова 1, Севдалина Тодорова 2 1 Университет по хранителни технологии, Пловдив, България 2 Русенски университет ''Ангел Кънчев'', Филиал Разград, Разград, България DYNAMICS OF THE DEVELOPMENT AND ANTIBIOTIC ACTIVITY OF BACILLUS SUBTILIS TS 01 IN TWO OPTIMIZED NUTRIENT MEDIA Lubka Kozhuharova 1, Sevdalina Todorova 2 1 University of Food Technologies, Plovdiv, Bulgaria 2 Ruse Angel Kanchev University, Razgrad Branch, Razgrad, Bulgaria Abstract The dynamics of the morphological condition, development and antibiotic activity of Bacillus subtilis TS 01, cultivated in two optimized nutrient media - Medium One (for maximum antifungal activity) and Medium Two (for maximum antibacterial activity) was investigated. The two optimized media are similar in qualitative composition but with different component ratios. This determines the similar characteristics of the growth dynamics of the strain in the two media and the different values for number of cells and spores, dry biomass and antibiotic activity, the differences being qualitative, as well as during cultivation. Bacillus subtilis TS 01 exhibits high intensity of growth in both optimized nutrient media (biomass of 1.028 and 1.126 % d.s. respectively in Medium One and Medium Two, which corresponds to the high antibiotic activity of the strain (42.17 and 45.67 mm of sterile zones against Botrytis cinerea and Pseudomonas syringae pv. tomato Ro in Medium One and Medium Two, respectively). This is an important prerequisite for developing process for commercial production of a plant protection agent, intended for organic agriculture. Keywords: Bacillus subtilis; growth kinetics; antimicrobial activity; optimized culture media. Въведение Щам Bacillus subtilis TS 01 е изолиран от българска почва и проявява много широк спектър на антимикробно действие срещу голям брой гъбни и бактерийни фитопатогени [9]. Перспективен е като биологичен агент за получаване на екологично безопасни биопрепарати за контрол на болестите по земеделските култури и за стимулиране растежа на растенията. Биологичните препарати се получават на база живи култури и продукти на техния метаболизъм с антибиотично действие. По-широко приложение те намират в сух вид, съдържащи висок процент жизнеспособни спори. Важно условие при получаване на такива изсушени препарати е не само наличието на подходяща хранителна среда и условия на култивиране, но и проучване морфологичното състояние и динамиката на растеж на щама. B. subtilis TS 01 е култивиран в добре подбрана, балансирана по състав хранителна среда [3] за проявяване на висока антибиотична активност. В предишни изследвания на колектива съставът на хранителната среда е оптимизиран с методите на математическото моделиране, като са получени две оптимизирани хранителни среди: среда I -ва - за проявяване на максимална антигъбна активност и среда II -ра - за проявяване на максимална антибактерийна активност. Целта на настоящата работа е изследване динамиката на морфологичното състояние, развитието и антибиотичната активност на B. subtilis TS 01, култивран в двете оптимизирани хранителни среди, за да се разкрият възможностите за получаване на биопрепарат за растителна защита. Материали и методи Щамове и хранителни среди. В настоящото изследване е използван щам B. subtilis TS 01. 889

Съхранението, поддържането и условията за култивиране на щама, както и получаването на стерилен филтрат от културална течност, са описани в предишни публикации на авторите [2, 9]. За развитие на щама са използвани две оптимизирани хранителни среди, получени с методите на математическото моделиране в предишни изследвания на колектива: среда I -ва - за проявяване на максимална антигъбна активност, със състав (в %): глюкоза 1.4; царевичен екстракт 0.60; KH 2 PO 4 0.10; MgSO 4 0.01; рн=7.0; среда II -ра - за проявяване на максимална антибактерийна активност, със състав (в %): глюкоза 2.5; царевичен екстракт 0.56; KH 2 PO 4 0.2; MgSO 4 0.01; рн=7.0. Условия на култивиране. Развитието на B. subtilis TS 01 е осъществено дълбочинно в ерленмайерови колби от 500 cm 3 с 50 ml хранителна среда. Култивирането е проведено при температура 28 С, на ротационна клатачка (220 min -1 ), за 120 h. Инокулатът е 2 % (v/v), 18- часов вегетативен посевен материал. Обработка на културалните среди. Културалните среди са центрофугирани за 30 min при 4000 min -1 за отделяне на биомасата. Супернатантите са филтрувани през стерилен мембранен филтър - 0.22 µm на Millipore USA [7]. Тест микроорганизми. При определяне антибиотичната активност на B. subtilis TS 01 като тест-микроорганизми са използвани фитопатогените Botrytis cinerea и Pseudomonas syringae pv. tomato Ro. Поддържането, съхранението и приготвянето на суспензии на тест-микроорганизмите са описани в предишни наши публикации [4, 9]. Методи за анализ. Морфологията на клетките на B. subtilis TS 01 и наличието на спори в културалните среди са проследени чрез микроскопско наблюдение при оцветяване по метода на Грам и метода на Мьолер, съответно. Броят на вегетативните клетки и спорите на B. subtilis TS 01 е определен чрез посяване на твърди хранителни среди [1] и изразен с Log 10 колонии образуващи единици в ml (Log 10 cfu ml - 1 ). Биомасата е определена по тегловния метод след сушене при 105 С до постоянна суха маса и изразена в процент сухо вещество (% с.в.). Стойността на рн на културалната течност е измерена потенциометрично с рн-метър ТМ6. Антибиотичната активност на стерилен филтрат е определена по метода на дифузия в агар с ямки [9] и изразена с размера на стерилните зони (диаметърът в mm). Всички изследвания са проведени трикратно, като отчитането на параметрите е през 12 часа. Резултати и обсъждане В проведеното изследване са проучени динамиката на морфологичното състояние, растежа и антибиотична активност на B. subtilis TS 01 в две оптимизирани хранителни среди: среда I -ва - за проявяване на максимална антигъбна активност и среда II -ра - за проявяване на максимална антибактерийна активност. От направените наблюдения се установи, че клетките и спорите на B. subtilis TS 01 са типични за щама [9] и в двете хранителни среди. При оцветяване по метода на Грам не се констатираха съществени различия във формата, големината и разположението на клетките до 24 h на култивиране. Наблюдават се прави пръчици със заоблени краища, разположени под форма на верижки. След 24 h целостта на верижките е нарушена и преобладават свързани по двойки клетки. Оцветяването по метода на Мьолер показа липса на спори през първите 24 часа. Голяма част от клетките на B. subtilis TS 01 започват процес на формиране на ендоспори през второто денонощие. Двете оптимизирани хранителни среди, в които е култивиран B. subtilis TS 01, са еднакви в качествено, но различни в количествено отношение. Това определя еднаквия характер на динамиката на растежа на щама в двете хранителни среди, но стойностите на показателите колонии образуващи единици, суха биомаса и антибиотична активност, са различни, както в количествено отношение, така и по време на култивиране. Получените резултати от изследване на жизнеспособността и динамиката на растежа на B. subtilis TS 01 в двете оптимизирани хранителни среди са представени на фигури 1 и 2. От графиките се вижда, че в развитието на културата се наблюдават логаритмична фаза, стационарна фаза и фаза на умиране. Почти не се наблюдава лаг-фаза в развитието на B. subtilis TS 01, като за такъв характер на кривата на растеж докладват и Junge et al. при щам B. subtilis FZB 24 [5]. Броят на клетките на B. subtilis TS 01 в среда I -ва се увеличава експоненциално с увеличаване на продължителността на култивиране до 24 h (фиг. 1). От 6.92 Log 10 cfu ml -1, инокулирани в 0 h, те достигат максимална стойност от 11.68 Log 10 cfu ml -1 в 24 h. В 36 h се наблюдава лек спад (11.30 890

кое спори Фиг. 1. Динамика на растежа на B. subtilis TS 01 при култивиране в среда I -ва Log 10 cfu ml -1 ) и в стационарната фаза на развитие - до 108 h, броят на колонии образуващите единици се запазва почти постоянен в границите 11.34-11.49 Log 10 cfu ml -1. След 108 h количеството на колонии образуващите единици започва да намалява бавно (11.14 Log 10 cfu ml -1 в 120 h), което определя начало на фазата на умиране. В среда II -ра, в резултат на експоненциалното нарастване, броят на клетките на B. subtilis TS 01 достига от 6.92 Log 10 cfu ml -1 в 0 h до 11.70 Log 10 cfu ml -1 в 24 h (фиг. 2). След това културата кое спори Фиг. 2. Динамика на растежа на B. subtilis TS 01 при култивиране в среда II -ра навлиза в стационарна фаза на развитие, в която броят на колонии образуващите единици остава почти постоянен и по-голям, отколкото в среда I - ва. Най-висока гъстота на клетките има в 36 h на култивиране 11.77 Log 10 cfu ml -1. В 120 h броят на колонии образуващите единици е 11.46 Log 10 cfu ml -1, но за разлика от среда I -ва, не се откроява начало на фаза на умиране. Това не е неочаквано, тъй като в състава на среда II -ра глюкозата е 2.5 %. И в двете оптимизирани хранителни среди B. subtilis TS 01 се развива много добре, което води до силно нарастване на броя на клетките в рамките само на 24 h. Най-висока гъстота на клетките в среда с 1.0 % глюкоза в 24 h на култивиране отчитат и Suwansukho, et al. [8] за 891

щам B. subtilis MUV4 и максимален растеж на щама в среда с 2,5 % глюкоза. Спорообразуването на изследвания от нас щам B. subtilis TS 01 започва след 24 h и в двете оптимизирани хранителни среди, но в среда II -ра процесът протича по-бавно. В 36 h броят на спорите в нея е 8.79 Log 10 cfu ml -1, а в среда I -ва 9.70 Log 10 cfu ml -1. Вероятно това се дължи на повисоката концентрация на въглеродния източник. или на по-слабо изразеното инхибиране от страна на синтезираните антимикробни вещества. За поранно формиране на спори, в рамките на 24 часа, докладват Junge et al. при щам B. subtilis FZB 24 [5], но на среда, съдържаща лактоза, и Kaushish et al. [6] при щам B. subtilis BMT4i (MTCC 9447), култивиран в среда с дизел като въглероден източник. Последният щам на среда с глюкоза образува спори едва след 7 дни. Това доказва, че динамиката на растеж на B. subtilis освен, че зависи от състава на хранителната среда, е и щамова особеност. По-ранното спорообразуване е предпоставка за по-кратък ферментационен процес при производството на биопрепарати, но трябва да бъде изпълнено и условието за натрупване на висок процент спори и биомаса. Резултатите за количествата суха биомаса, получена при култивиране на B. subtilis TS 01 в двете оптимизирани хранителни среди, са представени на фигури 3 и 4. Както се вижда от графиките на фигури 3 и 4, максимално количество суха биомаса щамът натрупва в 72 h. В среда I -ва то е 1.028 % с.в. (фиг. 3), а в среда II - ра 1.120 % с.в. (фиг. 4). В 72 h културалните среди съдържат максимален процент спори - в среда I -ва той е 78,49 %, а в среда II -ра 71,90 %. Фиг. 3. Динамика на развитие и антибиотична активност на B. subtilists 01 в оптимизирана среда I -ва Стойността на рн на културалните среди намалява през първите 12 часа, след което се увеличава и в 24 h на култивиране достига съответно до 8.5 в среда I -ва и 8.3 в среда II -ра. В среда I -ва стойността на рн продължава да нараства и достига до 9,75 (фиг. 3), а в среда II -ра остава почти непроменена до края на ферментацията 8.80 (фиг. 4). Антибиотичната активност на B. subtilis TS 01 е най-висока в 72 h, когато културата се намира в стационарна фаза от развитието си (фиг. 3 и 4). Среда I -ва е оптимизирана за проявяване на максимална антигъбна активност, която срещу Botrytis cinerea достига до 42.17 mm стерилна зона (фиг. 3). Вероятно антигъбната активност на B. subtilis TS 01 е във връзка със спорообразуването, защото съответства на повисокия процент спори в тази в среда. Среда II -ра е оптимизирана за проявяване на максимална антибактерийна активност, която достига 45.67 mm стерилна зона срещу Pseudomonas syringae pv. tomato Ro (фиг. 4). 892

Фиг. 4. Динамика на развитие и антибиотична активност на B. subtilists 01 в оптимизирана среда II -ра Глюкозата оказва силно влияние както върху растежа, така и върху продуцирането на биологично активни вещества от B. subtilis [3, 8]. В среда II -ра, която съдържа по-висок процент глюкоза (2,5 %), B. subtilis TS 01 достига максимален растеж и щамът проявява максимална антибактерийна активност. Максимална антигъбна активност, обаче щамът проявява при по-ниско съдържание на глюкоза - 1.4 % в среда I -ва. Заключение B. subtilis TS 01проявява много добър растеж и в двете оптимизирани хранителни среди. Клетките достигат най-висока гъстота в 24 h на култивиране, а максимален процент спори, което е определящо за получаване на биопрепарати в сухи форми, се образуват в 72 h. В този час културалните среди са с максимален процент биомаса и щамът проявява максимална антибиотична активност. Това означава, че ферментацията може да бъде с продължителност три дни. От получените културални среди, след по-нататъшна обработка, могат да бъдат получени биопрепарати в сух вид със съдържание на висок процент жизнеспособни спори. Литература [1] Бешков, М.Н., Е.А. Карова и И. Mургов, (1986). Ръководство за упражнения по микробиология. Земиздат, София [2] Тодорова, С., (2003). Таксономично определяне на бактериен щам от род Bacillus, проявяващ антагонистични свойства спрямо фитопатогенни микроорганизми. Научни трудове на УХТ Пловдив. Vol. 50, 3:90-96. [3] Тодорова, С., (2012). Влияние на компонентите на хранителната среда върху развитието и антибиотичната активност на Bacillus subtilis TS 01. Научни трудове на Русенския университет Ангел Кънчев. Vol. 51, 9.2:158-163. [4] Тодорова, С. и Л. Кожухарова, (2008). Определяне антимикробния спектър на действие на Bacillus subtilis TS 01, култивиран в различни хранителни среди. Научни трудове на Русенския университет Ангел Кънчев. Vol. 47, 8:13-19. [5] Junge, H., B. Krebs, M. Kilian. 2000. Strain Selection, Production, and Formulation of the Biological Plant Vitality Enhancing Agent FZB24 Bacillus subtilis. In: Pflanzenschutz Nachrichten Bayer. Bayer AG, Leverkusen, 53, 1, 94-104 [6] Kaushish, L.M., B. Ashutosh, B.K. Kumar and D. Koushalya, (2012). The study of growth kinetics of Bacillus subtilis BMT4i (MTCC 9447) using diesel as the sole carbon and energy source. Int. J. Environ.Sci. Vol. 3, 1:20-27. [7] Phae, C.G., M. Shoda and N. Kubota, (1990). Suppressive effect of Bacillus subtilis and it s products on phytopathogenic microorganisms. J. Ferment. Bioeng. Vol. 69, 1:1-7. [8] Suwansukho, P., V. Rukachisirikul, F. Kawai and A. H-Kittikun, (2008). Production and applications of biosurfactant from Bacillus subtilis MUV4. Songklanakarin J. Sci. Technol. Vol. 30, 1:87-93. [9] Todorova, S. and L. Kozhuharova, (2010). Characteristics and antimicrobial activity of Bacillus subtilis strains isolated from soil. World J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 26, 7:1207-1216. 893