СЕЛСКОСТОПАНСКА АКАДЕМИЯ ИНСТИТУТ ПО КРИОБИОЛОГИЯ И ХРАНИТЕЛНИ ТЕХНОЛОГИИ СОФИЯ бул. Черни връх 53, София 1407, тел: , факс: , d

Препис

1 СЕЛСКОСТОПАНСКА АКАДЕМИЯ ИНСТИТУТ ПО КРИОБИОЛОГИЯ И ХРАНИТЕЛНИ ТЕХНОЛОГИИ СОФИЯ бул. Черни връх 53, София 1407, тел: , факс: , ****************************************************************************************** Надежда Василева Даскалова АВТОРЕФЕРАТ на дисертация на тема: КРИОКОНСЕРВИРАНЕ НА -ГЛЮКАНАЗИ за присъждане на образователна и научна степен Доктор по научна специалност Топлофизика и хидродинамика (вкл. термични и криогенни процеси и явления; процеси на пренасяне във флуиди; физика на свиваемите и несвиваемите флуиди) Научен ръководител: Акад. Цветан Цветков София, 2013 г.

2 Дисертационният труд е написан на 112 страници и съдържа 31 таблици и 36 фигури. Цитираната литература включва 158 източника, от които 16 на кирилица и 142 на латиница. Дисертационният труд е обсъден и насрочен за защита от разширен съвет на секция: Криобиология и лиофилизация при ИКХТ, София. Използваната номерация на таблиците и фигурите не съответства на номерацията в дисертацията. Публичната защита на дисертационния труд ще се състои на г. от...ч. в Заседателната зала на ИКХТ, София 1407, бул. Черни връх 53. ИЗПОЛЗВАНИ СИМВОЛИ И СЪКРАЩЕНИЯ А260- абсорбция при дължина на вълната 260 nm А280- абсорбция при дължина на вълната 280 nm БДС- Български държавен стандарт ЕДТА- етилендиаминтетраоцетна киселина КДА- картофено-декстрозен агар НБПМКК- Национална банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури НЦЗПБ- Национален център по заразни и паразитни болести ТВЧ- токове с висока честота ХЕН- хидроксиетил нишесте CFU- колоно-образуващи единици СМС- карбоксиметилцелулоза ISO- Международна организация за стандартизация kdа- килодалтона Mw- молекулна маса OD- оптическа плътност PAGE- полиакриламидна гел-електрофореза SDS- натриев додецилсулфат - дължина на вълната 2

3 ВЪВЕДЕНИЕ В последните десетилетия се наблюдава бързо развитие на биотехнологиите. Основно тяхно направление е производството и приложението на микробиалните ензимни препарати. Използването на микробиалните ензими в индустрията се увеличава и поради това е необходимо да се осигурят надежни методи за запазване на тяхната активност за дълъг период от време. Широко индустриално приложение намират ензимите, катализиращи разграждането на хемицелулозите. Към тях се отнасят и -1,3/1,4-глюканазите. Те са ензими, които се синтезират от различни таксономични групи микроорганизмиглавно бактерии и гъби, като част от техния екстрацелуларен ензимен комплекс. Повечето от техните продуценти спадат към групата на микромицетите. Ензимите се продуцират най-често под формата на разтвор и могат да се инактивират, когато се съхраняват при неподходящи условия. Един от начините за получаване на стабилен ензимен продукт с висока активност и дълъг период на е вакуум-сублимационното сушене. Все още обаче не е напълно изучено влиянието на процеса лиофилизация върху каталитичната активност на ензимите. Поради това настоящата дисертация е насочена към изучаване влиянието на нискотемпературното третиране върху каталитичната активност на -1,3/1,4-глюканази, продуцирани от Trichoderma sp. НБПМКК 405. I. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ: Целта на настоящата работа е: изследване възможностите за криоконсервиране на продуцираните от Trichoderma sp. НБПМКК 405 -глюканазни ензими, установяване на най-ефективния метод за тяхното и получаване на ензимен препарат, продуциран от работния щам. Реализирането на поставената цел се постига чрез изпълнението на следните научно- изследователски задачи: 1. Изследване динамиката на биосинтез на -глюканази (ламинариназа Е.С и лихеназа Е.С ) при дълбочинно култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК Изследване на активността на продуцираните от Trichoderma sp. НБПМКК 405 -глюканази- ламинариназа (Е.С ) и лихеназа (Е.С ). 3. Нискотемпературно третиране и криоконсервиране на продуцираните от Trichoderma sp. НБПМКК 405 -глюканази (ламинариназа Е.С и лихеназа Е.С ), без добавяне на криопротектори. 4. Изследване на остатъчната активност на анализираните ензими след процеса на криоконсервиране и определяне на оптималните условия за продължителното им. 5. Създаване на технологична схема за получаване на ензимен препарат, съдържащ -глюканази (ламинариназа Е.С и лихеназа Е.С ) и проучване на неговото приложение в пивопроизводството. 3

4 II. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 1. Щам- продуцент- за провеждането на изследванията е използван щам Trichoderma sp. НБПМКК 405, закупен от Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури (НБПМКК). 2. Посевна и ферментационна хранителни среди за култивиране на изследвания щам-продуцент- използвани са следните хранителни среди: Посевна хранителна среда- хранителна среда на Манделс (Mandels et al., 1974). Ферментационна хранителна среда- хранителна среда на Манделс за култивиране на Trichoderma sp. (Mandels et al., 1974). 3. Посевен материал: Получаване на споров посевен материал- при култивиране на щам-продуцента върху полегат КДА в продължение на денонощия при температура 28оС. Получаване на вегетативен посевен материал- на клатачен апарат InkubationsSchüttelschrank BS-4 B.Braun (220 об./мин.) в продължение на часа при температура 28оС. 4. Дълбочинно култивиране на щам-продуцента- провежда се на клатачен апарат Inkubations-Schüttelschrank BS-4 B.Braun (220 об./мин.) при температура 28оС в продължение на 168 часа (фиг. 1). Рехидратиране на лиофилизирания щам Развитие на щама върху полегат КДА (споров посевен материал) Получаване на вегетативен посевен материал Култивиране на щама в колби на клатачен апарат Фиг. 1. Схема на дълбочинно култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК Контрол на ферментационния процес: Микроскопски контрол- приготвят се микроскопски препарати с цел проследяване развитието на щама. Контрол на концентрацията на водородни йони в хранителната среда и в културалната течност- измерва се с рн-метър. Определяне съдържанието на белтък в културалната течност в mg/ml по време на чрез спектрофотометричен метод (OD280/OD260) (Йотова и кол., 2000). Количествено определяне на активността на изследваните ензими- съгласно методиките, приложени в т Методика за построяване на стандартна крива- приготвят се изходни разтвори на глюкоза (D(+) Glucose monohydrate- Sigma- Aldrich) с концентрации съответно 0,01 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,03 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,07 mg/ml; 0,08 mg/ml и 0,09 mg/ml. Приготвят се съответните проби от всеки разтвор и една контрола, както е посочено: Проба: 1ml разтвор на глюкоза 1ml разтвор на Шомоги Контрола: 1ml дестилирана вода 1ml разтвор на Шомоги Така подготвените проби се поставят за 20 минути на кипяща водна баня. охлаждане към всяка епруветка се добавя по 1 ml реактив на Нелсон, хомогенизира се и се долива до 25 ml с дестилирана вода. Абсорбцията се измерва на спектрофотометър Unicam SP1800 Ultraviolet Spectrophotometer при дължина на вълната =660 nm и червен филтър. 7. Методики за определяне на изследваните ензимни активности: 7.1. Определяне на ламинариназна активност- по метода на Somogyi-Nelson (Nelson, 1944; Somogyi, 1952; Nelson, 1957) Определяне на лихеназна активност- по метода на Somogyi-Nelson 4

5 (Nelson, 1944; Somogyi, 1952; Nelson, 1957). 8. Количествено определяне на белтъчното съдържание в културалната течност- по спектрофотометричен метод (OD280/OD260) (Йотова и кол., 2000), който се основава на присъстващите в белтъците ароматни аминокиселини (фенилаланин, тирозин и триптофан), обуславящи поглъщането на ултравиолетовата светлина от белтъчните разтвори с max при 280 nm. Измерва се и абсорбцията на нуклеиновите киселини при 260 nm. Съдържанието на белтък (mg/ml) се изчислява по формулата: Белтъчно съдържание (mg/ml) = 1,5. А280 0,75. А Изчисляване на специфичната ензимна активност по време на - получените ензимни активности в IU/ml се преизчисляват към g белтък на база на резултатите, получени за белтъчното съдържание в културалната течност. 10. Съхранение на пробите културална течност- получената културална течност е филтрирана през филтърна хартия и е съхранявана при следните условия: В хладилник () непосредствено след взимане на пробите В замразено състояние при (-20оС) (-25оС) и последващо размразяване на стайна температура (20±5оС) В замразено състояние при (-20оС) ( -25оС) и последващо размразяване в хладилник () Посредством лиофилизация- съгласно посочената схема в т.11. При обработката на пробите с течен азот (-196оС) са използвани проби от 144-тия час на ферментацията. Съхранението на замразените с течен азот проби е проследено в два варианта: вариант 1- при (-20оС) (-25оС) и вариант 2- лиофилизация веднага след замразяването им с течен азот. Ензимните активности на пробите са определени съгласно методиките, приложени в т Лиофилизация и възстановяване на лиофилизатите- получената културална течност се филтрира през филтърна хартия и се подлага на лиофилизация, която протича в три фази: 1) първа фаза- замразяване на пробите (при -35оС ± 2оС или при -196оС); 2) втора фаза- първично сушене- сублимация на водата при -25оС -35оС под дълбок вакуум; 3) трета фаза- вторично сушене (десорбция)- доизсушаване чрез нагряване под дълбок вакуум при положителни температури (+20оС +25оС). Цялостният технологичен процес на обработка на пробите обединява няколко технологични етапа, представени схематично на фиг. 2: Получаване на културална течност при на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Филтриране на културалната течност Сублимационно сушене Замразяване на пробите Отмерване по 10 ml от пробите в пластмасови контейнерчета mm дебелина на слоя във всяко контейнерче Поставяне на контейнерчетата в тави за сублимационно сушене Фиг. 2. Технологична схема за лиофилизация на пробите, получени при на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Лиофилизацията е осъществена във вакуумна сублимационна инсталация HOCHVAKUUM модел TG-16. Процесът на замразяване на културалната течност е 5

6 извършен без използването на криопротектори. Възстановяването на лиофилизираната културална течност е направено чрез добавяне на 10 ml дестилирана вода към всяка проба и след това ензимните активности са определени съгласно методиките, приложени в т Изчисляване на ензимните активности на лиофилизатите в IU/g лиофилизат- получените ензимни активности в IU/ml се преизчисляват към g лиофилизат. 13. Електрофореза на проби от лиофилизатите SDS-PAGE (по Laemmli, 1970)използвани са: лиофилизиран говежди албумин (Fluka) с Mw 66 kdа 1 mg/ml и 0,5 mg/ml, протеинов маркер HMW-SDS Calibration Kit на фирмата Amersham Bioscences (глутамат дехидрогеназа с Mw 53 kdа, трансферин с Mw 76 kdа, -галактозидаза с Mw 116 kdа, 2-макроглобулин с Mw 170 kdа и миозин с Mw 212 kdа), проби от лиофилизирана културална течност. Електрофорезата е проведена при следните условия: концентрация на събирателния и разделителния гел съответно 6% и 10%; сила на тока 25 ma; продължителност 5 h. Оцветяването на протеиновите фракции е извършено с Commassie Brilliant Blue - 0,2% разтвор. Сканирането на гела и изчисляването на молекулните маси е извършено с помощта на специализиран софтуер UN-SCAN-IT get версия Изготвяне и охарактеризиране на ензимен препарат, продуциран от Trichoderma sp. НБПМКК 405- проведено е дълбочинно култивиране на щампродуцента на клатачен апарат Inkubations-Schüttelschrank BS-4 B.Braun (220 об./мин.) при температура 28оС в продължение на 144 часа. Получената културална течност е филтрирана през филтърна хартия, замразена при -35 ± 2оС и е подложена на лиофилизация. Полученият лиофилизиран ензимен препарат е охарактеризиран по: Определяне на остатъчното влагосъдържание на лиофилизирания ензимен препарат- по БДС модифициран метод Определяне на ензимните активности на лиофилизирания ензимен препарат - съгласно приложените в т.7 методики Микробиологичен анализ на лиофилизирания ензимен препарат: - посявка на обикновен агар за определяне на общия брой мезофилни аеробни микроорганизми, CFU/g ензимен препарат (ISO 4833:2003); - посявка на щрих на среда Ендо (Бул Био- НЦЗПБ) за определяне на Escherichia coli и колиформи, CFU/g ензимен препарат (ISO : 2004 и ISO 4832: 2006); - посявка на щрих на Бърд Паркер агар (Бул Био- НЦЗПБ) за определяне на Staphylococcus aureus, CFU/g ензимен препарат (ISO : 1999); - посявка на щрих на Салмонела- Шигела агар (Бул Био- НЦЗПБ) за определяне на Salmonella sp., CFU/g ензимен препарат (ISO 6579: 2002). 15. Гама-облъчване на проби от лиофилизирания ензимен препарат- параметри: радионуклид Cs137; вид лъчение- гама лъчи; активност на ГОУ- ГАМА-1300, мощност на дозата 1,75 Gy/min; дози на облъчване: 0, 5 и 10 kgy; работна температура- 20оС 22 ос. 16. Приложение на лиофилизирания ензимен препарат при получаването на пивна мъст- проведени са лабораторни варки по инфузионен режим при производството на 10,0% обикновено светло пиво при 30% замяна на малца с немалцуван ечемик. Ензимният препарат е дозиран в началото на процеса в количества, представени в таблица 1. Таблица 1. Използвани количества ензимен препарат при получаване на пивна мъст Съдържание на: Малц, % спрямо суровината Ечемик, % спрямо суровината Ензимен препарат, % спрямо суровината Контрола Вариант ,04 Вариант ,40 Вариант ,0 Сладката пивна мъст е получена на лабораторна автоматична майшова баня на немската фирма "Bender & Hobein" по инфузионен метод на секция "Технология на 6

7 пивото и напитките" на ИКХТ. Получените лабораторни пивни мъсти са анализирани по следните методи, утвърдени в Аналитиката на Европейската пивоварна конвенция (EBC Analysis Committee, 1998): 1) време на озахаряване- проверява се с разтвор на йод (Moštek, 1973); 2) скорост на изцеждане- отчитат се изтеклите милилитри пивна мъст за определен период от време (Moštek, 1973); 3) рандеман на екстракт- изчислява се количеството на екстрахираните вещества от 100 g малц в резултат на процеса на майшуване (Moštek, 1973); 4) определяне на екстракта на пивна мъст- определя се в зависимост от измерената относителна маса на определено количество пивна мъст и по официална таблица се отчита екстракта като g екстракт в 100 g пивна мъст (EBC Analysis Committee, 1998); 5) определяне на рн- с рн-метър (EBC Analysis Committee, 1998); 6) определяне на цвят- спектрофотометрично при дължина на вълната =430 nm (EBC Analysis Committee, 1998); 7) определяне на вискозитет- с вискозиметър на Höppler (EBC Analysis Committee, 1998); 8) определяне на разтворим азот- спектрофотометрично при дължини на вълните = 215 nm и = 225 nm (Маринова и кол., 2005); 9) определяне на β-глюкани по метода на Erdal (Erdal et al., 1967). 17. Статистическа обработка на резултатите- извършен е вариационен и дисперсионен анализ на резултатите чрез компютърна програма SPSS Statistics версия 17.0 и Excel версия III. РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ 1. Култивиране на щам-продуцента Щамовете от род Trichoderma са продуценти главно на целулазни ензими според El-Bondkly и кол. (2011). В Националната банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури Trichoderma sp. НБПМКК 405 е депозиран като продуцент на целулази и хемицелулази. Информационните източници за продуцирането на хемицелулазите ламинариназа и лихеназа от подбрания от нас щам са малко. Поради това настоящата дисертация е насочена към изследване продуцирането на тези два хемицелулазни ензима. Проучено е дълбочинното култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405 на клатачен апарат в продължение на 168 часа при 28оС. На фиг. 3 е представен началният етап от развитието на работния щам върху КДА. култивиране в продължение на денонощия върху КДА при температура 28оС Trichoderma sp. НБПМКК 405 образува пелена и се формират синьозелени спори (фиг. 4). Фиг. 3. Начален етап от развитието на Trichoderma sp. НБПМКК 405 върху КДА Фиг. 4. Формиране на синьозелени спори при развитието на Trichoderma sp. НБПМКК 405 върху КДА Направени са микроскопски снимки на посевния и ферментационния материал (фиг. 5 и 6). В процеса на култивиране на щам-продуцента са приготвени 7

8 микроскопски препарати с цел контрол на чистотата на културалната среда. Те доказват липсата на контаминация на културалната среда с други микроорганизми във всеки етап по време на ферментацията. a б Фиг. 5. Trichoderma sp. НБПМКК 405- посевен материал: a - серия 1; б - серия 2 Фиг. 6. Trichoderma sp. НБПМКК 405- ферментационен материал Направени са също и микроскопски снимки на Trichoderma sp. НБПМКК 405 по време на ферментацията (фиг. 7 9). Фиг. 7. Trichoderma sp. НБПМКК 405 на 48-мия час от Фиг. 8. Trichoderma sp. НБПМКК 405 на 96-тия час от От микроскопските снимки се вижда постепенното изтъняване на клетъчната стена на хифите и поява на вакуоли. Цитоплазмата се характеризира с нарастване на хетерогенността. Застаряването на културата е съпроводено също с частично разкъсване клетъчните стени на хифите и настъпване на лизис (фиг. 9). 8

9 Фиг. 9. Trichoderma sp. НБПМКК 405 на 144-тия час от 1.1. Съдържание на белтък в културалната течност по време на на Trichoderma sp. НБПМКК 405 При на Trichoderma sp. НБПМКК 405 в течна хранителна среда е проследена диманиката на биосинтез на белтък в културалната течност (табл. 2). Получените резултати показват, че в хода на ферментацията съдържанието на белтък в културалната течност нараства и достига своя максимум на 144-тия час от ферментационния процес. На 72-рия час то се увеличава приблизително 1,3 пъти, на 120-тия- приблизително 1,5 пъти, а на 144-тия час- приблизително 1,6 пъти в сравнение със съдържанието на белтък в културалната течност на 24-тия час от ферментацията. Таблица 2. Съдържание на белтък в културалната течност по време на ферментацията на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Белтъчно съдържание в културалната течност, mg/ml Средна стойност, X Стандартно отклонение, SD Стандартна грешка, Sх Час на пробовземане 24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми 4,395 5,505 5,708 6,000 6,435 6,938 6,938 0,289 0,081 0,107 0,174 0,408 0,586 0,586 0,129 0,036 0,048 0,078 0,182 0,262 0,262 Брой анализирани проби (n) = 10 На фиг. 10 е представена кинетиката на продуциране на белтъци при дълбочинното култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405. От графиката се вижда рязко покачване на количеството на продуцираните белтъци в културалната течност от 24-тия до 48-мия час. 48-мия час се наблюдава равномерно натрупване на белтъци до 144-тия час, след което културата навлиза в стационарната фаза на развитие. Белтъчно съдържание, mg/ml Час на пробовземане Фиг. 10. Кинетика на продуциране на белтъци при дълбочинно култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405 9

10 1.2. Динамиката на биосинтез на ламинариназа и лихеназа при дълбочинно култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Проучена е способността на продуцента Trichoderma sp. НБПМКК 405 да синтезира ламинариназа и лихеназа (табл. 3). При проследяване динамиката на култивационния процес се вижда, че активността на двата ензима в хода на на работния щам нараства. Установено е, че двата ензима показват най-високи активности на 144-тия час от. Ламинариназната активност на 72-рия час е над 2 пъти по-висока, а на 144-тия час нараства 4 пъти в сравнение с 24-тия час. Лихеназната активност на 96-тия час е приблизително 2 пъти по-висока, а на 144-тия час е приблизително 2,5 пъти по-висока, отколкото на 24-тия час. Таблица 3. Ламинариназна и лихеназна активности, определени по време на ферментацията на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Час на пробовземане 24-ти Лaминариназна активност, IU/ml по време на 0,127 0,017 Лихеназна активност, IU/ml по време на 0,043 0, ми 72-ри 0,248 0,016 0,300 0,003 0,061 0,002 0,070 0, ти 120-ти 0,343 0,021 0,456 0,013 0,085 0,002 0,096 0, ти 0,520 0,027 0,107 0, ми 0,458 0,009 0,095 0,001 Брой анализирани проби (n) = 5 Статистическата обработка на резултатите, получени за ламинариназната и лихеназната активности чрез дисперсионен еднофакторен анализ показва статистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение на фактора време на култивиране (табл. 4). Таблица 4. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по отношение на фактора време на култивиране Критерий на Фишер, определен за ламинариназната активност 66,765 =0,05 Критерий на Фишер, определен за лихеназната активност 126,928 Таблична стойност на Критерия на Фишер 2,445 В хода на проучваният продуцент показва по-висока ламинариназна, отколкото лихеназна активност. Ламинариназната активност на щама в началото на ферментационния процес е приблизително 3 пъти по-висока, на 48-мия, 72-рия и 96-тия час- около 4 пъти по-висока, на 120-тия- 4,75 пъти по-висока, а на 144-тия час- над 4,85 пъти по-висока от лихеназната. В литературата има данни за изследване продуцирането само на единия ензим (ламинариназа) или само на другия ензим (лихеназа) от представители на род Trichoderma (Sun et al., 2001; Nobe et al., 2003; Burtseva et al., 2006), а няма данни за проучване продуцирането на двата ензима от един щам- продуцент. Поради това би било трудно да се направи сравнение на получените резултати за продуцираните ламинариназа и лихеназа от Trichoderma sp. НБПМКК 405 с резултатите, получени за други представители на род Trichoderma, за които е изследвана продукцията само на ламинариназа или само на лихеназа. Кинетиката на двете ензимни активности по време на ферментацията на Trichoderma sp. НБПМКК 405 е представена на фиг. 11. От нея се вижда, че ламинариназната активност нараства рязко до 144-тия час от, след което със застаряване на културата и изчерпване на хранителните вещества в средата 10

11 започва да намалява. Наблюдава се постепенно и пропорционално покачване на лихеназната активност до 144-тия час, след което със застаряване на културата и изчерпване на хранителните вещества в средата, също започва да намалява. Ензимни активности, IU/ml Час на пробовземане Ламинариназна активност, IU/ml Лихеназна активност, IU/ml Фиг. 11. Кинетика на ламинариназната и лихеназната активности при дълбочинно култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405 По-ниските активности на ламинариназата и лихеназата, продуцирани от работния щам се обясняват с това, че те са съпътстващи ензими и се синтезират от изследвания щам в минимални количества, като по този начин допълват ензимния комплекс, синтезиран от Trichoderma sp. НБПМКК 405. Макар и анализираните ензими да се продуцират от проучения щам като съпътстващи ензими, те показват стабилна активност. Важна особеност е, че работният щам не е патогенен и не е генно-модифициран. Това позволява ензимите, продуцирани от него да намерят приложение в процесите на вино и пивопроизводството за по-пълно разграждане на глюканите, а също биха могли да се използват и като добавка към храната на животните. Изчислени са специфичните ламинариназна и лихеназна активности по време на процеса на на Trichoderma sp. НБПМКК 405. Резултатите са представени в таблица 5. Таблица 5. Специфични ламинариназна и лихеназна активности, определени по време на ферментацията на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Час на пробовземане Cпецифична ламинариназна активност, IU/g белтък Специфична лихеназна активност, IU/g белтък 24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми 28,90 45,05 52,56 57,17 70,86 74,95 66,01 9,78 11,08 12,26 14,17 14,92 15,42 13,69 Брой анализирани проби (n) = 5 Oт таблицата се вижда, че специфичната ламинариназна активност на 120-тия час от на работния щам е 4,75 пъти, а на 144-тия час- над 4,85 пъти поголяма от специфичната лихеназна активност. 2. Съхранение на пробите от културалната течност Запазването на ензимната активност е основният критерий доколко използваните методи са подходящи за дълготрайно на даден ензим. Основно значение за запазването на структурата и функциите на белтъчните молекули имат условията на тяхното. 11

12 2.1. Съхранение в хладилник () непосредствено след взимане на пробите Проучени са остатъчните ламинариназна и лихеназна активности след при съответно 7, 21 и 35 дни. Резултатите показват, че при тези условия с течение на времето двете ензимни активности започват да намаляват. В таблица 6 са представени резултатите за ламинариназната активност, определени по време на то на пробите в хладилник (). Таблица 6. Ламинариназна активност на пробите при в хладилник непосредствено след взимането им Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час Веднага след култивиране (преди поставяне за ) 0,127 0,017 0,248 0,016 0,300 0,003 0,343 0,021 0,456 0,013 0,520 0,027 0,458 0,009 Лaминариназна активност, IU/ml 7 дни при 21 дни при 35 дни при 0,124 0,008 0,241 0,012 0,292 0,008 0,335 0,013 0,445 0,020 0,510 0,009 0,445 0,012 0,122 0,011 0,239 0,013 0,289 0,013 0,329 0,011 0,439 0,018 0,500 0,011 0,441 0,015 0,121 0,008 0,235 0,010 0,284 0,011 0,326 0,011 0,433 0,010 0,493 0,027 0,436 0,008 Брой анализирани проби (n) = 5 На фиг. 12 са представени процентите на запазване на ламинариназната активност при в хладилник. От резултатите се вижда, че на седмия ден от то ламинариназната активност се запазва между 97,16% и 98,08%. ователно намалява приблизително с 2 до 3% в сравнение с активността, определена непосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията. 21 дни при ламинариназната активност на пробите намалява приблизително с 4%, а на 35-тия ден- намалява приблизително с 5%, но на 35-тия ден от то на пробите в хладилник () е установено помътняване на пробите и поява на неприятна миризма. Това показва, че този температурен режим за е подходящ само за краткотрайно на изследвания ензим- от един ден до няколко седмици. 100 Запазване на ламинариназната активност при в хладилник, % след 7 дни в хладилник след 21 дни в хладилник след 35 дни в хладилник ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми Eтап от [ h ] Фиг. 12. Запазване на ламинариназната активност при на пробите в хладилник Резултатите за изменението на лихеназната активност при то на пробите при са представени в таблица 7. Процентите на запазване на лихеназната активност при на пробите при са представени на фиг. 12

13 13. От нея се вижда, че на седмия ден от то при лихеназната активност се запазва до 93,44%- 95,35%, т.е. тя намалява приблизително с 5 до 7% в сравнение с активността, определена непосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията. Таблица 7. Лихеназна активност на пробите при тяхното в хладилник непосредствено след взимането им Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час Веднага след култивиране (преди поставяне за ) 0,043 0,001 0,061 0,002 0,070 0,002 0,085 0,002 0,096 0,002 0,107 0,003 0,095 0,001 Лихеназна активност, IU/ml 7 дни при 21 дни при 35 дни при 0,041 0,001 0,057 0,001 0,066 0,001 0,080 0,001 0,091 0,002 0,101 0,001 0,090 0,001 0,039 0,001 0,055 0,001 0,064 0,001 0,077 0,001 0,087 0,002 0,096 0,001 0,086 0,001 0,037 0,001 0,053 0,001 0,061 0,001 0,073 0,001 0,083 0,001 0,092 0,001 0,083 0,001 Брой анализирани проби (n) = 5 на пробите 21 дни при лихеназната активност намалява приблизително с 9 до 10%, а на 35-тия ден от то на пробитеприблизително с 13 до 14%, но на 35-тия ден от то на пробите в хладилник () е установена поява на неприятна миризма и помътняване на пробите, което показва, че този температурен режим за е подходящ само за краткотрайно на изследвания ензим- от един ден до няколко седмици. 100 Запазване на лихеназната активност при в хладилник, % след 7 дни в хладилник след 21 дни в хладилник след 35 дни в хладилник ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми Eтап от [ h ] Фиг. 13. Запазване на лихеназната активност при на пробите в хладилник От фиг. 12 и 13 може да се направи извода, че в хода на то на пробите в хладилник () ламинариназната активност се запазва в по-голям процент в сравнение с лихеназната активност. Това се потвърждава и от статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на получените резултати. Обработката на резултатите, получени за ламинариназната активност след 35-дневно на пробите в хладилник, показва статистически значима зависимост на ензимната активност по отношение на фактора етап на (табл. 8). При тези условия и продължителност на факторът време на не оказва влияние върху ламинариназната активност. По отношение на лихеназната активност 13

14 на пробите, бе установена статистически значима зависимост на тази ензимна активност по отношение и на двата фактора: етап на и време на (табл. 8). Таблица 8. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по отношение на факторите време на и етап на при на пробите в хладилник, непосредствено след взимането им Критерий на Фишер, определен за ламинариназната активност по отношение на фактор: Етап на 65,938 Време на 1,012 Критерий на Фишер, определен за лихеназната активност по отношение на фактор: Етап на 158,943 Време на 46,543 Таблична стойност на Критерия на Фишер по отношение на фактор: Етап на 1,601 Време на 3,132 =0, Съхранение в замразено състояние и последващо размразяване на стайна температура (20±5оС) Проучени са остатъчните ламинариназна и лихеназна активности един час след размразяването при 20±5оС и след 7 дневно на пробите при 20±5оС. Анализите показват, че ламинариназната активност намалява рязко, когато пробите се размразят и съхраняват при 20±5оС (табл. 9). Таблица 9. Ламинариназна активност на пробите след замразяването им при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване на стайна температура (20±5оС) Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час Лaминариназна активност, IU/ml Веднага след култивиране 1 час след (преди поставяне за ) при 20±5оС 0,127 0,017 0,109 0,005 0,248 0,016 0,210 0,008 0,300 0,003 0,259 0,006 0,343 0,021 0,292 0,006 0,456 0,013 0,390 0,005 0,520 0,027 0,446 0,018 0,458 0,009 0,394 0,011 Брой анализирани проби (n) = 5 7 дни след при 20±5оС 0,097 0,004 0,191 0,004 0,230 0,004 0,265 0,006 0,354 0,006 0,400 0,005 0,348 0,005 Изчислен е процентът на запазване на ламинариназната активност при то на пробите в замразено състояние и последващото им размразяване при 20±5оС. Резултатите са представени на фиг. 14. Един час след размразяването на стайна температура (20±5оС) ламинариназната активност намалява приблизително с 14 до 15%, а след 7 дни на стайна температура (20±5оС) намалява приблизително с 22 до 24% в сравнение с активността, определена веднага след взимането на пробите по време на. В таблица 10 са обобщени резултатите за изменението на лихеназната активност след замразяване на пробите при (-20оС) ( -25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване на стайна температура (20±5оС). При лихеназата се наблюдава още по-рязко намаляване на нейната активност в сравнение с ламинариназната. 14

15 Запазване на ламинариназната активност след размразяване и на стайна температура, % час след размразяване на стайна температура дни след размразяване на стайна температура ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми Eтап от [ h ] Фиг. 14. Запазване на ламинариназната активност след размразяване и на стайна температура (20±5оС) Един час след размразяването при 20±5оС лихеназната активност намалява приблизително с 25 до 26%, а след 7 дни на стайна температура (20±5оС)намалява приблизително с 28 до 30% в сравнение с активността, определена веднага след взимането на пробите по време на (фиг. 15). Таблица 10. Лихеназна активност на пробите след замразяването им при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване на стайна температура (20±5оС) Лихеназна активност, IU/ml Веднага след култивиране 1 час след (преди поставяне за ) при 20±5оС Етап от Запазване на лихеназната активност след размразяване и на стайна температура, % 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час 0,043 0,001 0,061 0,002 0,070 0,002 0,085 0,002 0,096 0,002 0,107 0,003 0,095 0,001 0,032 0,001 0,045 0,001 0,052 0,001 0,063 0,001 0,071 0,001 0,080 0,002 0,070 0,001 Брой анализирани проби (n) = 5 7 дни след при 20±5оС 0,031 0,001 0,044 0,001 0,050 0,001 0,060 0,001 0,069 0,001 0,076 0,001 0,066 0, час след размразяване на стайна температура дни след размразяване на стайна температура ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми Eтап от [ h ] Фиг. 15. Запазване на лихеназната активност след размразяване и на стайна температура (20±5оС) 15

16 Един час след размразяването при 20±5оС лихеназната активност намалява с поголям процент в сравнение с ламинариназната активност. 7 дни на стайна температура (20±5оС) лихеназната активност намалява приблизително с 28 до 30% в сравнение с първоначалната активност, определена веднага след взимането на пробите по време на ферментацията, докато ламинариназната активност спада приблизително с 22 до 24%. ователно може да се направи извода, че размразяване при 20±5оС на замразените при (-20оС) (-25оС) и съхранявани в замразено състояние 12 месеца проби и последващото им на стайна температура (20±5оС) води до значителна загуба на активността и при двата ензима. При опитите е установено, че то на стайна температура (20±5оС) също е съпроводено с помътняване на пробите и поява на неприятна миризма и следователно не би могло да се използва като начин за на ензими. Статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на резултатите, получени за ламинариназната и лихеназната активности след замразяването на пробите при (-20оС) (-25оС), то им в замразено състояние 12 месеца и последващото им размразяване и на стайна температура (20±5оС) е представенa на табл. 11. Анализът показва статистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение на факторите етап на и време на. Таблица 11. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по отношение на факторите време на и етап на при размразяване и на пробите на стайна температура (20±5оС) Критерий на Фишер, определен за ламинариназната активност по отношение на фактор: Етап на 74,691 Време на 54,480 Критерий на Фишер, определен за лихеназната активност по отношение на фактор: Етап на 63,113 Време на 13,221 Таблична стойност на Критерия на Фишер по отношение на фактор: Етап на 1,772 Време на 4,130 =0, Съхранение в замразено състояние и последващо размразяване в хладилник () Проучени са остатъчните ламинариназна и лихеназна активности съответно 7, 14, 30, 45 и 55 дни след размразяването на пробите при (табл. 12). Резултатите показват, че ламинариназната активност се запазва в голяма степен след размразяване при, което води до извода, че продължителното в замразено състояние при (-20оС) (-25оС) би могло да се използва като начин за на ламинариназата, но при условие, че размразяването на ензимите се извършва при 48оС. Изчислен е процентът на запазване на ламинариназната активност след размразяване и при (табл. 13). Седем дни след размразяване и в хладилник () тя намалява приблизително с 3 до 4% в сравнение с активността, определена непосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията. На 30-тия ден намалява приблизително с 6 до 7%, а на 55-тия ден приблизително с 9 до 10%. Това показва, че този начин на е подходящ за на ламинариназата. 16

17 Таблица 12. Ламинариназна активност след замразяване на пробите при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване при Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час Веднага след култивиране (преди поставяне за ) Лaминариназна активност, IU/ml 7 дни при 14 дни при 30 дни при 45 дни при 55 дни при 0,127 0,017 0,248 0,016 0,122 0,005 0,241 0,005 0,120 0,004 0,233 0,006 0,119 0,007 0,231 0,008 0,117 0,010 0,228 0,009 0,114 0,008 0,224 0,007 0,300 0,003 0,343 0,021 0,456 0,013 0,292 0,005 0,330 0,003 0,445 0,006 0,282 0,005 0,321 0,008 0,427 0,009 0,278 0,008 0,318 0,008 0,422 0,008 0,275 0,006 0,315 0,008 0,421 0,017 0,271 0,013 0,307 0,008 0,415 0,011 0,520 0,027 0,458 0,009 0,503 0,007 0,444 0,006 0,494 0,005 0,431 0,017 0,484 0,009 0,426 0,013 0,482 0,017 0,422 0,012 0,469 0,024 0,413 0,010 Брой анализирани проби (n) = 5 Таблица 13. Запазване на ламинариназната активност на пробите след замразяването им при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване и продължително в хладилник () Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час 7 дни при 96,06 97,18 97,33 96,21 97,59 96,73 96,94 Запазване на лaминариназната активност, % 14 дни при 30 дни при 45 дни при 55 дни при 94,49 93,70 92,13 89,76 93,95 93,15 91,94 90,32 94,00 92,67 91,67 90,33 93,59 92,71 91,84 89,50 93,64 92,54 92,32 91,01 95,00 93,08 92,69 90,19 94,10 93,01 92,14 90,17 Брой анализирани проби (n) = 5 Изменението на лихеназната активност след замразяване на пробите при (-20оС) (-25оС), то им в продължение на 12 месеца при (-20оС) (-25оС) и последващото им размразяване в хладилник () е представено на таблица 14. От резултатите се вижда, че при този начин на лихеназната активност спада по-бързо в сравнение с ламинариназната. Изчислен е процентът на запазване на лихеназната активност на пробите след замразяването им при (-20оС) ( -25оС), то им в замразено състояние 12 месеца и последващото им размразяване и продължително в хладилник (). Резултатите са представени в таблица 15. Лихеназната активност, определена на седмия ден след на пробите в хладилник () намалява приблизително с 14 до 16% в сравнение с активността, определена непосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията. Това е с около 11 до 12% помалко в сравнение с процента на запазване на ламинариназната активност на седмия ден от то при. На 30-тия ден лихеназната активност намалява приблизително с 29 до 31%, което е приблизително с 23 до 24% по-малко в сравнение с процента на запазване на ламинариназната активност, определена на 30-тия ден. На 55-тия ден лихеназната активност намалява приблизително с 33 до 35%, което е приблизително с 24 до 25% по-малко в сравнение с процента на запазване на ламинариназната активност, определена на 55-тия ден от то на пробите при. 17

18 Таблица 14. Лихеназна активност след замразяване на пробите при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване и продължително в хладилник () Лихеназна активност IU/ml Етап от Веднага след култивиране (преди поставяне за ) 7 дни при 14 дни при 30 дни при 45 дни при 55 дни при 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час 0,043 0,001 0,061 0,002 0,070 0,002 0,085 0,002 0,096 0,002 0,107 0,003 0,095 0,001 0,037 0,001 0,052 0,001 0,060 0,001 0,073 0,001 0,081 0,001 0,090 0,001 0,081 0,002 0,035 0,001 0,050 0,001 0,058 0,001 0,070 0,001 0,078 0,001 0,088 0,001 0,078 0,003 0,030 0,001 0,043 0,001 0,049 0,001 0,059 0,001 0,068 0,001 0,075 0,001 0,067 0,002 0,029 0,002 0,042 0,001 0,048 0,001 0,058 0,001 0,066 0,001 0,073 0,001 0,065 0,002 0,028 0,001 0,041 0,001 0,047 0,001 0,057 0,001 0,064 0,001 0,072 0,001 0,064 0,002 Брой анализирани проби (n) = 5 Таблица 15. Запазване на лихеназната активност на пробите след замразяването им при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване и продължително в хладилник () Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час 7 дни при 86,05 85,25 85,71 85,88 84,38 84,11 85,26 Запазване на лихеназната активност, % 14 дни при 30 дни при 45 дни при 81,40 69,77 67,44 81,97 70,49 68,85 82,86 70,00 68,57 82,35 69,41 68,24 81,25 70,83 68,75 82,24 70,09 68,22 82,11 70,53 68,42 Брой анализирани проби (n) = 5 55 дни при 65,12 67,21 67,14 67,06 66,67 67,29 67,37 От получените резултати може да се направи извода, че замразяването при (-20оС) ( -25оС) е подходящ начин за продължително на ламинариназата и лихеназата. Статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на резултатите, получени за ламинариназната и лихеназната активности при замразяването им при (-20оС) (-25оС), то им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване и продължително в хладилник () показва статистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение на факторите етап на и време на (табл. 16). Таблица 16. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по отношение на факторите етап на и време на след размразяване и на пробите в хладилник () Критерий на Фишер, определен за ламинариназната активност по отношение на фактор: Етап на Време на 184,188 6,595 =0,05 Критерий на Фишер, определен за лихеназната активност по отношение на фактор: Етап на Време на 124, ,751 Таблична стойност на Критерия на Фишер по отношение на фактор: Етап на Време на 1,516 2,438 18

19 2.4. Съхранение посредством лиофилизация Замразяване на пробите при -35оС ± 2оС Изследвани са възможностите за третиране на пробите културална течност, получени при на Trichoderma sp. НБПМКК 405 посредством сублимационно сушене. Параметрите на процеса са представени на таблица 17. Таблица 17. Параметри на сублимационно сушене на пробите, получени при на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Параметър: 1. Обект на изследването 2. Дебелина на слоя, mm 3. Температура на замразяване, ос Стойност: Проби от филтрирана културална течност, получени при на Trichoderma sp. НБПМКК При ± 2.0; Шоково с течен азот при Сублимационно сушене: Температура на сушене, ос о 4.2. Температура в десублиматора, С Налягане в камерата, Ра Температура на доизсушаване, ос Максимална температура на продукта, ос Остатъчно влагосъдържание, % Времетраене на процеса, h 5. Начин на преди сушене при доизсушаване от 20.0 до ,65 28 Във вакуумирани пликове от трислойно алуминиево фолио; съхраняват се в помещения с относителна влажност на въздуха 65% и температура +20оС +22 ос Проучени са остатъчните ензимни активности веднага след лиофилизация, 1 месец и 11 месеца след лиофилизацията на пробите. Фиг. 16 обобщава запазването на ламинариназната активност при продължително на лиофилизатите на стайна температура (20 ± 5оС). Запазване на ламинариназната активност след продължително на лиофилизатите на стайна температура, % веднага след лиофилизация месец след лиофилизация месеца след лиофилизация ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми Eтап от [ h ] Фиг. 16. Запазване на ламинариназната активност след продължително на лиофилизатите на стайна температура (20 ± 5оС) Ламинариназната активност, определена веднага след процеса на лиофилизация се запазва почти непроменена в сравнение с активността, определена по време на на работния щам- намалява приблизително само с 1 до 2,5%. Един месец след в лиофилизирано състояние ламинариназната активност намалява приблизително с 1,5 до 2,5%, а след 11 месечно- приблизително със 7 до 19

20 9%. ователно може да се заключи, че обработката на пробите културална течност чрез лиофилизация и последващото им продължително на стайна температура (20 ± 5оС) е подходящ начин за тяхното по отношение на ламинариназната им активност. Резултатите показват, че тя се запазва в голям процент. Запазването на лихеназната активност след лиофилизация и продължително на лиофилизатите на стайна температура (20± 5оС) е представено на фиг Запазване на лихеназната активност след продължително на лиофилизатите на стайна температура, % веднага след лиофилизация 60 1 месец след лиофилизация 11 месеца след лиофилизация ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми Eтап от [ h ] Фиг. 17. Запазване на лихеназната активност след продължително на лиофилизатите на стайна температура (20± 5оС) Лихеназната активност, определена веднага след процеса на лиофилизация намалява приблизително само с 1 до 2% в сравнение с активността, определена непосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията. Един месец след в лиофилизирано състояние тя намалява приблизително с 1 до 3%, а след 11 месечно - приблизително с 11,5 до 13%. ователно и лихеназната активност се запазва в голям процент при тези условия на и обработката на пробите културална течност чрез лиофилизация и последващото им продължително на стайна температура (20 ± 5оС) е подходящ начин за то им по отношение и на лихеназната активност. В сравнение с процента на запазване на ламинариназната активност, лихеназната активност се запазва в по-малка степен. Като цяло може да се направи извод, че от описаните до момента начини на на пробите в най-голяма степен двете ензимни активности се запазват след процеса на лиофилизация. Така получените резултати за запазването на активността на двата изследвани ензима са проследени след лиофилизация на филтрираната културалната течност, без да се добавят криопротектори. С оглед на това, че лиофилизацията е скъп процес за обработка на биообекти и че двете изследвани активности се запазват с много малки изменения след продължително в лиофилизирано състояние без използването на криопротектори, е преценено същите да не бъдат добавяни допълнително към пробите, тъй като това би оскъпило допълнително самия процес, а оттам ще увеличи и цената на крайния лиофилизиран продукт. Статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на резултатите, получени за ламинариназната и лихеназната активности след лиофилизация и продължително на лиофилизатите на стайна температура, показва статистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение на факторите етап на култивиране и време на на лиофилизатите на стайна температура (табл. 18). 20

21 Таблица 18. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по отношение на факторите време на и етап на култивиране след лиофилизация и продължително на лиофилизатите на стайна температура (20± 5oC) Критерий на Фишер, определен за ламинариназната активност по отношение на фактор: Етап на Време на култивиране 122,826 13,454 =0,05 Критерий на Фишер, определен за лихеназната активност по отношение на фактор: Етап на Време на култивиране 110,927 70,188 Таблична стойност на Критерия на Фишер по отношение на фактор: Етап на Време на култивиране 1,601 3,132 Изчислени са ламинариназната и лихеназната активности на лиофилизата в IU/g веднага след процеса на лиофилизация на пробите, 1 месец и 11 месеца след процеса на лиофилизация на пробите. Резултатите са обобщени в таблица 19 и показват, че ламинариназната активност е приблизително 3, 4 до 5 пъти по-висока от лихеназната. Taблица 19. Ламинариназна и лихеназна активности, определени веднага, 1 месец и 11 месеца след процеса на лиофилизация на пробите, изчислени в IU/g Етап от 24-ти час 48-ми час 72-ри час 96-ти час 120-ти час 144-ти час 168-ми час Ламинариназна активност, IU/g лиофилизат Веднага след 1 месец след лиофилизация лиофилизация 16,03 31,41 37,82 43,08 57,69 65,26 57,31 16,03 31,28 37,82 42,95 57,56 65,13 57,31 11 месеца след лиофилизация 14,87 29,23 35,38 40,51 53,46 61,15 54,62 Лихеназна активност, IU/g лиофилизат Веднага след лиофилизация 5,38 7,69 8,85 10,77 12,05 13,59 12,05 1 месец след лиофилизация 5,38 7,56 8,72 10,77 12,05 13,59 11,92 11 месеца след лиофилизация 4,87 6,92 7,82 9,49 10,90 12,05 10,77 Брой анализирани проби (n) = Замразяване на пробите с течен азот (-196oC): A. Съхранение на замразените с течен азот проби при (-20оС) (-25оС) Определени са ламинариназната и лихеназната активности на проби от 144-тия час на съответно след 7, 14 и 21 дни при. Резултатите са представени в таблица 20. Таблица 20. Ламинариназна и лихеназна активности на пробите от 144-тия час на, замразени с течен азот, размразени в хладилник () и оставени за при Период на анализ Веднага след (преди поставяне за ) 7 дни в хладилник () 14 дни в хладилник () 21 дни в хладилник () Лaминариназна активност, IU/ml Лихеназна активност, IU/ml 0,520 0,027 0,107 0,003 0,504 0,012 0,093 0,001 0,466 0,017 0,087 0,002 0,421 0,017 0,082 0,001 Брой анализирани проби (n) = 5 21

22 На фиг. 18 е представен процентът на запазване на ламинариназната и лихеназната активности на замразените с течен азот проби от 144-тия час на след то им при (-20оС) (-25оС) и последващото им размразяване и при. Ламинариназната активност на пробите след 7 дневно в хладилник при намалява приблизително само с 3% в сравнение с активността, определена по време на на работния щам, а след 21 дни- приблизително с 19%. Лихеназната активност на пробите след 7 дневно при същите условия намалява приблизително с 13% в сравнение с активността, определена по време на на работния щам, а след 21 дни- приблизително с 23%. 100 Запазване на ензимните активности, % ламинариназна активност 50 лихеназна активност след 7 дни в хладилник след 14 дни в хладилник след 21 дни в хладилник Период на анализ Фиг. 18. Изменение на ламинариназната и лихеназната активности на пробите от 144-тия час на, замразени с течен азот, размразени и оставени за при Установено е, че шоковото замразяването с течен азот и последващото при (-20оС) (-25оС) е друг подходящ начин за на ламинариназата и лихеназата. Статистическата обработка чрез дисперсионен еднофакторен анализ на резултатите, получени за ламинариназната и лихеназната активности след замразяването им с течен азот и последващото размразяване и в хладилник (), показва статистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение на фактора време на (табл. 21). Таблица 21. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по отношение на фактора време на след замразяване на пробите с течен азот Критерий на Фишер, определен за ламинариназната активност 7,384 =0,05 Критерий на Фишер, определен за лихеназната активност 21,163 Таблична стойност на Критерия на Фишер 3,885 Б. Лиофилизация след замразяване на пробите с течен азот (-196оС) Определени са ензимните активности на лиофилизати от 144-тия час на в IU/g лиофилизат веднага след лиофилизацията и след 1 месец в лиофилизирано състояние. Резултатите са обобщени в таблица 22. Изчислени са и процентите на запазване на ламинариназната и лихеназната активност при на стайна температура (20± 5оС) на лиофилизатите, получени чрез замразяване с течен азот на пробите културална течност (фиг. 19). 22

23 Таблица 22. Сравнение на ламинариназната и лихеназната активности на лиофилизатите от 144-тия час на, получени при два режима на замразяване: при (-20оС) (-25оС) и след третиране с течен азот (-196oC) Режим на замразяване При (-20оС) (-25оС) Течен азот (-196oC) Лaминариназна активност, IU/g лиофилизат 65,26 Веднага след лиофилизация в лиофилизирано състояние 65,13 1 месец на стайна температура (20±5оС) 63,81 Веднага след лиофилизация в лиофилизирано състояние 62,89 1 месец на стайна температура (20±5оС) Период на анализ Лихеназна активност, IU/g лиофилизат 13,59 13,59 13,43 13,21 Брой анализирани проби (n) = Запазване на ензимните активности, % веднага след лиофилизация ламинариназна активност лихеназна активност 1 месец след лиофилизация веднага след 1 месец след лиофилизация след лиофилизация след замразяване с замразяване с течен азот течен азот Период на анализ Фиг. 19. Запазване на ламинариназната и лихеназната активности, получени при два режима на замразяване: при (-20оС) ( -25оС) и след третиране с течен азот (-196oC) замразяване с течен азот, непосредствена лиофилизация и в лиофилизирано състояние 1 месец на стайна температура (20± 5оС) ламинариназната активност на лиофилизатите намалява приблизително с 6%, а лихеназнатаприблизително с 4%. 3. Електрофореза Проведена бе електрофореза в полиакриламиден гел (SDS-PAGE) на проби лиофилизирана културална течност. На фиг. 20 са представени протеиновите фракции от електрофорезата на различни проби лиофилизирана културална течност. От електрофорезата се вижда, че молекулната маса на ламинариназата е между 75 kda и 70 kda. Подобни данни за молекулната маса на ламинаринази, продуцирани от представители на род Trichoderma дава Nobe и кол. (2003). Поради това, че лихеназата се синтезира от работния щам в минимални количества, определянето на нейната молекулна маса не би било точно. По данни на Sun и кол. (2001) и Celestinol и кол. (2006) молекулната маса на лихеназите варира между 33,7 kda и 35 kda. 23

24 212 kda 170 kda 116 kda 76 kda 66 kda 53 kda Фиг. 20. Електрофореза SDS-PAGE на различни проби лиофилизирана културална течност: 1- лиофилизиран говежди серумен албумин (Fluka) 1 mg/ml с Mw 66 кda; 2лиофилизиран говежди серумен албумин (Fluka) 0,5 mg/ml с Mw 66 кda; 3- протеинов маркер HMW-SDS Calibration Kit на фирмата Amersham Bioscences (глутамат дехидригеназа с Mw 53 kdа, трансферин с Mw 76 kdа, -галактозидаза с Mw 116 kdа, 2-макроглобулин с Mw 170 kdа и миозин с Mw 212 kdа); 4,5,6- проби от лиофилизирана културална течност 4. Получаване на ензимен препарат, продуциран от Trichoderma sp. НБПМКК 405 с ламинариназна и лихеназна активности Разработена е схема за получаване на лиофилизиран ензимен препарат с ламинариназна и лихеназна активности, продуциран от Trichoderma sp. НБПМКК 405 (фиг. 21). Получаване на културална течност при 144- часово култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405 Филтриране на културалната течност Сублимационно сушене във вакуумна сублимационна инсталация HOCHVAKUUM модел TG-16 Лиофилизиран ензимен препарат Поставяне на пробите в тави за сублимационно сушене с дебелина на слоя 10 mm Замразяване на пробите при - 35оС ± 2оС Гамаоблъчване Микробиологично чист лиофилизиран ензимен препарат Фиг. 21. Технологична схема за получаване на ензимен препарат с ламинариназна и лихеназна активности, получен при на Trichoderma sp. НБПМКК