HER2 IQFISH pharmdx Код K то издание HER2 IQFISH pharmdx е анализ с директна флуоресцентна хибридизация in situ (FISH) за количествено определян

Препис

1 HER2 IQFISH pharmdx Код K то издание HER2 IQFISH pharmdx е анализ с директна флуоресцентна хибридизация in situ (FISH) за количествено определяне на генната амплификация на HER2 в проби от тъкани от рак на гърдата, фиксирани във формалин и включени в парафин (FFPE), и FFPE проби от пациенти с аденокарцином на стомаха, включващ хранопроводно-стомашното съединение. Анализът е показан като адювантен на HercepTest при оценяването на пациенти, при които се разглежда лечение с Herceptin. Комплектът съдържа реагенти, достатъчни за 20 теста. P04090BG_02/K стр. 1/70

2 Съдържание Страница Предназначение... 4 Кратко описание и обяснение Гърда... 5 Принцип на процедурата Гърда... 5 Реагенти Гърда... 6 Осигурени материали... 6 Материали, които са необходими, но не са осигурени... 7 Предпазни мерки Гърда... 8 Съхранение Гърда Приготвяне на пробите Гърда Срези, включени в парафин ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА Гърда A. Приготвяне на реагента Гърда А.1 Разтвор за предварителна обработка А.2. Промивен буферен разтвор за цялостно промиване А.3. Промивен буферен разтвор А.4. Серии етанол А.5. Пепсинов разтвор В. Процедура за оцветяване Гърда В.1 Процедурни забележки В.2 Обработка на тъканите преди оцветяване B.3 Протокол за оцветяване Контрол на качеството Гърда Интерпретация на оцветяването Гърда Ограничения Гърда Работни характеристики Гърда Аналитична чувствителност Аналитична специфичност Изследвания на надеждността Повторяемост Възпроизводимост Клинична полезност Откриване и отстраняване на проблеми Гърда Приложение 1 Гърда Приложение 2 Гърда Приложение 3 Гърда Кратко описание и обяснение Стомах Принцип на процедурата Стомах P04090BG_02/K стр. 2/70

3 Реагенти Стомах Осигурени материали Материали, които са необходими, но не са осигурени Микроскопско оборудване и аксесоари Предпазни мерки Стомах Съхранение Стомах Приготвяне на пробите Стомах Срези, включени в парафин ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА Стомах A. Приготвяне на реагента Стомах А.1 Разтвор за предварителна обработка А.2. Промивен буферен разтвор за цялостно промиване А.3. Промивен буферен разтвор А.4. Серии етанол А.5. Пепсинов разтвор В. Процедура на оцветяване Стомах В.1 Процедурни забележки В.2 Обработка на тъканите преди оцветяване B.3 Протокол за оцветяване Контрол на качеството Стомах Интерпретация на оцветяването Стомах Ограничения Стомах Работни характеристики Стомах Аналитична чувствителност Аналитична специфичност Изследвания на надеждността Повторяемост Възпроизводимост Клинична полезност Откриване и отстраняване на проблеми Стомах Приложение 4 - Стомах Приложение 5 Стомах Приложение 6 Стомах Приложение 7 Стомах Библиография Обяснение на символите P04090BG_02/K стр. 3/70

4 Предназначение За употреба при ин витро диагностика. HER2 IQFISH pharmdx е анализ с директна флуоресцентна хибридизация in situ (FISH),предназначен за количественото определяне на генната амплификация на HER2 във фиксирани във формалин, включени в парафин (FFPE) проби от тъкан от рак на гърдата и на FFPE проби от пациенти с аденокарцином на стомаха, включващ хранопроводно-стомашното съединение. HER2 IQFISH pharmdx е показан като адювантен на HercepTest при оценяването на пациенти, за които се предвижда лечение с Herceptin (трастузумаб) (вж. информационната листовка в опаковката на Herceptin ). При пациентките с рак на гърдата резултатите от HER2 IQFISH pharmdx са предназначени да бъдат използвани като адювантни на клиникопатологичната информация, която се използва понастоящем при преценяването на прогнозата при пациенти с рак на гърдата ІІ стадий, с положителни лимфни възли. Аденокарциномът на стомаха, включително хранопроводно-стомашното съединение, също се споменава като рак на стомаха в този документ. За приложение при рак на гърдата, моля, разгледайте страници За приложение при рак на стомаха, моля, разгледайте страници Важно: Моля, забележете разликите между тъканите от рак на гърдата и тъканите от рак на стомаха, особено в разделите за интерпретация на оцветяването P04090BG_02/K стр. 4/70

5 Рак на гърдата Кратко описание и обяснение Гърда Човешкият HER2 ген (известен също като ERBB2 или NEU) е разположен върху хромозома 17 и кодира протеина HER2 или p185 HER2. Протеинът HER2 е мембранен тирозин-киназен рецептор с хомология с рецептора на епидермалния фактор на растежа (EGFR или HER1) (1-2). Генът HER2 присъства в 2 копия във всички нормални диплоидни клетки. При част от пациенти с карцином на гърдата генът HER2 се амплифицира като част от процеса на малигнена трансформация и прогресия на тумора (3-8). Амплификацията на гена HER2 обикновено води до свръхекспресия на протеина HER2 на повърхността на карциномните клетки на гърдата (9). Амплификация на гена HER2 и/или свръхекспресия на неговия протеин се наблюдават при 25 30% от случаите на карцином на гърдата. Тази повишена регулация се асоциира с неточна прогноза, повишен риск от рецидив и по-ниска преживяемост. Редица изследвания демонстрират, че състоянието на HER2 корелира с чувствителността или резистентността към определени режими на химиотерапия (10). Демонстрацията на висока свръхекспресия на протеина HER2 или амплификацията на гена HER2 е съществена за започване на терапия с Herceptin моноклонално антитяло срещу протеин HER2. Клинични изследвания демонстрират, че пациенти, чиито тумори имат висока свръхекспресия на протеин HER2 и/или амплификация на ген HER2, получават най-много полза от Herceptin (11). Принцип на процедурата Гърда HER2 IQFISH pharmdx съдържа всички ключови реагенти, необходими за завършването на една FISH процедура за фиксирани във формалин, включени в парафин проби от тъканни срези. След депарафинизиране и рехидратиране пробите се загряват в разтвор за предварителна обработка, последвана от протеолитно разграждане с пепсин. След стъпките за загряване и протеолитна предварителна обработка в този комплект се използва нетоксичен, готов за употреба комплект от сонди IQISH, базиран на комбинация от технология с ПНК (пептидно-нуклеинова киселина) (12) и ДНК. Комплектът сонди се състои от смес от ДНК сонди, маркирани с Texas Red, покриващи област от 218 kb, включваща ген HER2 върху хромозома 17, и смес от ПНК проби, маркирани с флуоресцеин, насочени към центромерната област на хромозома 17 (CEN-17). Специфичната хибридизация към двете цели води до формиране на отчетлив червен флуоресцентен сигнал при всеки локус на ген HER2 и отчетлив зелен флуоресцентен сигнал при всеки центромер на хромозома 17. След цялостно промиване пробите се заливат с флуоресцентна среда за заливка, съдържаща DAPI (4',6-диамидин-2- фенилиндол) и се поставят на покривно стъкло. С помощта на флуоресцентен микроскоп, снабден с подходящите филтри (вж. приложение 3), се локализират туморните клетки и се извършва преброяване на червените (HER2) и зелените (CEN-17) сигнали. След това се изчислява съотношението HER2/CEN-17. Нормалните клетки в анализирания тъканен срез ще изпълняват ролята на вътрешна положителна контрола на ефективността на предварителната обработка и хибридизацията. За подробности вж. раздела Интерпретация на оцветяването. За интерактивно електронно обучение, моля, използвайте програмата за електронно обучение HER2 IQFISH pharmdx, предназначена да предостави на лаборантите, патолозите и учените точни и бързи познания как да постигнат оптимални резултати с помощта на HER2 IQFISH pharmdx: P04090BG_02/K стр. 5/70

6 Рак на гърдата Реагенти Гърда Осигурени материали Изброените по-долу материали са достатъчни за 20 теста (за тест е определен един целеви участък от 22 мм x 22 мм). Броят на тестовете се базира на използването на 250 µl на предметно стъкло от флакон 2 (5 8 капки), 10 µl на предметно стъкло от флакон 3 и 15 µl на предметно стъкло от флакон 5. Разтворите във флакон 3 и флакон 5 са вискозни и може да се наложи за кратко да се центрофугират в микроцентрофуга, за да се събере целият предоставен реагент. Комплектът предоставя материали, достатъчни за 10 отделни процедури за оцветяване (четири отделни процедури, когато се използва методът с потапяне в пепсин). HER2 IQFISH pharmdx се доставя върху сух лед. За да се гарантира, че компонентите на комплекта не са излагани на високи температури при транспортиране, при получаване на пратката сухият лед трябва да се съдържа в нея. Отбележете, че някои от компонентите на комплекта могат да останат неразмразени това няма да повлияе на функционирането на HER2 IQFISH pharmdx. Флакон 1 Флакон 2А Флакон 2В Флакон 3 Флакон 4 Разтвор за предварителна обработка (20x) 150 ml, концентриран 20x Буферен разтвор на MES (2-[N-морфолино]етансулфонова киселина). Пепсин 4 x 6.0 ml, готов за употреба Разтвор на пепсин, ph 2,0; съдържа стабилизатор и антимикробен агент. Разтворител за пепсин (10х) 24 ml, концентриран 10x Буферен разтвор за разтваряне, рн 2,0, съдържа антимикробен агент. Комплект сонди HER2/CEN-17 IQISH 0,2 ml, готов за употреба Смес от ДНК сонди на HER2, маркирани с Texas Red, и ПНК сонди на CEN-17, маркирани с флуоресцеин; доставени в буферен разтвор за IQISH хибридизация. Промивен буферен разтвор за цялостно промиване (20x) 150 ml, концентриран 20x SSC (физиологичен разтвор на натриев цитрат) буферен разтвор с почистващ препарат (Tween-20). P04090BG_02/K стр. 6/70

7 Рак на гърдата Флакон 5 Флакон 6 Флуоресцентна среда за заливка 0,4 ml, готов за употреба Флуоресцентна среда за заливка с 500 µg/l DAPI (4,6-диамидин-2-фенилиндол). Промивен буферен разтвор (20x) 500 ml, концентриран 20x Трис/HCl буферен разтвор. Уплътнител на покривно стъкло 1 епруветка, готова за употреба Разтвор за отстраняемо уплътнение на покривни стъкла. ЗАБЕЛЕЖКА: Следните реагенти в комплекта: Разтвор за предварителна обработка (20x), Пепсин, Разтворител за пепсин (10x), Промивен буферен разтвор за цялостно промиване (20x), Флуоресцентна среда за заливка, Промивен буферен разтвор (20x) и Уплътнител на покривното стъкло са взаимно заменяеми със съответните реагенти в Dako Histology FISH Accessory Kit, код K5799. Материали, които са необходими, но не са осигурени Лабораторни реагенти Дестилирана или дейонизирана вода Етанол, 96 % Ксилен или заместители на ксилен Лабораторно оборудване Абсорбиращи салфетки Регулируеми пипети Калибриран термометър с частично потапяне (диапазон C) Калибриран повърхностен термометър (диапазон C) Покривни стъкла (22 мм х 22 мм) Форцепс Пароуловител Dako Hybridizer (код S2450 или S2451)* Нагревателен блок или хибридизация* Камера за влажна хибридизация* Микроцентрофуга Слайдове, Dako Silanized Slides, код S3003 или слайдове с покритие от поли-l-лизин (вж. Приготвяне на пробите ) Стъклени съдове или вани за оцветяване Таймер (с възможност за работа с интервали от 2 15 минути) Вихров миксер P04090BG_02/K стр. 7/70

8 Рак на гърдата Водна вана с капак (с възможности за поддържане на 37(±2) C, 63 (±2) C и от 95 C до 99 C) Микровълнова печка с функция чувствителност, ако предварителната обработка се извършва с помощта на микровълнова печка (вж. B3. Протокол за оцветяване. стъпка 1: Предварителна обработка, метод B) * Нагревателен блок или хибридизационна сушилня за денатурация (66 (±1) C) и хибридизация (45 (±2) C) заедно с камера за влажна хибридизация могат да се използват като алтернатива на Dako Hybridizer. Микроскопско оборудване и аксесоари Филтри за микроскоп с флуоресценция: DAPI и FITC/Texas Red двоен филтър или FITC и Texas Red монофилтри вж. приложение 3 за подробности. Трябва да се използва микроскоп с флуоресценция със 100-ватова живачна лампа като източник на светлина. С тези филтри не се препоръчват други източници на светлина. Комплект микроскопски слайдове (картонена табла за 20 слайда с капак с панти или подобна). Предпазни мерки Гърда 1. За употреба при ин витро диагностика. 2. За професионална употреба. 3. Флакон 1, Pre-Treatment Solution (20x), не изисква етикетиране на опасност. Информационни листове за безопасност на материала (SDS) се предоставят на професионалните потребители при поискване. 4. Флакон 2a, Pepsin, съдържа 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, и <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one и 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Флакон 2a е обозначен като: Опасно H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Причинява тежки изгаряния на кожата и сериозно увреждане на очите. Може да причини алергична кожна реакция. Използвайте предпазни ръкавици/предпазни очила/предпазна маска за лице/предпазно облекло. ПРИ ВДИШВАНЕ: Изведете лицето на чист въздух и го поставете в позиция, улесняваща дишането. Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. ПРИ ПОГЛЪЩАНЕ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. НЕ предизвиквайте повръщане. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ. Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар/. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. Да се съхранява под ключ. Съдържанието и съдът да се изхвърли съобразно всички местни, регионални, национални и международни разпоредби. 5. Флакон 2B, Pepsin Diluent (10x), съдържа 50-<75% propan-2-ol и 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Флакон 2B е обозначен като: P04090BG_02/K стр. 8/70

9 Рак на гърдата Опасно H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Силно запалими течност и пари. Предизвиква сериозно дразнене на очите. Може да предизвика сънливост или световъртеж. Използвайте предпазни ръкавици/предпазни очила/предпазна маска за лице/предпазно облекло. Да се пази от топлина, нагорещени повърхности, искри, открит пламък, и други източници на запалване. Тютюнопушенето забранено. Използвайте електрическо, проветряващо, осветително и работно оборудване, обезопасено срещу експлозия. ПРИ ВДИШВАНЕ: Изведете лицето на чист въздух и го поставете в позиция, улесняваща дишането. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ. Да се държи на хладно. Съдържанието и съдът да се изхвърли съобразно всички местни, регионални, национални и международни разпоредби. 6. Флакон 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, съдържа 10-<25% ethylene carbonate и 3- <5% sodium chloride. Флакон 2B е обозначен като: Внимание H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Предизвиква сериозно дразнене на очите. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. 7. Флакон 4, Stringent Wash Buffer (20x), съдържа 10-<25% sodium chloride, и 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Флакон 4 е обозначен като: H319 H315 P280 Внимание P264 P305 + P351 + P338 Предизвиква сериозно дразнене на очите. Предизвиква дразнене на кожата. Използвайте предпазни ръкавици. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. 8. Флакон 6, Wash Buffer (20), съдържа 10-<25% sodium chloride и 10-<20% trometamol. Флакон 6 е обозначен като: P04090BG_02/K стр. 9/70

10 Рак на гърдата H319 H315 P280 Внимание P264 P305 + P351 + P338 Предизвиква сериозно дразнене на очите. Предизвиква дразнене на кожата. Използвайте предпазни ръкавици. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. 9. Coverslip Sealant съдържа 100 % хидроочистена лека нафта (петрол) и е обозначен като: Опасно H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Силно запалими течност и пари. Може да бъде смъртоносен при поглъщане и навлизане в дихателните пътища. Токсичен за водните организми, с дълготраен ефект. Използвайте предпазни ръкавици. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се пази от топлина, нагорещени повърхности, искри, открит пламък, и други източници на запалване. Тютюнопушенето забранено. Използвайте електрическо, проветряващо, осветително и работно оборудване, обезопасено срещу експлозия. Да се избягва изпускане в околната среда. ПРИ ПОГЛЪЩАНЕ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. НЕ предизвиквайте повръщане. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ. Да се държи на хладно. Съдържанието и съдът да се изхвърли съобразно всички местни, регионални, национални и международни разпоредби. 10. Пробите, преди и след фиксиране, и всички материали, влизащи в контакт с тях, трябва да се третират като евентуални преносители на инфекция и трябва да се изхвърлят с прилагане на подходящи предпазни мерки (13). Никога не преливайте реагентите с уста и не позволявайте на реагентите и пробите да влизат в контакт с кожата и лигавиците. Ако реагентите влязат в контакт с чувствителни области, промийте с обилно количество вода. 11. Сведете до минимум микробното замърсяване на реагентите, за да избегнете неточни резултати. 12. Времена и температури на инкубация или методи, различни от определените, могат да доведат до неточни резултати. 13. Методите за фиксиране на тъкани и дебелината на пробата, различни от определените, могат да окажат влияние на морфологията на тъканите и/или интензивността на сигнала. P04090BG_02/K стр. 10/70

11 Рак на гърдата 14. Избягвайте изпарение на комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH по време на хибридизация, като осигурите достатъчна влажност в камерата за хибридизация. 15. Реагентите са разредени в оптимално съотношение. Допълнителното разреждане може да доведе до влошаване на работните характеристики. 16. Носете подходяща лична защитна екипировка, за да избегнете контакт с очите и кожата. За допълнителна информация, моля, направете справка с информационния лист за безопасност на материала (SDS). 17. За метода с потапяне в пепсин (стъпка 2, метод С) трябва да се използват само чисти съдове за оцветяване. Съхранение Гърда Съхранявайте комплекта от сонди HER2/CEN-17 IQISH (флакон 3) при -18 C на тъмно. Всички други реагенти могат да бъдат съхранявани при 2 8 C на тъмно. Всички реагенти допускат съхранение в замразен вид. Замразяването и размразяването на реагентите до максимум 10 пъти не повлиява работните им характеристики. Пепсин, комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH и флуоресцентната среда за заливка (флакони 2A, 3 и 5) могат да бъдат неблагоприятно засегнати, ако са изложени на топлина. Не оставяйте тези компоненти на стайна температура. Комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH и флуоресцентната среда за заливка (флакони 3 и 5) могат да бъдат неблагоприятно засегнати, ако са изложени на прекомерни нива на светлина. Не съхранявайте тези компоненти и не извършвайте анализ при силна светлина, като например пряка слънчева светлина. Не използвайте комплекта след изтичане на срока на годност, указан върху кутията на комплекта. Ако реагентите се съхраняват при условия, различни от посочените в информационната листовка в опаковката, потребителят трябва да провери работните характеристики на реагента (14). Не съществуват видими признаци, които да показват нестабилност на този продукт. Следователно е важно да се оценят нормалните клетки в анализирания тъканен срез. Свържете се с отдел Техническа поддръжка на Dako, ако се наблюдава необичаен тип флуоресценция, която не може да се обясни с вариации в лабораторните процедури, и има съмнение за проблем с HER2 IQFISH pharmdx. P04090BG_02/K стр. 11/70

12 Рак на гърдата Приготвяне на пробите Гърда Пробите от биопсии, ексцизии или резекции трябва да се третират за запазване на тъканите за FISH анализ. Стандартните методи на обработка на тъканите за имуноцитохимично оцветяване трябва да се използват за всички проби (15). Срези, включени в парафин Само тъкани, съхранени в неутрален буфериран формалин и включени в парафин, са подходящи за употреба. Например, пробите трябва да се блокират в дебелина от 3 или 4 мм и трябва да се фиксират за часа в неутрален буфериран формалин. След това тъканите се дехидрират чрез степенувани серии етанол и ксилен, последвано от инфилтриране с разтопен парафин, осъществено при температура не по-голяма от 60 C. Правилно фиксираните и включени тъкани ще се запазят за неопределено време преди оформяне на срезите и поставяне на слайд, ако се съхраняват на хладно място (15 25 C) (15-16). Други фиксатори не са подходящи. Тъканните проби трябва да се разделят на срези от 4 6 µm. Слайдовете, необходими за анализ на амплификацията на ген HER2 и за проверка за наличието на тумор, трябва да се приготвят по едно и също време. Препоръчват се минимум 2 поредни среза, 1 срез за наличие на тумор, оцветен с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване), и 1 срез за анализ на амплификацията на ген HER2. Препоръчва се тъканните срези да се заливат на Dako Silanized Slides, код S3003, или на слайдове с покритие от поли- L-лизин. Пробите трябва да се анализират в рамките на 4 6 месеца от оформянето на срезите, когато са съхранявани при стайна температура (20 25 C). P04090BG_02/K стр. 12/70

13 Рак на гърдата ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА Гърда A. Приготвяне на реагента Гърда Преди оцветяване е удобно да се приготвят следните реагенти: А.1 Разтвор за предварителна обработка Във флакон 1 могат да се появят кристали, но те ще се разтворят при стайна температура. Преди приготвянето на реагента се уверете, че няма налични кристали. Разредете достатъчно количество от флакон 1 (Разтвор за предварителна обработка 20x) чрез разреждане на концентрата 1:20 в дестилирана или дейонизирана вода. Неизползваният разреден разтвор може да се съхранява при температура 2 8 C в продължение на един месец. Изхвърлете разредения разтвор, ако изглежда мътен. А.2. Промивен буферен разтвор за цялостно промиване Разредете достатъчно количество от флакон 4 (Промивен буферен разтвор за цялостно промиване 20x), чрез разреждане на концентрата 1:20 в дестилирана или дейонизирана вода. Неизползваният разреден буферен разтвор може да се съхранява при температура 2 8 C в продължение на един месец. Изхвърлете разредения буферен разтвор, ако изглежда мътен. А.3. Промивен буферен разтвор Разредете достатъчно количество от флакон 6 (Промивен буферен разтвор 20x), чрез разреждане на концентрата 1:20 в дестилирана или дейонизирана вода. Неизползваният разреден буферен разтвор може да се съхранява при температура 2 8 C в продължение на един месец. Изхвърлете разредения буферен разтвор, ако изглежда мътен. А.4. Серии етанол От 96 % разтвор на етанол пригответе 3 стъклени съда със съответно 70 %, 85 % и 96 % етанол. Съхранявайте покритите стъклени съдове при стайна температура или при температура от 2 8 C и ги използвайте за максимум 200 слайда. Изхвърлете разтворите, ако изглеждат мътни. А.5. Пепсинов разтвор Пепсинов разтвор е необходим, само когато се използва методът за потапяне в пепсин (метод C). Пригответе пепсинов разтвор, както следва: За контейнер с капацитет шест слайда пригответе 60 ml пепсинов разтвор: Добавете в контейнера 48 ml дестилирана или дейонизирана вода със стайна температура (20 25 C). Прибавете 6 ml студен (2 8 C) Разтворител за пепсин (10x) (флакон 2B) в контейнера. Прибавете 6 ml студен (2 8 C) Пепсин (флакон 2A) в контейнера. Поставете капака на контейнера и изравнете пепсиновия разтвор до 37 (±2) C във водна вана. За контейнер с капацитет 24 слайда пригответе 240 ml пепсинов разтвор: Добавете в контейнера 192 ml дестилирана или дейонизирана вода със стайна температура (20 25 C). Прибавете 24 ml студен (2 8 C) Разтворител за пепсин (10x) (флакон 2B) в контейнера. Прибавете 24 ml студен (2 8 C) Пепсин (флакон 2A) в контейнера. Поставете капака на контейнера и изравнете пепсиновия разтвор до 37 (±2) C във водна баня. Изравненият пепсинов разтвор трябва да се използва в рамките на 5 часа. P04090BG_02/K стр. 13/70

14 Рак на гърдата В. Процедура за оцветяване Гърда В.1 Процедурни забележки Потребителят трябва да прочете внимателно тези инструкции и да се запознае с всички компоненти преди употреба (вж. Предпазни мерки ). Преди употреба всички реагенти трябва да достигнат съответната температура, както следва: Флакон 1: Разреденият разтвор за предварителна обработка трябва да достигне температура от C, ако за предварителна обработка се използва водна баня (B3. Протокол за оцветяване, стъпка 1: Предварителна обработка, метод А). Ако за предварителна обработка се използва микровълнова печка с функция чувствителност (B3. Протокол за оцветяване, стъпка 1: Предварителна обработка, метод B), разреденият разтвор за предварителна обработка трябва да достигне стайна температура от C. Флакон 2А: Пепсинът трябва да се нанася при 2 8 C (B3, Протокол за оцветяване, стъпка 2: метод A и B) и постоянно да се държи студен. Флакон 2В: Разтворителят за пепсин (10x) трябва да се нанася при 2 8 C (B3, Протокол за оцветяване, стъпка 2: метод C). Флакон 3: Комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH се разделя на две фази по време на съхранението му при -18 C. Преди да използвате флакон 3, проверете дали е налична само една фаза, като изравните комплекта от сонди до стайна температура (20 25 C), а след това миксирате. Размразете флакон 3 на стайна температура (20 25 C) за максимум 30 минути (пазете от силна светлина), след това старателно центрофугирайте флакона за 15 секунди на 2500 об/мин с помощта на вихров миксер. Съхранявайте флакон 3 при -18 C веднага след употреба. Флакон 4: Разреден промивен буферен разтвор за цялостно промиване - преди употреба единият стъклен съд трябва да бъде изравнен до стайна температура, другият стъклен съд трябва да бъде изравнен до 63 (±2) C. Флакон 5: Флуоресцентната среда за заливка може да се използва при всякаква температура от 2 25 C. Флакон 6: Разреденият промивен буферен разтвор трябва да бъде изравнен до стайна температура C. Уплътнителят за покривно стъкло може да се използва при всякаква температура от 2 25 C. Всички стъпки трябва да се извършват при посочените температури. Процедурата включва няколко дехидратации, последвани от изсушаване на тъканните срези. Уверете се, че тъканните срези са напълно изсъхнали, преди да преминете към следващата стъпка. Не позволявайте на тъканните срези да изсъхнат по време на другите процедурни стъпки. Ако процедурата за оцветяване трябва да се прекъсне, слайдовете може да се съхраняват в промивен буферен разтвор след стъпката на депарафинизация за период до 1 час при стайна температура (20 25 C), без това да окаже влияние на резултатите. В.2 Обработка на тъканите преди оцветяване Депарафинизация и повторна хидратация: Преди извършване на анализ тъканните слайдове трябва да се депарафинизират за отстраняване на средата за включване и да се хидратират повторно. Отстранете парафина изцяло. Неотстранената среда за включване ще доведе до увеличено неспецифично оцветяване. Тази стъпка трябва да се извърши на стайна температура (20 25 C). 1. Поставете слайдовете в баня с ксилен и инкубирайте в продължение на 5 (±1) минути. Сменете баните и повторете още веднъж. P04090BG_02/K стр. 14/70

15 Рак на гърдата 2. Отстранете излишната течност и поставете слайдовете в 96 % етанол за 2 (±1) минути. Сменете баните и повторете още веднъж. 3. Отстранете излишната течност и поставете слайдовете в 70 % етанол за 2 (±1) минути. Сменете баните и повторете още веднъж. 4. Отстранете излишната течност и поставете слайдовете в разреден промивен буферен разтвор (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.3) за минимум 2 минути. Започнете процедурата за оцветяване, както е посочено в раздел B.3, стъпка 1, Предварителна обработка. Разтвори на ксилен и алкохол трябва да се сменят след 200 слайда или по-малко. Може да се използват заместители на ксилен. ЗАБЕЛЕЖКА: Реагентите и инструкциите, предоставени с този комплект, са предназначени за достигане на оптимални резултати. Допълнителното разреждане на реагентите или промяната на температурата на инкубация могат да доведат до неточни или противоречиви резултати. Разликите в обработката на тъканите и техническите процедури в лабораторията на потребителя могат да направят резултатите от анализа невалидни. B.3 Протокол за оцветяване Стъпка 1: Предварителна обработка Предварителната обработка може да се извърши с помощта на водна баня, както е описано в метод A) или, като алтернатива чрез използване на микровълнова печка с функция чувствителност, както е описано в метод В). Метод A: Предварителна обработка с помощта на водна баня Напълнете два стъклени съда за оцветяване, например съдове на Coplin, с разреден разтвор за предварителна обработка (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.1). Поставете стъклените съдове за оцветяване, съдържащи разреден разтвор за предварителна обработка, във водна баня. Нагрейте водната баня и разтвора за предварителна обработка до C. Измерете температурата в стъкления съд с калибриран термометър за гарантиране на правилна температура. Покрийте стъклените съдове с капаци, за да стабилизирате температурата и избегнете изпарение. Потопете депарафинизираните срези със стайна температура в предварително нагретия разтвор за предварителна обработка в стъклените съдове за оцветяване. Проверете отново температурата и инкубирайте в продължение на 10 (±1) минути при C. Отстранете целия стъклен съд със слайдове от водната баня. Отстранете капака и оставете слайдовете да се охладят в разтвора за предварителна обработка в продължение на 15 минути при стайна температура. Преместете слайдовете в стъклен съд с разреден промивен буферен разтвор (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.3) за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите в продължение на още 3 минути. ЗАБЕЛЕЖКА: Разтворът за предварителна обработка е предназначен само за еднократна употреба. Не използвайте повторно. Метод В: Предварителна обработка с използване на микровълнова печка с функция чувствителност Напълнете пластмасов съд с разреден разтвор за предварителна обработка със стайна температура (20 25 C). Потопете депарафинизираните срези в разтвора за предварителна обработка, покрийте стъкления съд с капак с отвор и го поставете в P04090BG_02/K стр. 15/70

16 Рак на гърдата микровълновата печка. Изберете функцията на сензора за кипене и програма, която се активира за 10 минути след достигане на температурата на кипене*. След 10-те минути инкубация извадете стъкления съд със слайдовете извън печката, отстранете капака и охладете в продължение на 15 минути при стайна температура. Преместете слайдовете в стъклен съд с разреден промивен буферен разтвор и напоете срезите за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите в продължение на още 3 минути. * Употребата на микровълнова печка с функция чувствителност означава, че тя трябва да притежава сензор и програми, които първоначално нагряват разтвора за предварителна обработка до точката на кипене, а впоследствие поддържат необходимата температура на предварителна обработка (над 95 ºC), като отброяват обратно предварително зададеното време (10 (±1) минути). Някои модели микровълнови печки с функция чувствителност може да не притежават функция за свободно задаване на време за обратно отброяване. Ако моделът включва само предварително зададени програми, изберете програмата, която поддържа необходимата температура на предварителна обработка (над 95 ºC) за минимум 10 (±1) минути, и спрете програмата ръчно след 10 (±1) минути. ЗАБЕЛЕЖКА: Разтворът за предварителна обработка е предназначен само за еднократна употреба. Не използвайте повторно. Стъпка 2: Пепсин, готов за употреба (RTU) или пепсинов разтвор Инкубацията в пепсин може да се извърши чрез директно нанасяне на готовите за ползване пепсинови капки върху слайдовете при стайна температура (20 25 C) (метод A) или при 37 C (метод B). Алтернативно, слайдовете могат да бъдат потопени в пепсинов разтвор и инкубирани при 37 (±2) C (метод C). Метод А и метод В: Отстранете излишния буферен разтвор. С помощта на меко чисто парче плат/салфетка без власинки (като например попивателна салфетка или марля) внимателно избършете около пробата, за да отстраните останалата течност и да задържите реагентите в указаната област. Приложете 5 8 капки (250 µl) студен (2 8 C) пепсин (флакон 2А), за да покриете пробата. Винаги съхранявайте пепсин при температура от 2 8 C. Метод A: Пепсин, готов за употреба инкубация при C Инкубирайте за 5 15 минути при стайна температура (20 25 C). Инкубация в продължение на 5 15 минути ще бъде подходяща за повечето проби, но оптималното време на инкубация може да зависи от фиксирането на тъканите и/или от дебелината на пробата и трябва да се определи от потребителя. Отстранете излишния пепсин и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.3) за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете разредения промивен буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Преминете към дехидратация. Метод В: Пепсин, готов за употреба инкубация при 37 C Поставете пробата с пепсин върху нагревателен блок с температура 37 C напр. Dako Hybridizer и инкубирайте в продължение на 3 5 минути. Инкубация в продължение на 3 5 минути ще бъде подходяща за повечето проби, но оптималното време на инкубация може да зависи от фиксирането на тъканите и/или от дебелината на пробата и трябва да се определи от потребителя. Отстранете излишния пепсин и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Преминете към дехидратация. Дехидратирайте тъканните срези през градуирана серия етанол: 2 минути в 70 % етанол, 2 минути в 85 % етанол и 2 минути в 96 % етанол. Оставете тъканните срези да изсъхнат напълно на въздух. P04090BG_02/K стр. 16/70

17 Рак на гърдата Метод С: Пепсинов разтвор потапяне на слайдовете в пепсинов разтвор при температура 37 C Комплектът съдържа реагенти, достатъчни за четири отделни процедури (60 ml пепсинов разтвор, малък контейнер за шест слайда) или единична процедура (240 ml пепсинов разтвор, голям контейнер за 24 слайда). Пригответе пепсиновия разтвор по указанията в раздел A.5. Поставете капака на контейнера и изравнете пепсиновия разтвор до 37 (±2) C във водна баня. Уверете се, че температурата се е стабилизирала. Измерете температурата в контейнера с калибриран термометър, за да обезпечите точната температура. Отстранете излишния промивен буферен разтвор. Потопете слайдовете в пепсиновия разтвор с температура 37 (±2) C и инкубирайте в продължение на минути. Инкубация в продължение на минути ще бъде подходяща за повечето проби, но оптималното време на инкубация може да зависи от фиксирането на тъканите и/или от дебелината на пробата и трябва да се определи от потребителя. Отстранете излишния пепсинов разтвор и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Преминете към дехидратация. Дехидратирайте тъканните срези през градуирана серия етанол: 2 минути в 70 % етанол, 2 минути в 85 % етанол и 2 минути в 96 % етанол. Оставете тъканните срези да изсъхнат напълно на въздух. Стъпка 3: Комплект сонди HER2/CEN-17 IQISH Комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH се разделя на две фази по време на съхранението му при -18 C. Преди да използвате флакон 3, проверете дали е налична само една фаза, като изравните комплекта от сонди до стайна температура (20 25 C), а след това миксирате. Размразете флакон 3 на стайна температура (20 25 C) за максимум 30 минути (пазете от силна светлина), след това старателно центрофугирайте флакона за 15 секунди на 2500 об/мин с помощта на вихров миксер. Съхранявайте флакон 3 при -18 C веднага след употреба. Поставете 10 µl от комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH (флакон 3) в центъра на тъканния срез. Незабавно поставете покривно стъкло с размери 22 мм x 22 мм над комплекта сонди, като му позволите да се разстели равномерно под покривното стъкло. Не допускайте въздушни мехурчета. Ако забележите въздушни мехурчета, внимателно ги отстранете от тъканта с помощта на форцепс. Помнете, че трябва да съхранявате флакон 3 при -18 C веднага след употреба. Уплътнете покривното стъкло с уплътнителя на покривното стъкло чрез инжектиране на уплътнителя около периферията на покривното стъкло. Позволете на уплътнителя на покривното стъкло да припокрие покривното стъкло и слайда, като по този начин създаде уплътнение около покривното стъкло. Уверете се, че уплътнителят на покривното стъкло покрива целия край на покривното стъкло. Пригответе Dako Hybridizer* (код S2450 или S2451) за процедура на хибридизация. Уверете се, че Humidity Control Strips (код S2452) са сатурирани и оптимални за употреба. Стартирайте хибридизатора и изберете програма, с която ще: Денатурирате при 66 C за 10 минути, след това ще извършите хибридизация при 45 C в продължение на минути. Поставете слайдовете в хибридизатора, уверете се, че капакът е правилно затворен и стартирайте програмата. Моля, обърнете се към Ръководството с инструкции на Dako Hybridizer за допълнителна информация. * Инструменти, подходящи за условия, идентични с описаните по-горе, може да се използват за денатурация и хибридизация: P04090BG_02/K стр. 17/70

18 Рак на гърдата Поставете слайдовете върху равна метална или каменна повърхност (нагревателен блок или върху блок в сушилнята за хибридизация), предварително загрята до 66 (±1) C. Денатурирайте за точно 10 минути. Поставете слайдовете в подгрята овлажнена камера за хибридизация. Покрийте камерата с капак и инкубирайте при 45 (±2) C в продължение на минути. Моля, отбележете, че температурата за хибридизация 37 C не е подходяща за използване със сондите, съдържащи се в този комплект. Стъпка 4: Цялостно промиване Напълнете два стъклени съда за оцветяване, напр. съдове на Coplin, с разреден промивен буферен разтвор за цялостно промиване (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.2). Препоръчва се минимален обем от 100 ml или 15 ml на слайд във всеки стъклен съд. Поставете един от стъклените съдове за оцветяване, съдържащ разреден промивен буферен разтвор за цялостно промиване със стайна температура в пароуловител, а другия във водна баня. Нагрейте водната баня и разредения промивен буферен разтвор за цялостно промиване до 63 (±2) C. Уверете се, че температурата се е стабилизирала. Покрийте стъкления съд с капак за стабилизиране на температурата и избягване на изпарение. Измерете температурата в стъкления съд с водна баня с калибриран термометър, за да гарантирате правилна температура. Промивният буферен разтвор за цялостно промиване съдържа детергент и може да стане мътен при 63 C това няма да засегне работните характеристики. С помощта на форцепс или ръкавици вземете слайдовете от камерата за хибридизация и внимателно отстранете уплътнителя на покривното стъкло, както и покривното стъкло, и поставете слайдовете, един по един, в стъкления съд за предварително промиване, който е със стайна температура. Когато всички покривни стъкла бъдат отстранени, прехвърлете слайдовете от съда за предварително измиване със стайна температура в съда с водна баня с температура 63 (±2) C. Таймерът трябва да бъде стартиран веднага след прехвърлянето на слайдовете в разредения промивен буферен разтвор за цялостно промиване с температура 63 (±2) C във водната баня. Извършете цялостно промиване точно за 10 минути. Извадете слайдовете от разредения промивен буферен разтвор за цялостно промиване и напоете срезите в разреден промивен буферен разтвор в продължение на 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете разредения промивен буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Дехидратирайте тъканните срези през градуирана серия етанол: 2 минути в 70 % етанол, 2 минути в 85 % етанол и 2 минути в 96 % етанол. Оставете тъканните срези да изсъхнат напълно. Стъпка 5: Заливка Поставете 15 µl флуоресцентна среда за заливка, съдържаща DAPI (флакон 5), в целевата област на слайда и поставете стъклено покривно стъкло. ЗАБЕЛЕЖКА: Слайдовете могат да бъдат разчитани след 15 минути или в рамките на 7 дни след заливката. Все пак, настъпва избледняване, ако слайдовете бъдат изложени на светлина или високи температури. За да се намали до минимум избледняването, съхранявайте слайдовете на тъмно при C. P04090BG_02/K стр. 18/70

19 Рак на гърдата Контрол на качеството Гърда 1. Сигналите трябва да бъдат ярки, отчетливи и лесни за оценяване. 2. Нормалните клетки позволяват вътрешен контрол на процедурата за оцветяване. Нормалните клетки трябва да имат 1 2 ясно видими зелени сигнала, показващи, че сондата с ПНК за CEN-17 успешно е хибридизирала до центромерната област на хромозома 17. Нормалните клетки трябва да имат и 1 2 ясно видими червени сигнала, показващи, че сондата с ДНК за HER2 успешно е хибридизирала до ампликона на HER2. Заради формирането на тъканните срези някои нормални клетки ще имат по-малко от очакваните 2 сигнала от всеки цвят. Невъзможността да се откриват сигнали в нормалните клетки показва неуспешен анализ и резултатите трябва да се считат за невалидни. 3. Нуклеарната морфология трябва да бъде интактна при оценяването с помощта на DAPI филтър. Многобройните призрачни клетки и общата зле изразена морфология на ядрата показва висока степен на разграждане на пробата, което е причина за загуба или прекъснатост на сигналите. Такива проби трябва да се считат за невалидни. 4. Разликите във фиксирането, обработването и включването на тъканите в лабораторията на потребителя могат да доведат до променливи резултати, изискващи редовна оценка на вътрешните контроли. Интерпретация на оцветяването Гърда Оценявана тъкан Само проби от пациенти с инвазивен карцином трябва да се тестват. При преинвазивен карцином и инвазивен карцином в една и съща проба, само инвазивният компонент трябва да се оценява. Избягвайте области с некроза и области, в които границите на ядрото са неясни. Не включвайте ядра, които изискват субективна оценка. Пропуснете ядрата със слаба интензивност на сигнала и неспецифичен или силен фон. Преброяване на сигналите: Локализирайте тумора в рамките на контекста на слайда, оцветен с H&E, и оценете същата област върху слайда, оцветен с FISH. Сканирайте няколко области с туморни клетки за евентуална хетерогенност. Изберете област с добро ядрено разпределение. Започнете анализа в горния ляв квадрант на избраната област и сканирайки отляво надясно, пребройте сигналите в рамките на границата на ядрото на всяко оценено ядро според указанията по-долу (вж. приложение 3). - Фокусирайте горе и долу, за да откриете всички сигнали в индивидуалното ядро. - Отброявайте два сигнала, които са с еднакъв размер и са разделени с разстояние, равно на диаметъра на сигнала или по-малко от него, само като един сигнал. - При ядрата с високи нива на амплификация на ген HER2 сигналите на HER2 може да са разположени много близо един до друг, образувайки сноп от сигнали. В тези случаи броят на сигналите на HER2 не може да се определи, а трябва да бъде приблизително изчислен. Специално внимание трябва да се обърне на зелените сигнали, тъй като сноповете от сигнали на HER2 могат да покрият зелените сигнали, поради което няма да е възможно те да бъдат забелязани. При съмнение моля да проверите зелените сигнали с помощта на специфичен FITC филтър. Не оценявайте ядра без сигнали или с едноцветни сигнали. Оценявайте само ядра с един или повече FISH сигнали от всеки цвят. P04090BG_02/K стр. 19/70

20 Рак на гърдата Указания за преброяване на сигналите 1 Не преброявайте. Ядрата се припокриват, не всички части на ядрата са видими 2 Два зелени сигнала, не оценявайте ядра само с едноцветни сигнали 3 Пребройте като 3 зелени и 12 червени сигнала (оценка на снопа) 4 Пребройте като 1 зелен и 1 червен сигнал. Два сигнала с еднакъв размер и разделени с разстояние, равно на диаметъра на един сигнал или по-малко от него, се броят за един 5 Не преброявайте (висока степен на разграждане на или ядрата или недостатъчното им разграждане). Липсващи сигнали в центъра на ядрата (ядра с пръстеновидна форма). 6 Пребройте като 2 зелени и 3 червени сигнала. Два сигнала с еднакъв размер и разделени с разстояние, равно на диаметъра на един сигнал или по-малко от него, се броят за един 7 Пребройте като 1 зелен и 5 червени сигнала 8 Пребройте като 3 зелени (1 зелен извън фокус) и 3 червени сигнала 9 Сноп от червени сигнали, скриващи зелените сигнали, проверете зелените сигнали със специфичен FITC филтър, или не ги бройте Запишете отчетения брой в таблица, както е показано в приложение 2. Пребройте 20 ядра за тъканна проба, когато е възможно, от различни туморни области (17). Изчислете съотношението HER2/CEN-17, като разделите общия брой червени сигнали на HER2 на общия брой зелени сигнали на CEN-17. Пробите със съотношение на HER2/CEN-17, по-голямо или равно на 2, трябва да се считат за HER2 ген амплифицирани (5, 17-19). Резултатите при или близо до минималното допустимо ниво (1,8 2,2) трябва да се интерпретират внимателно. Ако съотношението е на границата (1,8 2,2), пребройте допълнителни 20 ядра и преизчислете съотношението за 40-те ядра. В случай на съмнение слайдът с пробата трябва да се оцени отново. При случаи, които са на границата, се гарантира консултация между патолога и лекуващия лекар. P04090BG_02/K стр. 20/70

21 Рак на гърдата Ограничения Гърда 1. FISH е многоетапен процес, който изисква специализирано обучение в избора на подходящите реагенти, както и в избора, фиксирането и обработката на тъканите, подготовката на FISH слайд и интерпретацията на резултатите от оцветяването. 2. FISH резултатите зависят от боравенето с тъканта и обработката й преди оцветяването. Неправилната фиксация, измиване, изсушаване, затопляне, оформяне на срези или замърсяване с други тъкани или флуиди могат да окажат влияние върху хибридизацията на сондата. Колебливите резултати може да се дължат на вариации в методите на фиксация и включване или на присъщи несъответствия в тъканта. 3. За оптимални и въпроизводими резултати, тъканните слайдове трябва да се депарафинизират изцяло. Отстраняването на парафина трябва да бъде завършено в началото на процеса на оцветяване. (Вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел B.2). 4. Трябва да се използват само водна баня, нагревателен блок и сушилня за хибридизация, които са с калибрирана температура. Употребата на други типове оборудване може да доведе до изпарение на комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH по време на хибридизация и трябва да се провери от потребителя. Работни характеристики Гърда Аналитична чувствителност Чувствителността на комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH е изследвана с помощта на 18 проби от нормален човешки епител от гърдата. Съотношението между броя на сигналите на HER2 и сигналите на CEN-17 беше изчислено на базата на преброяване на 20 ядра за всяка от пробите. Съотношението HER2/CEN-17 за 18-те проби от нормален човешки епител от гърдата беше в диапазона от 0,97 1,08. Аналитична специфичност ДНК сондите на HER2 в комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH са подредени в крайна последователност и картирани за потвърждаване на общо покритие от 218 kb, включително гена HER2. Сондите с ПНК на CEN-17 в комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH са изпитани индивидуално и в комбинация за потвърждаване на специфичната им хибридизация до центромерната област на хромозома 17. За измерване на способността на анализа да идентифицира единствено целевите субстанции HER2 и CEN-17 без интерференция от други субстанции бяха извършени проучвания върху тъканни проби от нормален човешки епител от гърдата с помощта на флакон 3, съдържащ буферния разтвор за хибридизация, но без комплекта сонди. Общо 18 проби бяха оценени за наличието на сигнали, които не са свързани с комплекта сонди. При никоя от 18-те проби не се наблюдава детекция на други хромозомни мишени или интерференция с тясно свързани субстанции. Изследвания на надеждността Надеждността на анализа HER2 IQFISH pharmdx беше изпитана чрез вариации във времето за предварителна обработка, температурата и методите за подгряване на буферния разтвор за предварителна обработка (в микровълнова печка или на водна баня), времето и метода за инкубация с пепсин (готов за употреба пепсин или потапяне), температурата и времето за денатуриране, времето за хибридизация и времето и температурата за цялостното промиване. P04090BG_02/K стр. 21/70

22 Рак на гърдата Не беше наблюдавана съществена разлика в резултатите при следните експериментални условия: Предварителна обработка по метод A) Водна баня за 10 минути, комбинирана с всяка от температурите 95 C, C и 99 C, заедно с 9, 10 и 11 минути при C. Предварителна обработка по метод B) Микровълнова печка за 9, 10 и 11 минути при >95 C. Разграждане с пепсин метод A) с времена за инкубация от 5, 10 и 15 минути при стайна температура (20 25 C). Разграждане с пепсин метод B) с времена за инкубация от 3, 4 и 5 минути при 37 C. Разграждане с пепсин метод C) с времена за инкубация от 20, 25 и 30 минути, комбинирани с всяка от температурите 35, 37 и 39 C. Денатуриране за 10 минути, съчетано с всяка от температурите 65, 66 и 67 C, заедно с 9, 10 и 11 минути при 66 C. Време за хибридизация от 60, 90 и 120 минути при 45 C Цялостно промиване в продължение на 10 минути, комбинирано с всяка от температурите 61, 63 и 65 C, заедно с 9, 10 и 11 минути при 63 C. Забележка: При тестовете на надеждността, за даден период от време е променян само един параметър в процедурата за оцветяване, а всички останали параметри са запазени постоянни величини. Препоръчва се придържане към времето и температурите, указани в процедурата на оцветяване. Хибридизацията за 60 минути показа висок интензитет на сигнала, макар и леко редуциран в сравнение с хибридизацията за 90 и 120 минути. Не беше наблюдавана съществена разлика в резултатите при други комбинации на време/температура. Процедурата за оцветяване за HER2 IQFISH pharmdx предлага променливи в протокола за топлинната предварителна обработка, разграждането с пепсин и времето за хибридизация. Всяка уникална комбинаторна възможност беше валидирана по отношение на статуса на ген HER2. Валидирането беше извършено върху 10 FFPE карциномни проби от човешка гърда за всяка от 12-те възможни комбинаторни опции. Комплектът HER2 FISH pharmdx (K5331) беше използван за референция. Съотношението HER2/CEN-17 за всяка отделна проба е показано на фигура 1. Кръстосаните табулации между 12-те теста и референтното оцветяване показаха цялостно съгласуване при статуса на ген HER2 от 100 % (10/10) при горна и долна граници за 95 % доверителност при критерий на основа на двойния избор на двустранни критерии от 78,3 % и 100 %, респективно. Стойността капа беше 1,00, а тестът на McNemars показа липса на предубеденост (р-стойност от 1,00 при критерий на основа на двойния избор на двустранни критерии). P04090BG_02/K стр. 22/70

23 Рак на гърдата Фигура 1. Индивидуални съотношения на HER2/CEN-17 за 10 карциномни проби от човешка гърда, оцветени с помощта на 12-те комбинаторни вариации на протокола, възможни при HER2 IQFISH pharmdx (код K5731) (Тест 1-12) и комплекта HER2 FISH pharmdx (код K5331) като референция (R). Хоризонталната линия илюстрира стойността на минималното допустимо ниво 2.0. Повторяемост Повторяемостта на съотношението HER2/CEN-17 беше изследвана с анализа HER2 IQFISH pharmdx с помощта на последователни срези от девет карциномни проби от човешка гърда с неамплифициран или амплифициран статус на ген HER2. В една и съща процедура бяха изпитани три екземпляра на срези от всяка проба. Средният коефициент на вариация беше 5,2 % при неамплифицираните проби (диапазон от 1 % до 8 %) и 14 % при амплифицираните проби (диапазон от 7 % до 20 %). Общо пет последователни срези от четири карциномни проби от човешка гърда с различна дебелина ( 3, 4, 5, 6 и 7 µm) бяха изпитани с HER2 IQFISH pharmdx. Средният коефициент на вариация на съотношението HER2/CEN-17 беше 7 % (диапазон от 6 % до 9 %). Възпроизводимост Анализът HER2 IQFISH pharmdx беше изпитан за възпроизводимост от партида до партида и от наблюдател до наблюдател с помощта на три партиди HER2 IQFISH pharmdx и трима наблюдатели. Възпроизводимостта беше изпитана върху девет различни карциномни проби от човешка гърда с неамплифициран или амплифициран статус на ген HER2. Средният коефициент на вариация за възпроизводимост от партида до партида беше 5 % при неамплифицираните проби (диапазон от 2 % до 8 %) и 7,8 % при амплифицираните проби (диапазон от 5 % до 11 %). Средният коефициент на вариация за възпроизводимост от наблюдател до наблюдател беше 3,2 % при неамплифицираните проби (диапазон от 0,2 % до 6 %) и 2,8 % при амплифицираните проби (диапазон от 2 % до 4 %). P04090BG_02/K стр. 23/70

24 Рак на гърдата Клинична полезност Клиничната полезност на комплекта HER2 FISH pharmdx на Dako (код K5331) беше изследвана в сравнително проучване с комплекта сонди с ДНК PathVysion HER-2 на Vysis. Проучването включваше 150 архивирани проби от пациенти, които са имали карцином на гърдата от клас II-III, с положителни или отрицателни лимфни възли. Първостепенната цел на проучването беше да изследва степента на съгласуване между съотношенията на HER2/центромер на хромозома 17 за 150-те проби при изследването им с китовете на Dako и Vysis, както по отношение на основното съгласуване на съотношенията, така и спрямо съгласуването на дихотомизираните FISH резултати (+/- групи). Общо 145 проби бяха успешно хибридизирани и оценени и затова бяха годни за включване в статистически анализ. В таблица 1 е представена 2 x 2 кръстосана табулация на резултатите. P04090BG_02/K стр. 24/70

25 Рак на гърдата Таблица 1. Дихотомизирани резултати от 145 проби от карцином на гърдата, изпитани с комплекта на Dako HER2 FISH pharmdx и комплекта сонди с ДНК Vysis PathVysion HER ядра във всяка проба бяха оценявани с всеки от двата комплекта. Комплект на Vysis (-) амплифициран Комплект на Vysis (+) амплифициран Комплект на Dako (-) амплифициран Комплект на Dako (+) амплифициран Сума Сума Съгласуването между тестовете с Dako и Vysis беше 95 % при интервал на доверителност %. Стойността капа беше 0,89. Резултатът от теста на McNemars за систематична грешка между двете изследвания не беше значителен (p=0,22). На фигура 2 е показана графика на разсейването на наблюденията по двойки при 145-те проби. 12,00 Графика Scatter на разсейването plot of paired на observations наблюденията по двойки DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit Комплект на Dako HER2 FISH pharmdx 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Комплект Vysis сонди PathVysion с ДНК PathVysion HER-2 DNA HER-2 Probe на Kit Vysis Фигура проби от карцином на гърдата, изпитани за амплификация на ген HER2 с помощта на комплекта на Dako HER2 FISH pharmdx и комплекта сонди с ДНК Vysis PathVysion HER-2. Резултатите са изразени като съотношения на HER2/центромер на хромозома ядра във всяка проба бяха оценявани с всеки от двата комплекта. P04090BG_02/K стр. 25/70

26 Рак на гърдата Основното съгласуване между тестовете на Dako HER2 FISH pharmdx и комплекта сонди с ДНК PathVysion HER-2 на Vysis беше изследвано чрез анализ на разликата между наблюденията по двойки на логаритъма (съотношението) и анализ на линейната регресия на логаритъма (съотношението) в двете изследвания. Стигна се до заключението, че разликата между наблюденията по двойки на логаритъма (съотношението) систематично нараства със сумата на съотношенията HER2/центромер на хромозома 17, и че при по-високите съотношения измереното съотношение е по-високо при теста на Dako, отколкото при теста на Vysis. По-високото съотношение HER2/центромер на хромозома 17, наблюдавано при комплекта на Dako HER2 FISH pharmdx, може да бъде отнесено към реалната разлика между двата теста, т.е. че по-високата резолюция на комплекта на Dako HER2 FISH pharmdx води до по-високи съотношения при случаите на силно амплифициране на ген HER2. Все пак, тестването на комплектите беше извършено в два различни центъра и се очаква вариация между лабораториите. Нещо повече, в литературата се съобщава за по-висока вариация при силно амплифицираните случаи, но се счита, че тя не е клинично значима (18). Текущото проучване не допуска изследване на систематичната разлика между двата теста в множество лаборатории. Трябва да се допълни, че размерът на наблюдаваната вариация между двата теста е сходен с вариацията между центровете, наблюдавана при проучването на преносимостта. HER2 IQFISH pharmdx на Dako (код K5731) беше сравнен с комплекта на Dako HER2 FISH pharmdx (код K5331) в сравнително проучване върху 78 проби от тъкан от гърда с карцином на човешка гърда. Кръстосаната табулация на статуса на HER2, получен чрез двата анализа, показа цялостно съгласуване от 98,7 % при горни и долни граници за интервал на доверителност 95 % със стойности 94,2 % и 99,9 %. Стойността капа беше 0,96 при горни и долни граници за интервал на доверителност 95 % със стойности 0,89 и 1,00. При теста на McNemars р- стойността беше 1,00, посочваща липса на предубеденост между двата анализа. P04090BG_02/K стр. 26/70

27 Рак на гърдата Откриване и отстраняване на проблеми Гърда Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 1. Няма сигнали или слаби сигнали 1a. Комплектът е бил изложен на високи температури по време на транспортиране или съхранение 1б. Микроскопът не функционира правилно - Неподходящ комплект филтри - Неподходяща лампа - Живачната лампа е твърде остаряла - Замърсени и/или напукани колекторни лещи - Неподходящо масло за потапяне 1a. Проверете условията на съхранение. Уверете се, че е наличен сух лед при получаването на пратката. Уверете се, че флакон 3 е бил съхраняван при -18 C на тъмно. Уверете се, че флакони 2A и 5 са били съхранявани при максимум 2 8 C на тъмно. 1б. Проверете микроскопа и се уверете, че използваните филтри са подходящи за употреба с флуорохромите на комплекта и че живачната лампа е с точни характеристики и не е използвана извън очаквания срок на експлоатационната й годност. (вж. приложение 3). В случай на съмнение моля да се свържете с Вашия местен доставчик на микроскопа. 1в. Затихнали сигнали 1в. Избягвайте продължителна работа с микроскопа и сведете до минимум експозицията на силни източници на светлина. 1г. Неправилни условия на предварителна обработка 1д. Изпарение на комплект сонди по време на хибридизация 1г. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на предварителна обработка 1д. Осигурете достатъчна влажност в камерата за хибридизация 2. Няма зелени сигнали 2a. Неправилни условия на цялостно промиване 2a. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на цялостно промиване, както и че покривните стъкла са отстранени преди цялостното промиване P04090BG_02/K стр. 27/70

28 Рак на гърдата Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 3. Няма червени сигнали 4. Области без сигнал 5. Прекомерно оцветяване на фона 6. Зле изразена морфология на тъканта 3a. Неправилни условия на предварителна обработка 4a. Количеството на сондата е прекалено малко 4б. Уловени са въздушни мехурчета по време на прилагането на комплекта сонди или заливката 5a. Неправилна фиксация на тъканта 5б. Парафинът не е отстранен напълно 5в. Температурата на цялостно промиване е прекалено ниска 5г. Продължителна експозиция на хибридизирания срез на силна светлина 6a. Неправилна обработка с пепсин 6б. Неправилните условия на предварителна обработка могат да доведат до неясен или мътен вид 6в. Прекалено продължителната обработка с пепсин или твърде малката дебелина на срезите могат да доведат до появата на призрачни или пръстеновидни клетки. 3a. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на предварителна обработка 4a. Уверете се, че количеството на сондата е достатъчно голямо, за да покрие областта под покривното стъкло 4б. Не допускайте въздушни мехурчета. Ако забележите такива, внимателно ги отстранете с помощта на форцепс 5a. Уверете се, че се използват само фиксирани във формалин, включени в парафин тъканни срези 5б. Следвайте процедурите на депарафинизация и повторна хидратация, описани в раздел B.2 5в. Уверете се, че температурата на цялостното промиване е 63 (±2) C 5г. Избягвайте продължителна работа с микроскопа и сведете до минимум експозицията на силна светлина 6a. Спазвайте препоръчваните периоди на инкубация на пепсин. Вж. раздел B.3, стъпка 2. Уверете се, че с пепсин се борави при правилната температура. Вж. раздел B.1 6б. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на предварителна обработка 6в. Скъсете периода на инкубация на пепсин. вж. раздел B.3, стъпка 2. Уверете се, че дебелината на срезите е 4 6 µm. P04090BG_02/K стр. 28/70

29 Рак на гърдата Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 7. Високо ниво на зелена автофлуоресценц ия върху слайда, включително зоните без FFPE тъкан 7. Използване на стъклени слайдове с изтекъл срок или такива, които не се препоръчват 7. Уверете се, че стъкленият слайд с покритие (Dako Silanized Slides, код S3003 или слайдовете с покритие от поли-l-лизин) не е с изтекъл срок на годност. ЗАБЕЛЕЖКА: Ако проблемът не може да бъде отнесен към някоя от горепосочените причини или ако предложението за корективни действия не реши проблема, моля, свържете се с отдел Техническо обслужване на Dako за допълнително съдействие. P04090BG_02/K стр. 29/70

30 Приложение 1 Гърда HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Контролен списък на протокол Дата на процедурата: Партида на HER2 IQFISH pharmdx, K5731: Идентификационен номер на пробата: Идентификационен номер на оборудването: Рак на гърдата Идентификационен номер на дневника на процедурата за оцветяване: Дата на разреждане/изтичане срока на годност на 1 x промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20): / Тъкан, фиксирана в неутрален буфериран формалин Да Не Стъпка 1: Предварителна обработка Дата на разреждане/изтичане срока на годност на разтвора за предварителна обработка (флакон 1, разреден в съотношение 1:20) Измерена температура на разтвора за предварителна обработка (95 99 C), ако за нагряване се използва водна баня Предварителна обработка (10 минути) и охлаждане (15 минути) Промийте в промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20) (2 x 3 минути) Стъпка 2: Пепсин Продължителност на обработката с пепсин (флакон 2) при 37 C или Продължителност на обработката с пепсин (флакон 2) при стайна температура (20 25 C) или Продължителност на потапянето в пепсин при 37 (±2) C Промийте в промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20) (2 x 3 минути) Дехидратирайте слайдовете (3 x 2 минути) в степенувани серии етанол и изсушете на въздух Стъпка 3: Комплект сонди HER2/CEN-17 IQISH / C Минути Минути Минути Приложете комплект сонди (флакон 3), покрийте с покривно стъкло и уплътнете с уплътнителя на покривното стъкло Измерена температура за денатуриране (66 (±1) C) C Денатуриране в продължение на 10 минути Измерена температура за хибридизация (45 (±2) C) C Време за хибридизация ( минути) Минути P04090BG_02/K стр. 30/70

31 Рак на гърдата Стъпка 4: Цялостно промиване Дата на разреждане/изтичане срока на годност на промивния буферен разтвор за цялостно промиване (флакон 4, разреден в съотношение 1:20) Измерена температура на промивен буферен разтвор за цялостно промиване (63 (±2) C) Цялостно промийте (10 минути) след отстраняване на покривните стъкла Промийте в промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20) (2 x 3 минути) Дехидратирайте слайдовете (3 x 2 минути) в степенувани серии етанол и изсушете на въздух Стъпка 5: Заливка Нанесете 15 μl флуоресцентна среда за заливка (флакон 5) и покрийте с покривно стъкло Коментари: / C C Минути Дата и подпис, техник: P04090BG_02/K стр. 31/70

32 Рак на гърдата Приложение 2 Гърда HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Схема на оценяване Идентификационен номер на дневника на процедурата за оцветяване: Дата на процедурата: Партида на HER2 IQFISH pharmdx, K5731: Идентификационен номер на пробата: Ядро HER2 оценка (червен) Пребройте сигнали в 20 ядра CEN-17 оценка (зелен) Ядро Общо (1-10) Общо (11-20) HER2 оценка (червен) CEN-17 оценка (зелен) За определяне съотношението HER2/CEN-17 пребройте количеството HER2 сигнали и количеството CEN-17 сигнали в същите 20 ядра и разделете общия брой HER2 сигнали на общия брой CEN-17 сигнали. Ако съотношението HER2/CEN-17 е на границата (1,8 2.2), пребройте допълнителни 20 ядра и преизчислете съотношението. Съотношението при или близо до минималното допустимо ниво (1,8 2,2) трябва да се интерпретира внимателно (вж. указанията за преброяване). Обща оценка (1 20) HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 Съотношение < 2: Амплификация на ген HER2 не е наблюдавана Съотношение 2: Амплификация на ген HER2 е наблюдавана Дата и подпис, техник: Дата и подпис, патолог: За указания за оценяване: вж. Интерпретация на оцветяването. P04090BG_02/K стр. 32/70

33 Рак на гърдата Приложение 3 Гърда HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Спецификации на микроскоп с флуоресценция Dako препоръчва следното оборудване за ползване с HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Тип микроскоп Микроскоп с епифлуоресценция. 2. Лампа 100 Вата живачна лампа (записвайте времето на горене). 3. Обективи За скрининг на тъканта се използват обективи със суха флуоресценция 10Х или обективи с флуоресценция с потапяне в масло 16Х. За увеличение с висока мощност и оценяване на сигналите се препоръчват само обективи с флуоресценция с потапяне в масло, напр. 100Х. 4. Филтри Филтрите са индивидуално проектирани за конкретните флуорохроми и трябва да бъдат избирани съобразно това. Dako препоръчва използването на специфичен DAPI филтър в комбинация с висококачествен Texas Red/FITC двоен филтър. DAPI филтър Texas Red/FITC двоен филтър За потвърждение могат да се използват Texas Red и FITC единични филтри. Флуорохром Дължина на вълната на възбуждане Дължина на вълната на емисия FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Филтрите са специфични за всеки тип микроскоп и използването на подходящите филтри е критично важно за интерпретирането. Ако желаете подробна информация, моля, свържете се с доставчика на Вашия микроскоп или с Вашия представител на Dako. 5. Масло Масло, което не флуоресцира. Предпазни мерки Не се препоръчва 50-ватова живачна лампа. Родаминовите филтри не могат да бъдат използвани. Не се препоръчват тройни филтри. Микроскоп, който не е оптимизиран, може да създаде проблеми при разчитането на флуоресцентните сигнали. Важно е източникът на светлина да е в срок на годност и да е правилно центриран и фокусиран. Клиентите трябва да наблюдават и да следват препоръките на производителя за живачната лампа. Микроскопът трябва да бъде поддържан, а живачната лампа да бъде центрирана преди интерпретирането на резултатите. Трябва да се внимава пробата да бъде изложена на възможно най-малко светлина на възбуждане, за да се сведе до минимум избледняването на флуоресценцията. Препоръчваме Ви да обсъдите настройките на Вашия конкретен микроскоп с производителя, преди да започнете флуоресцентна хибридизация in situ, или да се консултирате с литературата. P04090BG_02/K стр. 33/70

34 Рак на стомаха Кратко описание и обяснение Стомах Човешкият HER2 ген (известен също като ERBB2 или NEU) е разположен върху хромозома 17 и кодира протеина HER2 или p185 HER2. Протеинът HER2 е мембранен тирозин-киназен рецептор с хомология с рецептора на епидермалния фактор на растежа (EGFR или HER1) (1-2). Генът HER2 присъства в 2 копия във всички нормални диплоидни клетки. Свръхескспресията на протеин HER2 и амплификацията на ген HER2 при рак на стомаха се установяват при много изследвания (разгледани в (20)). Положителността за HER2 може да се открие при приблизително 20 % от пациентите чрез IHC или FISH (20). Предварителните клинични ин витро и ин виво изследвания показват, че трастузумаб (Herceptin ) е ефективен при различни видове рак на стомаха, което води до иницииране на няколко клинични изследвания (20-24). В изследването BO18255 от фаза III, ToGA, HER2-позитивните пациенти с неподлежащ на операция, локално напреднал, рекурентен и/или метастатичен аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение бяха рандомизирани за получаване на 5-FU или капецитабин и цисплатин - поотделно или в комбинация с трастузумаб. При пациентите, които бяха подложени на комбинирано лечение с трастузумаб и химиотерапия (25), беше наблюдавано статистически значително увеличаване на общата преживяемост (OS). Трастузумаб е хуманизирано моноклонално антитяло, което се свързва с висок афинитет с протеин HER2 и е установено, че инхибира пролиферацията на човешки туморни клетки, които свръхекспресират HER2 протеина ин витро и ин виво (21-24). Принцип на процедурата Стомах HER2 IQFISH pharmdx съдържа всички ключови реагенти, необходими за завършването на една FISH процедура за фиксирани във формалин, включени в парафин проби от тъканни срези. След депарафинизиране и рехидратиране пробите се загряват в разтвор за предварителна обработка, последвана от протеолитно разграждане с пепсин. След стъпките за загряване и протеолитна предварителна обработка в този комплект се използва нетоксичен, готов за употреба комплект от сонди IQISH, базиран на комбинация от технология с ПНК (пептидно-нуклеинова киселина) (12) и ДНК. Комплектът сонди се състои от смес от ДНК сонди, маркирани с Texas Red, покриващи област от 218 kb, включваща ген HER2 върху хромозома 17, и смес от ПНК проби, маркирани с флуоресцеин, насочени към центромерната област на хромозома 17 (CEN-17). Специфичната хибридизация към двете цели води до формиране на отчетлив червен флуоресцентен сигнал при всеки локус на ген HER2 и отчетлив зелен флуоресцентен сигнал при всеки центромер на хромозома 17. След цялостно промиване пробите се заливат с флуоресцентна среда за заливка, съдържаща DAPI (4',6-диамидин-2- фенилиндол), и се поставят на покривно стъкло. С помощта на флуоресцентен микроскоп, снабден с подходящите филтри (вж. приложение 3) се локализират туморните клетки и се извършва преброяване на червените (HER2) и зелените (CEN-17) сигнали. След това се изчислява съотношението HER2/CEN-17. Нормалните клетки в анализирания тъканен срез ще изпълняват ролята на вътрешна положителна контрола на ефективността на предварителната обработка и хибридизацията. За подробности вж. раздела Интерпретация на оцветяването. За интерактивно електронно обучение, моля, използвайте програмата за електронно обучение HER2 IQFISH pharmdx, предназначена да предостави на лаборантите, патолозите и учените точни и бързи познания как да постигнат оптимални резултати с помощта на HER2 IQFISH pharmdx: P04090BG_02/K стр. 34/70

35 Рак на стомаха Реагенти Стомах Осигурени материали Изброените по-долу материали са достатъчни за 20 теста (за тест е определен един целеви участък от 22 мм x 22 мм). Броят на тестовете се базира на използването на 250 µl на предметно стъкло от флакон A2 (5 8 капки), 10 µl на предметно стъкло от флакон 3 и 15 µl на предметно стъкло от флакон 5. Разтворите във флакон 3 и флакон 5 са вискозни и може да се наложи за кратко да се центрофугират в микроцентрофуга, за да се събере целият предоставен реагент. Комплектът предоставя материали, достатъчни за 10 отделни процедури за оцветяване (четири отделни процедури, когато се използва методът с потапяне в пепсин). HER2 IQFISH pharmdx се доставя върху сух лед. За да се гарантира, че компонентите на комплекта не са излагани на високи температури при транспортиране, при получаване на пратката сухият лед трябва да се съдържа в нея. Отбележете, че някои от компонентите на комплекта могат да останат неразмразени това няма да повлияе на функционирането на HER2 IQFISH pharmdx. Флакон 1 Флакон 2А Флакон 2В Флакон 3 Флакон 4 Флакон 5 Разтвор за предварителна обработка (20x) 150 ml, концентриран 20x Буферен разтвор на MES (2-[N-морфолино]етансулфонова киселина). Пепсин 4 x 6,0 ml, готов за употреба Разтвор на пепсин, ph 2,0; съдържа стабилизатор и антимикробен агент. Разтворител за пепсин (10х) 24 ml, концентриран 10x Буферен разтвор за разтваряне, рн 2,0, съдържа антимикробен агент. Комплект сонди HER2/CEN-17 IQISH 0,2 ml, готов за употреба Смес от ДНК сонди на HER2, маркирани с Texas Red, и ПНК сонди на CEN-17, маркирани с флуоресцеин; доставени в буферен разтвор за IQISH хибридизация. Промивен буферен разтвор за цялостно промиване (20x) 150 ml, концентриран 20x SSC (физиологичен разтвор на натриев цитрат) буферен разтвор с почистващ препарат (Tween-20). Флуоресцентна среда за заливка 0,4 ml, готов за употреба Флуоресцентна среда за заливка с 500 µg/l DAPI (4,6-диамидин-2-фенилиндол). P04090BG_02/K стр. 35/70

36 Рак на стомаха Флакон 6 Промивен буферен разтвор (20x) 500 ml, концентриран 20x Трис/HCl буферен разтвор. Уплътнител на покривно стъкло 1 епруветка, готова за употреба Разтвор за отстраняемо уплътнение на покривни стъкла. ЗАБЕЛЕЖКА: Следните реагенти в комплекта: Разтвор за предварителна обработка (20x), Пепсин, Разтворител за пепсин (10x), Промивен буферен разтвор за цялостно промиване (20x), Флуоресцентна среда за заливка, Промивен буферен разтвор (20x) и Уплътнител на покривното стъкло са взаимно заменяеми със съответните реагенти в Dako Histology FISH Accessory Kit, код K5799. Материали, които са необходими, но не са осигурени Лабораторни реагенти Дестилирана или дейонизирана вода Етанол, 96% Ксилен или заместители на ксилен Лабораторно оборудване Абсорбиращи салфетки Регулируеми пипети Калибриран термометър с частично потапяне (диапазон C) Калибриран повърхностен термометър (диапазон C) Покривни стъкла (22 мм х 22 мм) Форцепс Пароуловител Dako Hybridizer (код S2450 или S2451)* Нагревателен блок или хибридизация* Камера за влажна хибридизация* Микроцентрофуга Слайдове, Dako Silanized Slides, код S3003 или слайдове с покритие от поли-l-лизин (вж. Приготвяне на пробите ) Стъклени съдове или вани за оцветяване Таймер (с възможност за работа с интервали от 2 15 минути) Вихров миксер Водна вана с капак (с възможности за поддържане на 37(±2) C, 63 (±2) C и от 95 C до 99 C) Микровълнова печка с функция чувствителност, ако предварителната обработка се извършва с помощта на микровълнова печка (вж. B3. Протокол за оцветяване. стъпка 1: Предварителна обработка, метод B) * Нагревателен блок или хибридизационна сушилня за денатурация (66 (±1) C) и хибридизация (45 (±2) C) заедно с камера за влажна хибридизация могат да се използват като алтернатива на Dako Hybridizer. P04090BG_02/K стр. 36/70

37 Рак на стомаха Микроскопско оборудване и аксесоари Филтри за микроскоп с флуоресценция: DAPI и FITC/Texas Red двоен филтър или FITC и Texas Red монофилтри - вж. приложение 3 за подробности Трябва да се използва микроскоп с флуоресценция със 100-ватова живачна лампа като източник на светлина. С тези филтри не се препоръчват други източници на светлина Комплект микроскопски слайдове (картонена табла за 20 слайда с капак с панти или подобна) Предпазни мерки Стомах 1. За употреба при ин витро диагностика. 2. За професионална употреба. 3. Флакон 1, Pre-Treatment Solution (20x), не изисква етикетиране на опасност. Информационни листове за безопасност на материала (SDS) се предоставят на професионалните потребители при поискване. 4. Флакон 2a, Pepsin, съдържа 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, и <0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one и 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Флакон 2a е обозначен като: Опасно H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Причинява тежки изгаряния на кожата и сериозно увреждане на очите. Може да причини алергична кожна реакция. Използвайте предпазни ръкавици/предпазни очила/предпазна маска за лице/предпазно облекло. ПРИ ВДИШВАНЕ: Изведете лицето на чист въздух и го поставете в позиция, улесняваща дишането. Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. ПРИ ПОГЛЪЩАНЕ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. НЕ предизвиквайте повръщане. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ. Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар/. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. Да се съхранява под ключ. Съдържанието и съдът да се изхвърли съобразно всички местни, регионални, национални и международни разпоредби. 5. Флакон 2B, Pepsin Diluent (10x), съдържа 50-<75% propan-2-ol и 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Флакон 2B е обозначен като: Опасно H225 H319 Силно запалими течност и пари. Предизвиква сериозно дразнене на очите. P04090BG_02/K стр. 37/70

38 Рак на стомаха H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Може да предизвика сънливост или световъртеж. Използвайте предпазни ръкавици/предпазни очила/предпазна маска за лице/предпазно облекло. Да се пази от топлина, нагорещени повърхности, искри, открит пламък, и други източници на запалване. Тютюнопушенето забранено. Използвайте електрическо, проветряващо, осветително и работно оборудване, обезопасено срещу експлозия. ПРИ ВДИШВАНЕ: Изведете лицето на чист въздух и го поставете в позиция, улесняваща дишането. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ. Да се държи на хладно. Съдържанието и съдът да се изхвърли съобразно всички местни, регионални, национални и международни разпоредби. 6. Флакон 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, съдържа 10-<25% ethylene carbonate и 3- <5% sodium chloride. Флакон 2B е обозначен като: Внимание H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Предизвиква сериозно дразнене на очите. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. 7. Флакон 4, Stringent Wash Buffer (20x), съдържа 10-<25% sodium chloride, и 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Флакон 4 е обозначен като: H319 H315 P280 Внимание P264 P305 + P351 + P338 Предизвиква сериозно дразнене на очите. Предизвиква дразнене на кожата. Използвайте предпазни ръкавици. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. 8. Флакон 6, Wash Buffer (20), съдържа 10-<25% sodium chloride и 10-<20% trometamol. Флакон 6 е обозначен като: H319 H315 P280 Внимание Предизвиква сериозно дразнене на очите. Предизвиква дразнене на кожата. Използвайте предпазни ръкавици. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. P04090BG_02/K стр. 38/70

39 Рак на стомаха P264 P305 + P351 + P338 Да се измие ръце старателно след употреба. ПРИ КОНТАКТ С ОЧИТЕ: Промивайте внимателно с вода в продължение на няколко минути. Свалете контактните лещи, ако има такива и доколкото това е възможно. Продължете с изплакването. 9. Coverslip Sealant съдържа 100 % хидроочистена лека нафта (петрол) и е обозначен като: Опасно H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Силно запалими течност и пари. Може да бъде смъртоносен при поглъщане и навлизане в дихателните пътища. Токсичен за водните организми, с дълготраен ефект. Използвайте предпазни ръкавици. Използвайте предпазни средства за очите и лицето. Да се пази от топлина, нагорещени повърхности, искри, открит пламък, и други източници на запалване. Тютюнопушенето забранено. Използвайте електрическо, проветряващо, осветително и работно оборудване, обезопасено срещу експлозия. Да се избягва изпускане в околната среда. ПРИ ПОГЛЪЩАНЕ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. НЕ предизвиквайте повръщане. ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Незабавно свалете цялото замърсено облекло. Облейте кожата с вода/вземете душ. Да се държи на хладно. Съдържанието и съдът да се изхвърли съобразно всички местни, регионални, национални и международни разпоредби. 10. Пробите, преди и след фиксиране, и всички материали, влизащи в контакт с тях, трябва да се третират като евентуални преносители на инфекция и трябва да се изхвърлят с прилагане на подходящи предпазни мерки (16). Никога не преливайте реагентите с уста и не позволявайте на реагентите и пробите да влизат в контакт с кожата и лигавиците. Ако реагентите влязат в контакт с чувствителни области, промийте с обилно количество вода. 11. Сведете до минимум микробното замърсяване на реагентите, за да избегнете неточни резултати. 12. Времена и температури на инкубация или методи, различни от определените, могат да доведат до неточни резултати. 13. Методите за фиксиране на тъкани и дебелината на пробата, различни от определените, могат да окажат влияние на морфологията на тъканите и/или интензивността на сигнала. 14. Избягвайте изпарение на комплекта сонди HER2/CEN-17 по време на хибридизация, като осигурите достатъчна влажност в камерата за хибридизация. 15. Реагентите са разредени в оптимално съотношение. Допълнителното разреждане може да доведе до влошаване на работните характеристики. 16. Носете подходяща лична защитна екипировка, за да избегнете контакт с очите и кожата. За допълнителна информация, моля, направете справка с информационния лист за безопасност на материала (SDS). P04090BG_02/K стр. 39/70

40 Рак на стомаха 17. Хетерогенният характер на пробите от рак на стомаха изисква извършването на щателно сканиране на цялата проба за оценяване на разпространението на сигналите, преди да се избере областта за изброяване на сигналите. 18. Не се препоръчва оценяването на много малки проби (т.е. пробите трябва да бъдат с интактна морфология и достатъчно ядра за преброяване). 19. Ако анализът HER2 FISH се извършва върху проба от биопсия, трябва да се анализират множество (7-8) подлежащи на оценяване биопсии от различни области на тумора, за да се обезпечи надеждното определяне на статуса на HER За идентифицирането на всички тъканни сърцевини в пробата от биопсия е важно да се провери слайда, оцветен с H&E. 21. За метода с потапяне в пепсин (стъпка 2, метод С) трябва да се използват само чисти съдове за оцветяване. Съхранение Стомах Съхранявайте комплекта от сонди HER2/CEN-17 IQISH (флакон 3) при -18 C на тъмно. Всички други реагенти могат да бъдат съхранявани при 2 8 C на тъмно. Всички реагенти допускат съхранение в замразен вид. Замразяването и размразяването на реагентите до максимум 10 пъти не повлиява работните им характеристики. Пепсин, комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH и флуоресцентната среда за заливка (флакони 2A, 3 и 5) могат да бъдат неблагоприятно засегнати, ако са изложени на топлина. Не оставяйте тези компоненти на стайна температура. Комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH и флуоресцентната среда за заливка (флакони 3 и 5) могат да бъдат неблагоприятно засегнати, ако са изложени на прекомерни нива на светлина. Не съхранявайте тези компоненти и не извършвайте анализ при силна светлина, като например пряка слънчева светлина. Не използвайте комплекта след изтичане на срока на годност, указан върху кутията на комплекта. Ако реагентите се съхраняват при условия, различни от посочените в информационната листовка в опаковката, потребителят трябва да провери работните характеристики на реагента (13). Не съществуват видими признаци, които да показват нестабилност на този продукт. Следователно е важно да се оценят нормалните клетки в анализирания тъканен срез. Свържете се с отдел Техническа поддръжка на Dako, ако се наблюдава необичаен тип флуоресценция, която не може да се обясни с вариации в лабораторните процедури, и има съмнение за проблем с HER2 IQFISH pharmdx. P04090BG_02/K стр. 40/70

41 Рак на стомаха Приготвяне на пробите Стомах Пробите от аденокарцином на стомаха, включително хранопроводно-стомашното съединение, получени от биопсия, ексцизия или резекция, трябва да се обработят правилно, за да се запази тъканта за FISH анализ. Стандартните методи на обработка на тъканите за имуноцитохимично оцветяване трябва да се използват за всички проби (14). При тестването на малки проби от биопсия осигурете интактна туморна морфология и наличие на достатъчно ядра за изброяване на сигналите. Ако анализът HER2 FISH се извършва върху проба от биопсия, трябва да се анализират множество (7-8) подлежащи на оценяване биопсии от различни области на тумора, за да се обезпечи надеждното определяне на статуса на HER2. Срези, включени в парафин Само тъкани, съхранени в неутрален буфериран формалин и включени в парафин, са подходящи за употреба. Например, пробите трябва да се блокират в дебелина от 3 или 4 мм и трябва да се фиксират за часа в неутрален буфериран формалин. При изпитването ToGA пробите от биопсия бяха фиксирани за 6 8 часа (обърнете се към (25) за справка относно проучването). След това тъканите се дехидрират чрез степенувани серии етанол и ксилен, последвано от инфилтриране с разтопен парафин, осъществено при температура не по-голяма от 60 C. Правилно фиксираните и включени тъкани ще се запазят за неопределено време преди оформяне на срезите и поставяне на слайд, ако се съхраняват на хладно място (15 25 C) (14, 15). Други фиксатори не са подходящи. Тъканните проби трябва да се разделят на срези от 3 6 µm. Слайдовете, необходими за анализ на амплификацията на ген HER2 и за проверка за наличието на тумор, трябва да се приготвят по едно и също време. Препоръчват се минимум 2 поредни среза, 1 срез за наличие на тумор, оцветен с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване), и 1 срез за анализ на амплификацията на ген HER2. Препоръчва се тъканните срези да се заливат на Dako Silanized Slides, код S3003, или на слайдове с покритие от поли-l-лизин. Пробите трябва да се анализират в рамките на 4 6 месеца от оформянето на срезите, когато се съхраняват при стайна температура (20 25 C). P04090BG_02/K стр. 41/70

42 Рак на стомаха ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА Стомах A. Приготвяне на реагента Стомах Преди оцветяване е удобно да се приготвят следните реагенти: А.1 Разтвор за предварителна обработка Във флакон 1 могат да се появят кристали, но те ще се разтворят при стайна температура. Преди приготвянето на реагента се уверете, че няма налични кристали. Разредете достатъчно количество от флакон 1 (Разтвор за предварителна обработка 20x) чрез разреждане на концентрата 1:20 в дестилирана или дейонизирана вода. Неизползваният разреден разтвор може да се съхранява при температура 2 8 C в продължение на един месец. Изхвърлете разредения разтвор, ако изглежда мътен. А.2. Промивен буферен разтвор за цялостно промиване Разредете достатъчно количество от флакон 4 (Промивен буферен разтвор за цялостно промиване 20x) чрез разреждане на концентрата 1:20 в дестилирана или дейонизирана вода. Неизползваният разреден буферен разтвор може да се съхранява при температура 2 8 C в продължение на един месец. Изхвърлете разредения буферен разтвор, ако изглежда мътен. А.3. Промивен буферен разтвор Разредете достатъчно количество от флакон 6 (Промивен буферен разтвор 20x), чрез разреждане на концентрата 1:20 в дестилирана или дейонизирана вода. Неизползваният разреден буферен разтвор може да се съхранява при температура 2 8 C в продължение на един месец. Изхвърлете разредения буферен разтвор, ако изглежда мътен. А.4. Серии етанол От 96 % разтвор на етанол пригответе 3 стъклени съда със съответно 70 %, 85 % и 96 % етанол. Съхранявайте покритите стъклени съдове при стайна температура или при температура от 2 8 C и ги използвайте за максимум 200 слайда. Изхвърлете разтворите, ако изглеждат мътни. А.5. Пепсинов разтвор Пепсинов разтвор е необходим само когато се използва методът за потапяне в пепсин (метод C). Пригответе пепсинов разтвор, както следва: За контейнер с капацитет шест слайда пригответе 60 ml пепсинов разтвор: Добавете в контейнера 48 ml дестилирана или дейонизирана вода със стайна температура (20 25 C). Прибавете 6 ml студен (2 8 C) Разтворител за пепсин (10x) (флакон 2B) в контейнера. Прибавете 6 ml студен (2 8 C) Пепсин (флакон 2A) в контейнера. Поставете капака на контейнера и изравнете пепсиновия разтвор до 37 (±2) C във водна баня. За контейнер с капацитет 24 слайда и 240 ml пепсинов разтвор: Добавете в контейнера 192 ml дестилирана или дейонизирана вода със стайна температура (20 25 C). Прибавете 24 ml студен (2 8 C) Разтворител за пепсин (10x) (флакон 2B) в контейнера. Прибавете 24 ml студен (2 8 C) Пепсин (флакон 2A) в контейнера. Поставете капака на контейнера и изравнете пепсиновия разтвор до 37 (±2) C във водна баня. Изравненият пепсинов разтвор трябва да се използва в рамките на 5 часа. P04090BG_02/K стр. 42/70

43 Рак на стомаха В. Процедура на оцветяване Стомах В.1 Процедурни забележки Потребителят трябва да прочете внимателно тези инструкции и да се запознае с всички компоненти преди употреба (вж. Предпазни мерки ). Преди употреба всички реагенти трябва да достигнат съответната температура, както следва: Флакон 1: Разреденият разтвор за предварителна обработка трябва да достигне температура от C, ако за предварителна обработка се използва водна баня (B3. Протокол за оцветяване, стъпка 1: Предварителна обработка, метод А). Ако за предварителна обработка се използва микровълнова печка с функция чувствителност (B3. Протокол за оцветяване, стъпка 1: Предварителна обработка, метод B), разреденият разтвор за предварителна обработка трябва да достигне стайна температура от C. Флакон 2А: Пепсинът трябва да се нанася при 2 8 C (B3, Протокол за оцветяване, стъпка 2, метод A и B) и да се държи непрекъснато студен. Флакон 2В: Разтворителят за пепсин (10x) трябва да се нанася при 2 8 C (B3, Протокол за оцветяване, стъпка 2, метод C). Флакон 3: Комплектът сонди HER2/CEN-17 IQISH се разделя на две фази по време на съхранението му при -18 C. Преди да използвате флакон 3, се уверете, че има само една фаза, като изравните комплекта сонди до стайна температура (20 25 C), а след това миксирате; Размразявайте флакон 3 при стайна температура (20 25 C) в продължение на максимум 30 минути (пазете от силна светлина), след това щателно центрофугирайте флакона за 15 секунди на 2500 об/мин с помощта на вихров миксер. Съхранявайте флакон 3 при -18 C веднага след употреба. Флакон 4: Разреден промивен буферен разтвор за цялостно промиване преди употреба единият стъклен съд трябва да бъде изравнен до стайна температура, другият стъклен съд трябва да бъде изравнен до 63 (±2) C. Флакон 5: Флуоресцентната среда за заливка може да се използва при всякаква температура от 2 25 C. Флакон 6: Разреденият промивен буферен разтвор трябва да бъде изравнен до стайна температура C. Уплътнителят за покривно стъкло може да се използва при всякаква температура от 2 25 C. Всички стъпки трябва да се извършват при посочените температури. Процедурата включва няколко дехидратации, последвани от изсушаване на тъканните срези. Уверете се, че тъканните срези са напълно изсъхнали, преди да преминете към следващата стъпка. Не позволявайте на тъканните срези да изсъхнат по време на другите процедурни стъпки. Ако процедурата на оцветяване трябва да се прекъсне, слайдовете може да се съхраняват в промивен буферен разтвор след стъпката на депарафинизация за период до 1 час при стайна температура (20 25 C), без това да окаже влияние на резултатите. В.2 Обработка на тъканите преди оцветяване Депарафинизация и повторна хидратация: Преди извършване на анализ тъканните слайдове трябва да се депарафинизират за отстраняване на средата за включване и да се хидратират повторно. Отстранете парафина изцяло. Неотстранената среда за включване ще доведе до увеличено неспецифично оцветяване. Тази стъпка трябва да се извърши при стайна температура (20 25 C). P04090BG_02/K стр. 43/70

44 Рак на стомаха 1. Поставете слайдовете в баня с ксилен и инкубирайте в продължение на 5 (±1) минути. Сменете баните и повторете още веднъж. 2. Отстранете излишната течност и поставете слайдовете в 96 % етанол за 2 (±1) минути. Сменете баните и повторете още веднъж. 3. Отстранете излишната течност и поставете слайдовете в 70 % етанол за 2 (±1) минути. Сменете баните и повторете още веднъж. 4. Отстранете излишната течност и поставете слайдовете в разреден промивен буферен разтвор (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.3) за минимум 2 минути. Започнете процедурата за оцветяване, както е посочено в раздел B.3, стъпка 1, Предварителна обработка. Разтвори на ксилен и алкохол трябва да се сменят след 200 слайда или по-малко. Може да се използват заместители на ксилен. ЗАБЕЛЕЖКА: Реагентите и инструкциите, предоставени с този комплект, са предназначени за достигане на оптимални резултати. Допълнителното разреждане на реагентите или промяната на температурата на инкубация могат да доведат до неточни или противоречиви резултати. Разликите в обработката на тъканите и техническите процедури в лабораторията на потребителя могат да направят резултатите от анализа невалидни. B.3 Протокол за оцветяване Стъпка 1: Предварителна обработка Предварителната обработка може да се извърши с помощта на водна баня, както е описано в метод A) или, като алтернатива чрез използване на микровълнова печка с функция чувствителност, както е описано в метод В). Метод A: Предварителна обработка с помощта на водна баня Напълнете два стъклени съда за оцветяване, например съдове на Coplin, с разреден разтвор за предварителна обработка (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.1). Поставете стъклените съдове за оцветяване, съдържащи разреден разтвор за предварителна обработка, във водна баня. Нагрейте водната баня и разтвора за предварителна обработка до C. Измерете температурата в стъкления съд с калибриран термометър за гарантиране на правилна температура. Покрийте стъклените съдове с капаци, за да стабилизирате температурата и избегнете изпарение. Потопете депарафинизираните срези със стайна температура в предварително нагретия разтвор за предварителна обработка в стъклените съдове за оцветяване. Проверете отново температурата и инкубирайте в продължение на 10 (±1) минути при C. Отстранете целия стъклен съд със слайдове от водната баня. Отстранете капака и оставете слайдовете да се охладят в разтвора за предварителна обработка в продължение на 15 минути при стайна температура. Преместете слайдовете в стъклен съд с разреден промивен буферен разтвор (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.3) за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите в продължение на още 3 минути. ЗАБЕЛЕЖКА: Разтворът за предварителна обработка е предназначен само за еднократна употреба. Не използвайте повторно. Метод В: Предварителна обработка с използване на микровълнова печка с функция чувствителност P04090BG_02/K стр. 44/70

45 Рак на стомаха Напълнете пластмасов съд с разреден разтвор за предварителна обработка със стайна температура (20 25 C). Потопете депарафинизираните срези в разтвора за предварителна обработка, покрийте стъкления съд с капак с отвор и го поставете в микровълновата печка. Изберете функцията на сензора за кипене и програма, която се активира за 10 минути след достигане на температурата на кипене*. След 10-те минути инкубация извадете стъкления съд със слайдовете извън печката, отстранете капака и охладете в продължение на 15 минути при стайна температура. Преместете слайдовете в стъклен съд с разреден промивен буферен разтвор и напоете срезите за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите в продължение на още 3 минути. * Употребата на микровълнова печка с функция чувствителност означава, че тя трябва да притежава сензор и програми, които първоначално нагряват разтвора за предварителна обработка до точката на кипене, а впоследствие поддържат необходимата температура на предварителна обработка (над 95 ºC), като отброяват обратно предварително зададеното време (10 (±1) минути). Някои модели микровълнови печки с функция чувствителност може да не притежават функция за свободно задаване на време за обратно отброяване. Ако моделът включва само предварително зададени програми, изберете програмата, която поддържа необходимата температура на предварителна обработка (над 95 ºC) за минимум 10 (±1) минути, и спрете програмата ръчно след 10 (±1) минути. ЗАБЕЛЕЖКА: Разтворът за предварителна обработка е предназначен само за еднократна употреба. Не използвайте повторно. Стъпка 2: Пепсин, готов за употреба (RTU) или пепсинов разтвор Инкубацията в пепсин може да се извърши чрез директно нанасяне на готови за употреба пепсинови капки върху слайдовете при стайна температура (20 25 C) (метод A) или при 37 C (метод B). Алтернативно, слайдовете могат да бъдат потопени в пепсинов разтвор и инкубирани при 37 (±2) C (метод C). Метод А и метод В: Отстранете излишния буферен разтвор. С помощта на меко чисто парче плат/салфетка без власинки (като например попивателна салфетка или марля) внимателно избършете около пробата, за да отстраните останалата течност и да задържите реагентите в указаната област. Приложете 5 8 капки (250 µl) студен (2 8 C) пепсин (флакон 2А), за да покриете пробата. Винаги съхранявайте пепсин при температура от 2 8 C. Метод A: Пепсин, готов за употреба - инкубация при C Инкубирайте за 5 15 минути при стайна температура (20 25 C). Инкубация в продължение на 5 15 минути ще бъде подходяща за повечето проби, но оптималното време на инкубация може да зависи от фиксирането на тъканите и/или от дебелината на пробата и трябва да се определи от потребителя. Отстранете излишния пепсин и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.3) за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете разредения промивен буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Преминете към дехидратация. Метод В: Пепсин, готов за употреба инкубация при 37 C Поставете пробата с пепсин върху нагревателен блок с температура 37 C напр. Dako Hybridizer и инкубирайте в продължение на 3 5 минути. Инкубация в продължение на 3-5 минути ще бъде подходяща за повечето проби, но оптималното време на инкубация може да зависи от фиксирането на тъканите и/или от дебелината на пробата и трябва да се определи от потребителя. Отстранете излишния пепсин и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Преминете към дехидратация. P04090BG_02/K стр. 45/70

46 Рак на стомаха Дехидратирайте тъканните срези през градуирана серия етанол: 2 минути в 70 % етанол, 2 минути в 85 % етанол и 2 минути в 96 % етанол. Оставете тъканните срези да изсъхнат напълно на въздух. Метод С: Пепсинов разтвор потапяне на слайдовете в пепсинов разтвор при температура 37 C Комплектът съдържа реагенти, достатъчни за четири отделни процедури (60 ml пепсинов разтвор, малък контейнер за шест слайда) или единична процедура (240 ml пепсинов разтвор, голям контейнер за 24 слайда). Пригответе пепсиновия разтвор по указанията в раздел A.5. Поставете капака на контейнера и изравнете пепсиновия разтвор до 37 (±2) C във водна баня. Уверете се, че температурата се е стабилизирала. Измерете температурата в контейнера с калибриран термометър, за да обезпечите точната температура. Отстранете излишния промивен буферен разтвор. Потопете слайдовете в пепсиновия разтвор с температура 37 (±2) C и инкубирайте в продължение на минути. Инкубация в продължение на минути ще бъде подходяща за повечето проби, но оптималното време на инкубация може да зависи от фиксирането на тъканите и/или от дебелината на пробата и трябва да се определи от потребителя. Отстранете излишния пепсинов разтвор и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете промивния буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Преминете към дехидратация. Дехидратирайте тъканните срези през градуирана серия етанол: 2 минути в 70 % етанол, 2 минути в 85 % етанол и 2 минути в 96 % етанол. Оставете тъканните срези да изсъхнат напълно на въздух. Стъпка 3: Комплект сонди HER2/CEN-17 IQISH Комплектът от сонди HER2/CEN-17 IQISH се разделя на две фази по време на съхранението му при -18 C. Преди да използвате флакон 3, проверете дали е налична само една фаза, като изравните комплекта от сонди до стайна температура (20 25 C), а след това миксирате. Размразете флакон 3 на стайна температура (20 25 C) за максимум 30 минути (пазете от силна светлина), след това старателно центрофугирайте флакона за 15 секунди на 2500 об/мин с помощта на вихров миксер. Съхранявайте флакон 3 при -18 C веднага след употреба. Поставете 10 µl от комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH (флакон 3) в центъра на тъканния срез. Незабавно поставете покривно стъкло с размери 22 мм x 22 мм над комплекта сонди, като му позволите да се разстели равномерно под покривното стъкло. Не допускайте въздушни мехурчета. Ако забележите въздушни мехурчета, внимателно ги отстранете от тъканта с помощта на форцепс. Помнете, че трябва да съхранявате флакон 3 при -18 C веднага след употреба. Уплътнете покривното стъкло с уплътнителя на покривното стъкло чрез инжектиране на уплътнителя около периферията на покривното стъкло. Позволете на уплътнителя на покривното стъкло да припокрие покривното стъкло и слайда, като по този начин създаде уплътнение около покривното стъкло. Уверете се, че уплътнителят на покривното стъкло покрива целия край на покривното стъкло. Пригответе Dako Hybridizer* (код S2450 или S2451) за процедура на хибридизация. Уверете се, че Humidity Control Strips (код S2452) са сатурирани и оптимални за употреба. Стартирайте хибридизатора и изберете програма, с която ще: Денатурирате при 66 C за 10 минути, след това ще извършите хибридизация при 45 C в продължение на минути. Поставете слайдовете в хибридизатора, уверете се, че капакът е правилно затворен и стартирайте програмата. Моля, обърнете се към Ръководството с инструкции на Dako Hybridizer за допълнителна информация. P04090BG_02/K стр. 46/70

47 Рак на стомаха * Инструменти, подходящи за условия, идентични с описаните по-горе, може да се използват за денатурация и хибридизация: Поставете слайдовете върху равна метална или каменна повърхност (нагревателен блок или върху блок в сушилнята за хибридизация), предварително загрята до 66 (±1) C. Денатурирайте за точно 10 минути. Поставете слайдовете в подгрята овлажнена камера за хибридизация. Покрийте камерата с капак и инкубирайте при 45 (±2) C в продължение на минути. Моля, отбележете, че температурата за хибридизация 37 C не е подходяща за използване със сондите, съдържащи се в този комплект. Стъпка 4: Цялостно промиване Напълнете два стъклени съда за оцветяване, напр. съдове на Coplin, с разреден промивен буферен разтвор за цялостно промиване (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел A.2). Препоръчва се минимален обем от 100 ml или 15 ml на слайд във всеки стъклен съд. Поставете един от стъклените съдове за оцветяване, съдържащ разреден промивен буферен разтвор за цялостно промиване със стайна температура в пароуловител, а другия във водна баня. Нагрейте водната баня и разредения промивен буферен разтвор за цялостно промиване до 63 (±2) C. Уверете се, че температурата се е стабилизирала. Покрийте стъкления съд с капак за стабилизиране на температурата и избягване на изпарение. Измерете температурата в стъкления съд с водна баня с калибриран термометър, за да гарантирате правилна температура. Промивният буферен разтвор за цялостно промиване съдържа детергент и може да стане мътен при 63 C това няма да засегне работните характеристики. С помощта на форцепс или ръкавици вземете слайдовете от камерата за хибридизация и внимателно отстранете уплътнителя на покривното стъкло, както и покривното стъкло, и поставете слайдовете, един по един, в стъкления съд за предварително промиване, който е със стайна температура. Когато всички покривни стъкла бъдат отстранени, прехвърлете слайдовете от съда за предварително измиване със стайна температура в съда с водна баня с температура 63 (±2) C. Таймерът трябва да бъде стартиран веднага след прехвърлянето на слайдовете в стъкления съд с температура 63 (±2) C във водната баня. Извършете цялостно промиване точно за 10 минути. Отстранете слайдовете от разредения промивен буферен разтвор за цялостно промиване и напоете срезите в разредения промивен буферен разтвор за 3 минути при стайна температура (20 25 C). Подменете разредения промивен буферен разтвор и напоете срезите за още 3 минути. Дехидратирайте тъканните срези през градуирана серия етанол: 2 минути в 70 % етанол, 2 минути в 85 % етанол и 2 минути в 96 % етанол. Оставете тъканните срези да изсъхнат напълно. Стъпка 5: Заливка Поставете 15 µl флуоресцентна среда за заливка, съдържаща DAPI (флакон 5), в целевата област на слайда и поставете стъклено покривно стъкло. ЗАБЕЛЕЖКА: Слайдовете могат да бъдат разчитани след 15 минути или в рамките на 7 дни след заливката. Все пак, настъпва избледняване, ако слайдовете бъдат изложени на светлина или високи температури. За да се намали до минимум избледняването, съхранявайте слайдовете на тъмно при C. P04090BG_02/K стр. 47/70

48 Рак на стомаха Контрол на качеството Стомах 1. Сигналите трябва да бъдат ярки, отчетливи и лесни за оценяване. 2. Нормалните клетки позволяват вътрешен контрол на процедурата за оцветяване. Нормалните клетки трябва да имат 1 2 ясно видими зелени сигнала, показващи, че сондата с ПНК за CEN-17 успешно е хибридизирала до центромерната област на хромозома 17. Нормалните клетки трябва да имат и 1 2 ясно видими червени сигнала, показващи, че сондата с ДНК за HER2 успешно е хибридизирала до ампликона на HER2. Заради формирането на тъканните срези някои нормални клетки ще имат по-малко от очакваните 2 сигнала от всеки цвят. Невъзможността да се откриват сигнали в нормалните клетки показва неуспешен анализ и резултатите трябва да се считат за невалидни. 3. Нуклеарната морфология трябва да бъде интактна при оценяването с помощта на DAPI филтър. Многобройните призрачни клетки и общата зле изразена морфология на ядрата показва висока степен на разграждане на пробата, което е причина за загуба или прекъснатост на сигналите. Такива проби трябва да се считат за невалидни. 4. Минималният брой оценявани туморни клетки е Разликите във фиксирането, обработването и включването на тъканите в лабораторията на потребителя могат да доведат до променливи резултати, изискващи редовна оценка на вътрешните контроли. Интерпретация на оцветяването Стомах Оценявана тъкан Локализирайте тумора в рамките на контекста на слайда, оцветен с H&E, и оценете същата област върху слайда, оцветен с FISH (във филтъра с DAPI). Трябва да се анализират само проби от пациенти с аденокарцином на стомаха, включително хранопроводно-стомашното съединение. В случаи на чревна метаплазия и аденокарцином в същата проба трябва да се оценява само карциномния компонент. Избягвайте области с тежки възпаления, некроза и области, в които границите на ядрото са неясни. Не включвайте ядра, които изискват субективна оценка. Не включвайте ядрата със слаба интензивност на сигнала и неспецифичен или силен фон. Започнете с микроскопска оценка на целия срез, оцветен с FISH, и на определената област върху среза с H&E, респективно. Преди изброяванета на слайда, оцветен с FISH, отбележете цялостното разпространение на сигнала (хомогенно или хетерогенно) върху листа за изброяване на сигналите. При хетерогенно разпространение отбележете дали има фокална амплификация или амплификация на единични клетки (мозаечен тип). 1) Хомогенно разпространение на сигнала При хомогенно разпространение на сигнала избройте количеството хромозомни центромери (зелените сигнали) и броя на гените HER2 (червените сигнали), респективно, от 20 клетки в 1-2 представителни зони от тумора. 2) Хетерогенно разпространение на сигнала При хетерогенно разпространение на сигнала избройте общо 20 клетки от избраните области, както е посочено по-долу: A) При наличие на фокална амплификация трябва да се изберат областите с амплифицирани клетки. B) При наличие на мозаечно разпространение или на амплифицирани, полизомни и дизомни клетки изброявайте в областите с амплифицирани клетки. В рамките на тези области за общо 20 клетки трябва да се изброят не само амплифицираните клетки, но и съседните неамплифицирани клетки. P04090BG_02/K стр. 48/70

49 Рак на стомаха Ако е възможно, не избирайте припокриващи се области. Не зачитайте оцветяването на бактериална ДНК Известно количество специализирани клетки (мастни клетки и макрофаги), които се намират разпръснати помежду стомашната тъкан, показват високо ниво на оцветяване от сондата HER2 поради наличието на бактериална ДНК. Това води до силно червени флуоресцентни клетки, които се отличават ясно от туморните клетки с висока амплификация на ген HER2. Преброяване на сигналите При избрана област за преброяване на сигналите започнете анализа в едно от 20-те съседни избрани ядра и след това бройте клетка по клетка, като изключвате само ядрата, които не удовлетворяват критериите за качество. Пребройте количеството на сигналите в рамките на ядрената граница на всяко оценявано ядро съгласно насоките по-долу (вж. също приложение 7). - Фокусирайте горе и долу, за да откриете всички сигнали в индивидуалното ядро. - Отброявайте два сигнала, които са с еднакъв размер и са разделени с разстояние (равно на или) по-малко от диаметъра на сигнала само като един сигнал. Разстоянието трябва да е минимално равно на диаметъра на един сигнал с нормален размер, за да се отброят два отделни сигнала. Когато разстоянието между два сигнала е по-малко от диаметъра на даден сигнал, той трябва да се брои за един. - При ядрата с високи нива на амплификация на ген HER2 сигналите на HER2 може да са разположени много близо един до друг, образувайки сноп от сигнали. В тези случаи броят на сигналите на HER2 не може да се определи, а трябва да бъде приблизително изчислен. Специално внимание трябва да се обърне на зелените сигнали, тъй като сноповете от червени сигнали на HER2 могат да покрият зелените сигнали, поради което няма да е възможно те да бъдат забелязани. При съмнение моля да проверите зелените сигнали с помощта на специфичен FITC филтър. Не оценявайте ядра без сигнали или с едноцветни сигнали. Оценявайте само ядра с един или повече FISH сигнали от всеки цвят. Указания за преброяване на сигналите 1 Не преброявайте. Ядрата се припокриват, не всички части на ядрата са видими 2 Два зелени сигнала, не оценявайте ядра само с едноцветни сигнали 3 Пребройте като 3 зелени и 12 червени сигнала (оценка на снопа) 4 Пребройте като 1 зелен и 1 червен сигнал. Два сигнала с еднакъв размер и разделени с разстояние, равно на диаметъра на един сигнал или по-малко от него, се броят за един 5 Не преброявайте (висока степен на разграждане на ил ядрата или недостатъчното им разграждане). Липсващи сигнали в центъра на ядрата (ядра с пръстеновидна форма) 6 Пребройте като 2 зелени и 3 червени сигнала. Два сигнала с еднакъв размер и разделени с разстояние, равно на диаметъра на един сигнал или по-малко от него, се броят за един P04090BG_02/K стр. 49/70

50 Рак на стомаха 7 Пребройте като 1 зелен и 5 червени сигнала 8 Пребройте като 3 зелени (1 зелен извън фокус) и 3 червени сигнала 9 Сноп от червени сигнали, скриващи зелените сигнали, проверете зелените сигнали със специфичен FITC филтър, или не ги бройте Запишете отчетения брой в таблица, както е показано в приложение 5 и 6. Пребройте 20 ядра за тъканна проба, когато е възможно, от различни туморни области. Изчислете съотношението HER2/CEN-17, като разделите общия брой червени сигнали на HER2 на общия брой зелени сигнали на CEN-17. Пробите със съотношение на HER2/CEN-17, по-голямо или равно на 2, трябва да се считат за HER2 ген амплифицирани (26). Резултатите при или близо до минималното допустимо ниво (1,8 2,2) трябва да се интерпретират внимателно. Ако съотношението е на границата (1,8 2,2), пребройте допълнителни 40 ядра и преизчислете съотношението за 40-те ядра. Ако изброяването продължава да бъде гранично, валиден е резултатът от второто оценяване. За по-добро ориентиране при второто изброяване трябва да се включи имунохистохимично оцветяване на HER2, ако има такова. В случай на съмнение слайдът с пробата трябва да се оцени отново. При случаи, които са на границата, се гарантира консултация между патолога и лекуващия лекар. Ограничения Стомах 1. FISH е многоетапен процес, който изисква специализирано обучение в избора на подходящите реагенти, както и в избора, фиксирането и обработката на тъканите, подготовката на FISH слайд и интерпретацията на резултатите от оцветяването. 2. FISH резултатите зависят от боравенето с тъканта и обработката й преди оцветяването. Неправилната фиксация, измиване, изсушаване, затопляне, оформяне на срези или замърсяване с други тъкани или флуиди могат да окажат влияние върху хибридизацията на сондата. Колебливите резултати може да се дължат на вариации в методите на фиксация и включване или на присъщи несъответствия в тъканта. 3. За оптимални и въпроизводими резултати тъканните слайдове трябва да се депарафинизират изцяло. Отстраняването на парафина трябва да бъде завършено в началото на процеса на оцветяване. (вж. ИНСТРУКЦИИ ЗА УПОТРЕБА, раздел B.2). 4. Трябва да се използват само водна баня, нагревателен блок и сушилня за хибридизация, които са с калибрирана температура. Употребата на други типове оборудване може да доведе до изпарение на комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH по време на хибридизация и трябва да се провери от потребителя. Работни характеристики Стомах Основна информация P04090BG_02/K стр. 50/70

51 Рак на стомаха Безопасността и ефикасността на трастузумаб (Herceptin ) бяха демонстрирани в клинично проучване (изпитването ToGA trial) (25). Изследването беше планирано като открито, рандомизирано, многоцентрово изследване от фаза III при HER2- позитивни пациенти с неподлежащ на операция, рекурентен и/или метастатичен аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение. В изследването ToGA HER2 позитивността беше определена или посредством IHCпозитивен (3+) (HercepTest, Dako) и/или позитивен чрез HER2 FISH (HER2/CEN- 17 2,0)(HER2 FISH pharmdx комплект, Dako (код K5331)). След включване в изследването пациентите бяха рандомизирани за получаване на химиотерапия (5- FU или капецитабин и цисплатин) или химиотерапия плюс трастузумаб. Основната крайна цел на изследването беше общата преживяемост. По време на изследването бяха рандомизирани общо 594 пациента, а 584 пациента получиха изследваното лекарство и бяха включени в групата за пълни анализи (FAS). По отношение на основната крайна цел комбинацията от химиотерапия и трастузумаб се оказа статистически по-добра от химиотерапията сама по себе си. Средната обща преживяемост се увеличи от 11,1 до 13,8 месеца (p = 0,0046) с относителен риск 0,74 (95 % интервал на доверителност: 0,60 0,91). Кривите на Kaplan-Meier за общата преживяемост (OS) са показани на фигура 3. Вероятност за оцеляване 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 Тест за регистрация-класификация (Log- Rank Test) P = 0,0046 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Време (месеци) NO. Ляво Флуоро/Цисп Трас/Флуоро/Цисп Група за лечение Флуоро/Цисп Трас/Флуоро/Цисп Фигура 3. Крива на Kaplan-Meier за общата преживяемост (OS) (n=584). P04090BG_02/K стр. 51/70

52 Рак на стомаха След получаването на данните бяха извършени анализи по статуса на HER2 за предварително определена изследователска подгрупа, а в допълнение след това бяха дефинирани две нови подгрупи за HER2 въз основа на оценяването от IHC: Група 1 ( група с ниско ниво на експресия на HER2 ): Група 2 ( група с високо ниво на експресия на HER2 ): IHC 0/FISH+ и IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ и IHC 3+ (FISH+ или FISH - или FISH без резултат) (n=446) Когато първичният анализ на общата преживяемост (OS) беше повторен впоследствие за групата с високо ниво на експресия на HER2 (n=446), предимството в полза на комбинираното лечение беше още по-голямо. Средната обща преживяемост (OS) на групата пациенти, получили химиотерапия плюс трастузумаб, се увеличи на 16,0 месеца в сравнение с 11,8 месеца при пациентите, лекувани само с химиотерапия. Относителният риск за този анализ намаля до 0,65 (95 % интервал на доверителност: 0,51 0,83). Кривите на Kaplan-Meier за общата преживяемост (OS) за групата с високо ниво на експресия на HER2 са показани на Фигура 4. Вероятност за оцеляване 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Време (месеци) NO. Ляво Флуоро/Цисп Трас/Флуоро/Цисп Група за лечение Флуоро/Цисп Трас/Флуоро/Цисп Фигура 4. Крива на Kaplan-Meier за общата преживяемост (OS) за групата с високо ниво на експресия на HER2 (n=446). В проучването BO18255 беше демонстрирана клиничната полезност на HercepTest и на комплекта HER2 FISH pharmdx при оценяването на статуса на HER2 при пациенти с неподлежащ на операция, локално напреднал, рекурентен и/или метастатичен аденокарцином на стомаха или хранопроводно-стомашното съединение. Аналитична чувствителност Аналитичната чувствителност на комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH е изследвана с помощта на 18 проби от аденокарцином при рак на стомаха. Съотношението между броя на сигналите на HER2 и сигналите на CEN-17 беше изчислено на базата P04090BG_02/K стр. 52/70

53 Рак на стомаха на преброяване на 20 ядра от нормални клетки, намиращи се около тумора. Съотношението HER2/CEN-17 за 18-те проби от аденокарцином при рак на стомаха беше между 0,95 и 1,06. Аналитична специфичност ДНК сондите на HER2 в комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH са подредени в крайна последователност и картирани за потвърждаване на общо покритие от 218 kb, включително гена HER2. Сондите с ПНК на CEN-17 в комплекта сонди HER2/CEN-17 IQISH са изпитани индивидуално и в комбинация за потвърждаване на специфичната им хибридизация до центромерната област на хромозома 17. За измерване на способността на анализа да идентифицира единствено целевите субстанции HER2 и CEN-17 без интерференция от други субстанции бяха извършени проучвания върху проби от аденокарцином при рак на стомаха с помощта на флакон 3, съдържащ буферния разтвор за хибридизация, но без комплекта сонди. Общо 18 проби бяха оценени за наличието на сигнали, които не са свързани с комплекта сонди. При никоя от 18-те проби не се наблюдава детекция на други хромозомни мишени или интерференция с тясно свързани субстанции. P04090BG_02/K стр. 53/70

54 Рак на стомаха Изследвания на надеждността Надеждността на анализа HER2 IQFISH pharmdx беше изпитана чрез вариации във времето за предварителна обработка, температурата и методите за подгряване на буферния разтвор за предварителна обработка (в микровълнова печка или на водна баня), времето и метода за инкубация с пепсин (готов за употреба пепсин или потапяне), температурата и времето за денатуриране, времето за хибридизация и времето и температурата за цялостното промиване. Не беше наблюдавана съществена разлика в резултатите при следните експериментални условия: Предварителна обработка по метод A) Водна баня за 10 минути, комбинирана с всяка от температурите 95 C, C и 99 C, заедно с 9, 10 и 11 минути при C. Предварителна обработка по метод B) Микровълнова печка за 9, 10 и 11 минути при >95 C. Разграждане с пепсин метод A) с времена за инкубация от 5, 10 и 15 минути при стайна температура (20 25 C). Разграждане с пепсин метод B) с времена за инкубация от 3, 4 и 5 минути при 37 C. Разграждане с пепсин метод C) с времена за инкубация от 20, 25 и 30 минути, комбинирани с всяка от температурите 35, 37 и 39 C. Денатуриране в продължение на 10 минути, комбинирано с всяка от температурите 65, 66 и 67 C, заедно с 9, 10 и 11 минути при 66 C. Времена за хибридизация от 60, 90 и 120 минути при 45 C. Цялостно промиване в продължение на 10 минути, комбинирано с всяка от температурите 61, 63 и 65 C, заедно с 9, 10 и 11 минути при 63 C. Забележка: При тестовете на надеждността, за даден период от време е променян само един параметър в процедурата за оцветяване, а всички останали параметри са запазени постоянни величини. Препоръчва се придържане към времето и температурите, указани в процедурата на оцветяване. Процедурата за оцветяване за HER2 IQFISH pharmdx предлага променливи в протокола за топлинната предварителна обработка, разграждането с пепсин и времето за хибридизация. Всяка уникална комбинаторна възможност беше валидирана по отношение на статуса на ген HER2. Валидирането беше извършено върху 10 FFPE проби от човешки аденокарцином на стомаха и хранопроводностомашното съединение за всяка от 12-те възможни комбинаторни опции. Комплектът HER2 FISH pharmdx (K5331) беше използван за референция. Съотношението HER2/CEN-17 за всяка отделна проба е показано на фигура 5. Кръстосаните табулации между 12-те теста и референтното оцветяване показаха цялостно съгласуване при статуса на ген HER2 от 100 % (10/10) при горна и долна граници за 95 % доверителност при критерий на основа на двойния избор на двустранни критерии от 78,3 % и 100 %, респективно. Стойността капа беше 1,00, а тестът на McNemars показа липса на предубеденост (р-стойност от 1,00 при критерий на основа на двойния избор на двустранни критерии). P04090BG_02/K стр. 54/70

55 Рак на стомаха Фигура 5. Индивидуални съотношения на HER2/CEN-17 за 10 проби от човешки аденокарцином на стомаха, оцветени с помощта на 12-те комбинаторни вариации на протокола, възможни при HER2 IQFISH pharmdx (код K5731) (Тест 1-12) и комплекта HER2 FISH pharmdx (код K5331) като референция (R). Хоризонталната линия илюстрира стойността на минималното допустимо ниво 2,0. Повторяемост Повторяемостта на съотношението HER2/CEN-17 беше изследвана с анализа HER2 IQFISH pharmdx с помощта на последователни срези от девет различни проби от аденокарцином на стомаха с неамплифициран или амплифициран статус на ген HER2. В една и съща процедура бяха изпитани три екземпляра на срези от всяка проба. Средният коефициент на вариация беше 3,5 % при неамплифицираните проби (диапазон от 1 % до 5 %) и 2,8 % при амплифицираните проби (диапазон от 1 % до 5 %). Повторяемостта върху последователни срези от проби от аденокарцином на стомаха с различна дебелина (2, 3, 4, 5, 6 и 7 µm) беше изпитана с HER2 IQFISH pharmdx. Средният коефициент на вариация на съотношението HER2/CEN-17 беше 4,5 % (диапазон от 3 % до 6 %), т.е. в същия диапазон, както при тъканта с еднаква дебелина и в рамките на предварително зададените критерии за приемане. Възпроизводимост Анализът HER2 IQFISH pharmdx беше изпитан за възпроизводимост от партида до партида и от наблюдател до наблюдател с помощта на три партиди HER2 IQFISH pharmdx и трима наблюдатели. Възпроизводимостта беше изпитана върху девет различни проби от аденокарцином на стомаха с неамплифициран или амплифициран статус на ген HER2. Средният коефициент на вариация за възпроизводимост от партида до партида беше 3,8 % при неамплифицираните проби (диапазон от 2 % до 7 %) и 1,8 % при амплифицираните проби (диапазон от 1 % до 3 %). Средният коефициент на вариация за възпроизводимост от наблюдател до наблюдател беше 4,3 % при неамплифицираните проби (диапазон от 3 % до 5 %) и 4,4 % при амплифицираните проби (диапазон от 2 % до 7 %). Пробите от аденокарцином на стомаха се състояха от 78,8 % проби от резекция и 22,2 % проби P04090BG_02/K стр. 55/70

56 Рак на стомаха от биопсия. 55,6 % от пробите бяха получени от стомаха, а 44,4 % от хранопроводно-стомашното съединение. P04090BG_02/K стр. 56/70

57 Рак на стомаха Клинична полезност Клиничната полезност на HER2 IQFISH pharmdx (код K5731) на Dako беше изследвана в сравнително проучване с комплекта на Dako HER2 FISH pharmdx (код K5331). Проучването включваше 79 проби от рак на стомаха, състоящи се от различни типове тъкани с аденокарцином на стомаха, т.е. аденокарциноми на стомаха или на хранопроводно-стомашното съединение, и резекции или биопсии с хомогенно или хетерогенно (фокално или мозаечно) разпространение на сигнала. Всички тумори бяха оценени за статус на експресия на протеин HER2 с помощта на HercepTest (код K5207) на Dako. В проучването бяха включени проби от всяка от четирите групи за оценяване с IHC (0, 1+, 2+, 3+). Кръстосаната табулация на статуса на HER2, получен чрез двата анализа, показа цялостно съгласуване от 98,7 % при горни и долни граници за интервал на доверителност 95 % със стойности 94,2 % и 99,9 %. Стойността капа беше 0,97 при горни и долни граници за интервал на доверителност 95 % със стойности 0,92 и 1,00. При теста на McNemars р- стойността беше 1,00, посочваща липса на предубеденост между двата анализа. P04090BG_02/K стр. 57/70

58 Рак на стомаха Откриване и отстраняване на проблеми Стомах Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 1. Няма сигнали или слаби сигнали 1a. Комплектът е бил изложен на високи температури по време на транспортиране или съхранение 1б. Микроскопът не функционира правилно - Неподходящ комплект филтри - Неподходяща лампа - Живачната лампа е твърде остаряла - Замърсени и/или напукани колекторни лещи - Неподходящо масло за потапяне 1a. Проверете условията на съхранение. Уверете се, че е наличен сух лед при получаването на пратката. Уверете се, че флакон 3 е бил съхраняван при -18 C на тъмно. Уверете се, че флакони 2A и 5 са били съхранявани при максимум 2 8 C на тъмно. 1б. Проверете микроскопа и се уверете, че използваните филтри са подходящи за употреба с флуорохромите на комплекта и че живачната лампа е с точни характеристики и не е използвана извън очаквания срок на експлоатационната й годност. (вж. приложение 7). В случай на съмнение моля да се свържете с Вашия местен доставчик на микроскопа. 1в. Затихнали сигнали 1в. Избягвайте продължителна работа с микроскопа и сведете до минимум експозицията на силни източници на светлина. 1г. Неправилни условия на предварителна обработка 1д. Изпарение на комплект сонди по време на хибридизация 1г. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на предварителна обработка 1д. Осигурете достатъчна влажност в камерата за хибридизация 2. Няма зелени сигнали 3. Няма червени сигнали 2a. Неправилни условия на цялостно промиване 3a. Неправилни условия на предварителна обработка 2a. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на цялостно промиване, както и че покривните стъкла са отстранени преди цялостното промиване 3a. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на предварителна обработка P04090BG_02/K стр. 58/70

59 Рак на стомаха Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 4. Области без сигнал 4a. Количеството на сондата е прекалено малко 4a. Уверете се, че количеството на сондата е достатъчно голямо, за да покрие областта под покривното стъкло 5. Прекомерно оцветяване на фона 6. Зле изразена морфология на тъканта 4б. Уловени са въздушни мехурчета по време на прилагането на комплекта сонди или заливката 5a. Неправилна фиксация на тъканта 5б. Парафинът не е отстранен напълно 5в. Температурата на цялостно промиване е прекалено ниска 5г. Продължителна експозиция на хибридизирания срез на силна светлина 6a. Неправилна обработка с пепсин 6б. Неправилните условия на предварителна обработка могат да доведат до неясен или мътен вид 6в. Ако обработката с пепсин е прекалено продължителна или дебелината на срезите е много малка, това може да доведе до появата на призрачни клетки или пръстеновидни клетки. 4б. Не допускайте въздушни мехурчета. Ако забележите такива, внимателно ги отстранете с помощта на форцепс 5a. Уверете се, че се използват само фиксирани във формалин, включени в парафин тъканни срези 5б. Следвайте процедурите на депарафинизация и повторна хидратация, описани в раздел B.2 5в. Уверете се, че температурата на цялостното промиване е 63 (±2) C 5г. Избягвайте продължителна работа с микроскопа и сведете до минимум експозицията на силна светлина 6a. Спазвайте препоръчваните периоди на инкубация на пепсин. Вж. раздел B.3, стъпка 2. Уверете се, че с пепсин се борави при правилната температура. Вж. раздел B.1 6б. Уверете се, че се прилагат препоръчваните температура и време на предварителна обработка 6в. Скъсете периода на инкубация на пепсин. Вж. раздел B.3, стъпка 2. Уверете се, че дебелината на срезите е 3 6 µm. P04090BG_02/K стр. 59/70

60 Рак на стомаха Проблем Вероятна причина Предложение за корективни действия 7. Високо ниво на зелена автофлуоресценц ия върху слайда, включително зоните без FFPE тъкан 7. Използване на стъклени слайдове с изтекъл срок или такива, които не се препоръчват 7. Уверете се, че стъкленият слайд с покритие (Dako Silanized Slides, код S3003 или слайдовете с покритие от поли-l-лизин) не е с изтекъл срок на годност. ЗАБЕЛЕЖКА: Ако проблемът не може да бъде отнесен към някоя от горепосочените причини или ако предложението за корективни действия не реши проблема, моля, свържете се с отдел Техническо обслужване на Dako за допълнително съдействие. P04090BG_02/K стр. 60/70

61 Приложение 4 - Стомах HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Рак на стомаха Контролен списък на протокола Идентификационен номер на дневника на процедурата за оцветяване: Дата на процедурата: Партида на HER2 IQFISH pharmdx, код K5731: Идентификационен номер на пробата: Идентификационен номер на оборудването: Дата на разреждане/изтичане срока на годност на 1 x промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20): / Тъкан, фиксирана в неутрален буфериран формалин Да Не Стъпка 1: Предварителна обработка Дата на разреждане/изтичане срока на годност на разтвора за предварителна обработка (флакон 1, разреден в съотношение 1:20) Измерена температура на разтвора за предварителна обработка (95 99 C), ако за нагряване се използва водна баня Предварителна обработка (10 минути) и охлаждане (15 минути) Промийте в промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20) (2 x 3 минути) Стъпка 2: Пепсин Продължителност на обработката с пепсин (флакон 2) при 37 C или Продължителност на обработката с пепсин (флакон 2) при стайна температура или Продължителност на потапянето в пепсин при 37 (±2) C Промийте в промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20) (2 x 3 минути) Дехидратирайте слайдовете (3 x 2 минути) в степенувани серии етанол и изсушете на въздух Стъпка 3: Комплект сонди HER2/CEN-17 Приложете комплект сонди (флакон 3), покрийте с покривно стъкло и уплътнете с уплътнителя на покривното стъкло / C Минути Минути Минути Измерена температура за денатуриране (66 (±1) C) C Денатуриране в продължение на 10 минути Измерена температура за хибридизация (45 (±2) C) C Време за хибридизация (60 до 120 минути) Минути P04090BG_02/K стр. 61/70

62 Рак на стомаха Стъпка 4: Цялостно промиване Дата на разреждане/изтичане срока на годност на промивния буферен разтвор за цялостно промиване (флакон 4, разреден в съотношение 1:20) Измерена температура на промивен буферен разтвор за цялостно промиване (63 (±2) C) Цялостно промийте (10 минути) след отстраняване на покривните стъкла Промийте в промивен буферен разтвор (флакон 6, разреден в съотношение 1:20) (2 x 3 минути) Дехидратирайте слайдовете (3 x 2 минути) в степенувани серии етанол и изсушете на въздух Стъпка 5: Заливка Нанесете 15 μl флуоресцентна среда за заливка (флакон 5) и покрийте с покривно стъкло C C Минути Коментари: Дата и подпис, техник: P04090BG_02/K стр. 62/70

63 Рак на стомаха Приложение 5 Стомах HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Схема на оценяване Партида на HER2 IQFISH pharmdx, K5731: Идентификационен номер на дневника на процедурата на оцветяване: Дата на процедурата: Идентификационен номер на пробата: Характеристика на разпространението на сигнала в тъканта: Хомогенно: Хетерогенно фокално: или Хетерогенно мозаечно: Пребройте сигнали в 20 ядра Номер на ядрата Червен (HER2) Зелен (CEN-17) Номер на ядрата Червен (HER2) Общо 1-10 Общо Зелен (CEN-17) За определяне съотношението HER2/CEN-17 пребройте количеството HER2 сигнали и количеството CEN-17 сигнали в същите 20 ядра и разделете общия брой HER2 сигнали на общия брой CEN-17 сигнали. Ако съотношението HER2/CEN-17 е на границата (1,8 2,2), пребройте допълнителни 40 ядра и преизчислете съотношението (вж. схемата за оценяване при повторното преброяване). Съотношението при или близо до минималното допустимо ниво (1,8 2,2) трябва да се интерпретира внимателно (вж. указанията за преброяване). P04090BG_02/K стр. 63/70

64 Рак на стомаха HER2 FISH HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 ОБЩА ОЦЕНКА (1-20) Съотношение < 2: Амплификация на ген HER2 не е наблюдавана Съотношение 2: Амплификация на ген HER2 е наблюдавана Дата и подпис, техник: Дата и подпис, патолог: За указания за оценяване: вж. Интерпретация на оцветяването. P04090BG_02/K стр. 64/70

65 Рак на стомаха Приложение 6 Стомах HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Схема за оценяване при повторното преброяване Партида на HER2 IQFISH pharmdx, K5731: Идентификационен номер на дневника на процедурата на оцветяване: Дата на процедурата: Идентификационен номер на пробата: Сигнали в допълнителни 40 ядра (1-40) Номер на Червен Зелен Номер на Червен Зелен Номер на Червен Зелен Номер на ядрата HER2 CEN-17 ядрата HER2 CEN-17 ядрата HER2 CEN-17 ядрата Общо Общо Общо Общо Червен HER2 Зелен CEN-17 За определяне съотношението HER2/CEN-17 пребройте количеството HER2 сигнали и количеството CEN-17 сигнали в същите 40 ядра и разделете общия брой HER2 сигнали на общия брой CEN-17 сигнали. Отчетете общия резултат за ядрата от 1-40 в таблицата по-долу. HER2 FISH HER2 CEN-17 Съотношение HER2/CEN-17 ОБЩА ОЦЕНКА (1-40) Съотношение < 2: Амплификация на ген HER2 не е наблюдавана Съотношение 2: Амплификация на ген HER2 е наблюдавана Дата и подпис, техник: Дата и подпис, патолог: За указания за оценяване: вж. Интерпретация на оцветяването. P04090BG_02/K стр. 65/70

66 Рак на стомаха Приложение 7 Стомах HER2 IQFISH pharmdx, код K5731 Спецификации на микроскоп с флуоресценция Dako препоръчва следното оборудване за ползване с HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Тип микроскоп Микроскоп с епифлуоресценция. 2. Лампа 100 Вата живачна лампа (записвайте времето на горене). 3. Обективи За скрининг на тъканта се използват обективи със суха флуоресценция 10Х или обективи с флуоресценция с потапяне в масло 16Х. За увеличение с висока мощност и оценяване на сигналите се препоръчват само обективи с флуоресценция с потапяне в масло, напр. 100Х. 4. Филтри Филтрите са индивидуално проектирани за конкретните флуорохроми и трябва да бъдат избирани съобразно това. Dako препоръчва използването на специфичен DAPI филтър в комбинация с висококачествен Texas Red/FITC двоен филтър. DAPI филтър Texas Red/FITC двоен филтър За потвърждение могат да се използват Texas Red и FITC единични филтри. Флуорохром Дължина на вълната на възбуждане Дължина на вълната на емисия FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Филтрите са специфични за всеки тип микроскоп и използването на подходящите филтри е критично важно за интерпретирането. Ако желаете подробна информация, моля, свържете се с доставчика на Вашия микроскоп или с Вашия представител на Dako. 5. Масло Масло, което не флуоресцира. Предпазни мерки Не се препоръчва 50-ватова живачна лампа. Родаминовите филтри не могат да бъдат използвани. Не се препоръчват тройни филтри. Микроскоп, който не е оптимизиран, може да създаде проблеми при разчитането на флуоресцентните сигнали. Важно е източникът на светлина да е в срок на годност и да е правилно центриран и фокусиран. Клиентите трябва да наблюдават и да следват препоръките на производителя за живачната лампа. Микроскопът трябва да бъде поддържан, а живачната лампа да бъде центрирана преди интерпретирането на резултатите. Трябва да се внимава пробата да бъде изложена на възможно най-малко светлина на възбуждане, за да се сведе до минимум избледняването на флуоресценцията. Препоръчваме Ви да обсъдите настройките на Вашия конкретен микроскоп с производителя, преди да започнете флуоресцентна хибридизация in situ, или да се консултирате с литературата. P04090BG_02/K стр. 66/70

67 Библиография 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2): Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730): King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717): Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4): Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12): Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1): Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785): Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3): Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14): Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1): Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2): Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER- 2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12): Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12): Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1): Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6): Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1): P04090BG_02/K стр. 67/70

68 23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3): Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2): Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742): Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7): P04090BG_02/K стр. 68/70

69 Обяснение на символите Каталожен номер Ограничение на температурата Код на партидата Медицинско изделие за инвитро диагностика Пазете от слънчева светлина (Вижте раздел Съхранение ) Използвайте до Медицинско изделие за инвитро диагностика Съдържанието е достатъчно за извършване на <n> теста Производител Пиктограма GHS (вижте раздела с предпазни мерки) Пиктограма GHS (вижте раздела с предпазни мерки) Пиктограма GHS (вижте раздела с предпазни мерки) Пиктограма GHS (вижте раздела с предпазни мерки) Пиктограма GHS (вижте раздела с предпазни мерки) Редакция P04090BG_02/K стр. 69/70