АНАЛИЗ НА ХРАНИТЕ Съвременен преглед и методология на аналитичните методи Гл. ас. инж. хим. Десислава Гюрова, доц. д-р Росица Еникова, Соня Младенова, Елена Славкова Дирекция Аналитични лабораторни дейности, НЦОЗА, София Резюме Настоящата работа има за цел да представи съвременна оценка и обосновка при подбор на подходящ аналитичен метод. В историческата ретроспекция е показана подробна класификация на методите за анализ и е подчертана необходимостта от подбор на подходяща референтна аналитична процедура в рутинната практика и в научноизследователски аспект. Ключови думи: холестерол, методология, храни A Recent Review And Methodology Of Analytical Methods For Determination Of Cholesterol Assis. Prof. Desislava Gyurova, PhD, Assoc. Prof. Dr. Rositsa Enikova, PhD, Sonya MLadenova, Elena Slavkova Department Analytical laboratory activities, NCPHA, Sofia Abstract The aim of this work is to present the current estimation and justification for the selection of an appropriate analytical method for the determination of cholesterol. In historical retrospect, a detailed classification of methods of analysis is shown, and the need is emphasized for selection of an appropriate reference analytical procedure in routine practice and research aspects. Key words: cholesterol, methodology, foods От историческа гледна точка съвременните методи водят началото си още в края на ХІХ в., когато Salkowski описва цветната реакция за откриването на този аналит, изолиран от камъни в жлъчката около век по-рано. Три проучвания са дали тласък в развитието на аналитичната химия при определянето на холестерола и това са: развитието на цветната реакция 34, нейното изменение 12 и откритието, че дигитонинът утаява количествено холестерола и то относително лесно. Комбинацията от цветна реакция и утаяване с помощта на дигитонин с цел пречистване е довела до първата колориметрична процедура в серум 24, основаваща се на гравиметричния метод на Windaus. Той въвежда стъпката осапунване, която идентифицира 37
присъствието на свободен холестерол и естеството на естерифицирания холестерол в кръвта 48. Първият приет референтен метод за определяне на холестерол е гравиметричния метод на Windaus, по-късно използван от Schoenheimer and Sperry 41, за да го превърнат в референтен метод, изпробван по-късно и от Abell и сътрудници 1. Между колориметричните, флуориметричните и електрохимичните ензимни техники в настоящето някои мануални, някои механизирани, а в края на ХІХ в. ръчни, са направени редица предложения относно определянето на това интересно и важно съединение. С течение на времето механизацията взима преднина, директните реакции стават по-популярни, като броят на механичните устройства е все още ограничен по отношение на броя на реакциите и стъпките, които те биха могли да изпълняват. Установено е, че референтната процедура на Schoenheimer Sperry и директната процедура на Liebermann Buchard дават аналитични резултати, неразличими едни от други 33. Предложени са няколко класификации на методите за анализ на холестерол 20, 43, 47, 50. Една от тях включва методите, групирани в съответствие с процедурите на обработка 50, а цветната реакция се използва като крайна точка на отчитане 43. Класификация на методите за анализ на холестерол Директни реакции Извършва се частично отделяне на холестерола или никакво разделяне. Реагентите се смесват с пробата и крайната точка се определя спектрофотометрично, електрохимично или по друг начин, Черен дроб Жлъчен мехур LDL Пренос на холестерола до клетките Холестеролни депа Пренос на холестерола до черния дроб Артерия HDL с помощта на устройство, подходящо за тази цел. Процедурата на Wybenga с Fe (III) 49, Pearson и сътрудници 38 или тази на Huang 26 всички те се базират на реакцията на Liebermann Burchard и Allain 4, в която двойка ензимна система се използва като пример за директна реакция. Като грешка се разглеждат претенциите към използването на директната реакция в серум 31 или надбъбречна тъкан. Основното предимство на директната реакция се състои в нейната простота на изпълнение. Частично пречистване на холестерол с органични разтворители Частичното изолиране на холестерол може да бъде постигнато чрез течно-твърда или течнотечна екстракция. В случая на течно-твърдата екстракция екстрахиращата течност е разтворима във вода и служи за отделяне на холестерола от протеиновите връзки в течната фаза, където измерването може да се извърши или директно 40, или по-късно разтвореният остатък от изпарения екстракт се подлага на анализ 36. Използвана е двуфазна течно-течна екстракция с 1 или без 8 осапунване на холестеролови естери преди екстракцията. В някои процедури се изисква осапунване, тъй като извлеченият остатък не може да бъде разделен едновременно от свободния или естерифициран холестерол 1. Частичното пречистване и елиминиране на възможни пречения следва да доведе до по-чист краен аналит и по-точни стойности. Пълно изолиране на холестерола Свободният холестерол е изолиран след екстракция и осапунване чрез утаяване с различни утаяващи реагенти 19 и впоследствие пречистените производни се подлагат на краен анализ 41, 42. Утаяването може да бъде ускорено с използването на алуминиев хидроксид или алуминиев хлорид. Холестерол и/или неговите естери са разделени с помощта на различни хроматографски процеси след предварително частично пречистване чрез екстракция с органичен разтворител, като пробите се анализират с газова, колонна, хартиена или тънкослойна хроматография. Предимства и ограничения Предимството на пречистването на определен компонент преди да бъде анализиран е, че след това той може да послужи като отправна точка за процедура, която се използва рутинно. Недостатъците са сложността на процесите и оборудването заедно с изискването за по-големи умения за аналитика, като в бъдеще те са неутрализирани от необходимостта от референтни процедури за определяне 13. 38
В случай на пречистване чрез утаяване с дигитонин някои съединения, които са структурно подобни на холестерола, присъстват в измерими количества в серума, но степента на тяхната намеса не е ясно определена. В допълнение, ако те не са естерифицирани, е възможно да замърсят свободния холестерол непропорционално спрямо общия холестерол. Друго предимство на изолирането и пречистването с дигитонин е, че това третиране изключва потенциални интерфериращи стероли, чиито структури не допускат реакция с дигитонин. Смесени процедури Холестерол и неговите естери се извличат от протеиновите зони 5, 18, 27. Липопротеините, съдържащи холестерол, селективно се утаяват с декстран сулфат преди колориметричното определяне чрез реакции с Fe (III) 29, 30 или на Либерман Burchard. Описана е селективна междинна процедура за изолиране на свободен холестерол 14. Всички процедури, които не попадат в I, II или III, несъмнено попадат в IV. Не е установена окончателна процедура за определяне на холестерол в серум. Въпреки това, наймалко три процедури са доказали своето място, но все още не са обявени за официални референтни методи 1, 41, а всички останали са приложени към рутинни ситуации. Техниките, които са предвидени да доставят диагностични данни през последните години, се наричат процедури за скрининг 26, 33, 38, 49, чиято функция е да открият възможно най-бързо наднормени стойности на холестерола. Холестерол в храни Холестеролът е липид, който се произвежда в черния дроб. Холестеролът е от жизнено значение за нормалното функциониране на организма. Всяка клетка от нашето тяло съдържа холестерол в своя външен слой. Липидите са група вещества, чиито членове са свързани физиологично или химически и се класифицират заедно на базата на тяхната разтворимост в неполярни разтворители. Тази група естествено съдържащи се съединения не се разтварят във вода, но се разтварят в органични разтворители като хлороформ, бензен, етери и алкохол. Класическото определение на общите липиди се отнася до сумата от моно-, ди- и триглицериди, свободни мастни киселини, фосфолипиди, гликолипиди, терпени, стероли, восъци и етерни разтворими съединения 35. Химически те се разграничават ясно, но притежават сходни характеристики на разтворимост. През годините са предложени много системи за класификация на базата на химическата сложност или на полярните характеристики. През 1920 г. Bloor 9 класифицира липидите в три групи: прости липиди (мазнини и восъци), комбинирани липиди (фосфолипиди и гликолипиди) и производни липиди (мастни киселини, алкохоли и стероли). Други изследователи класифицират липидите на база ацилов остатък или според полярните характеристики. Основно (95%) компоненти на хранителните липиди са триглицеридите (съединения, съставени от глицерол с три мастни киселини), естерифицирани до глицерол. Останалите 5% от липидите в храната се състоят от моно- и диглицериди, фосфолипиди, стероли и др. Стеролите са предимно високомолекулни алкохоли, които се срещат в природата в съчетание с мастни киселини, разтворими в неполярни разтворители. Те включват: Холестерол Растителни стероли а) Брасикастерол б) Ситостерол в) Кампестерол г) Стигмастерол. Храни източник на холестерол Източници на холестерол са животинските мазнини, които са сложни смеси от триглицериди с по-малки количества фосфолипиди и холестерол 16. Основните хранителни източници на холестерол са сиренето, яйчният жълтък, сметаната, говеждото и свинското месо, черният дроб, птиците, рибата, скаридите 44, както и майчиното мляко 28. Растителни източници са лененото семе и фъстъците, а холестеролът, съдържащ се в тях, се нарича фитостерол 7. Минимални количества холестерол се съдържат и в клетъчните мембрани на растенията. Основни източници на холестерол за човешкия организъм са месата от домашен добитък, макар че и морските дарове също са богати на него. Съдържанието на холестерол в сурови и сготвени месни и птичи продукти е в диапазона 40 90 mg/100 g 11, 15, 25, 37, 39, 46. Последни данни 45 показват горни концентрации до 150 mg/100 g за варено пилешко тъмно месо. Костният мозък и органи като черен дроб, бъбреци, мозък съдържат до няколко стотици милиграма на 100 g. Преработени месни продукти съдържат от 50 до 150 mg/100 g в зависимост от тяхното формулиране. 39
Методология Фундаменталните изследвания върху биологичните функции и химичните свойства на холестерола са били движещата сила за развитието и прилагането на аналитични технологии за определяне на холестерол. Сложните техники като изотопно проследяване и мас-фрагментация първоначално са били разработени за качествени цели с цел изучаване на биосинтетичните пътища, абсорбцията и метаболизма на холестерола, а на по-късен етап са били възприети за количествени цели. По-старите техники, използващи гравиметрични и колориметрични методи, сега се считат за остарели и почти не се използват. Предпочитаните методи за анализ на холестерол са хроматографските, предимно газова хроматография (GLC) на редица деривати, разделени на колони с ниска полярност. През 1998 г. D. J. Fletouris и сътрудници 22 представят бърз и надежден метод за определяне на холестерол в мляко и млечни продукти с употреба на осапунване и капилярна газова хроматография. Възпроизводимостта е в рамките на 98.6%, а относителното стандартно отклонение възлиза на 1.4%. Методът е успешно приложен и за различни млечни продукти. Прилага се и високоефективна течна хроматография (HPLC), нормално- и обратнофазова, която също дава възможност за надеждно количествено определяне на холестерол в храни 23. AOAC 976.26 е официалния метод за определяне на холестерол. Приложим е за всички храни с чувствителност най-малко 10 mg/100 g холестерол. Методът представлява смесена екстракция с разтворители, последвана от осапунване. Дериватизираният холестерол се хроматографира с помощта на колона с пълнеж. През 1976 г. AOAC International утвърждава първия валидиран метод в храни 6. Въпреки че аналитичната процедура по-късно е модифицирана чрез използване на пряко осапунване AOAC Official Method 994.10 32, методът е потвърден само с една месна матрица. Използването на тези методи за анализ на холестерол в месни и птичи проби през годините са за рутинни и изследователски цели. Налице е по-голяма яснота и се решават някои от най-важните технически въпроси, като например екстракцията с разтворител, условията на осапунване, пост-осапунването, необходимостта от дериватизация, използването на вътрешен стандарт и ефектите на матрицата. Аналитични методи в месо и птичи продукти Аналитичната методология е източник на различия, открити в редица изследвания за съдържанието на холестерол в месо и птичи продукти 11. Процедурите в храни и други биологични материали обикновено включват липидна екстракция, отделяне на холестерола в свободна форма от пречещи компоненти и измерване на изолирания аналит. Холестеролът може да бъде определен чрез гравиметрия, титруване, колориметрия, рефрактометрия, флуориметрия и хроматография. Етапът на осапунването, не на екстракцията, вероятно играе ключова роля в освобождаването на холестерола от други компоненти, най-вече на свързания холестерол в клетъчните мембрани на животните или яйчния жълтък. Осапунването е от съществено значение за отделянето на холестерола и други неосапунителни вещества от мастните киселини, като по този начин се елиминира влиянието на смущенията от триглицериди 11, 21. През последните години сред всички познати количествени техники в храни (особено мускулни хранителни продукти) е широко използвана хроматографията, предимно газова (GC) и течна (HPLC) 2, 3, 10, 17. Хроматографията се предпочита за анализ на холестерол в храни поради своята специфичност да отдели холестерола от другите неосапуняеми съединения, основани на различията във физичните и химичните свойства, и тяхното взаимодействие със стационарни и мобилни фази. Преработени меса с немесни съставки съдържат не само холестерол, но също така растителни стероли, токоферол, токотриенол, наситени въглеводороди, алифатни алкохоли и др., всички неосапуняеми. Отскоро HPLC се използва повече от GC, тъй като се смята, че се намалява окислението на холестерола поради по-ниската работна температура и това дава възможност за безразрушително разделяне, но въпреки тези аргументи газовата хроматография остава предпочитана заради по-високата чувствителност в сравнение с течната 11. Когато в пробата се съдържат допълнителни съединения, за да се определи холестеролът системата HPLC-PDA е може би оптималния избор за рутинен анализ. Етапът на осапунване е необходим, за да се освободи холестеролът от естерната форма и клетъчната мембрана, като директното осапунване е ефективно за всякакъв вид месо или хранителни проби. Освен това дериватизацията не е от съществено значение за определянето на хо- 40
лестерола, тъй като е потвърдено, че свободният холестерол може да бъде инжектиран директно в хроматографската система за ефективното му разделяне и количествено определяне. Заключение Колориметричният метод е с тенденция към завишаване на съдържанието на холестерол, ензимният метод изисква стриктни условия за анализ, а и двата метода не са специфични. Разнообразието от възможности за анализ на холестерол в научните среди варира от колориметричен до GC/HPLC-ID/MS, но GC-FID и HPLC-FID/UV/PDA са може би най-добрия избор за рутинен анализ на холестерол в храни. Подборът на конкретен метод за определяне на холестерола представлява труден избор и сложна задача. Аналитичните цели, характерът и съставът на пробите, параметрите на изпълнението на метода (точност, прецизност, граница на откриване, граница на количествено определяне), производителност, уменията и знанията на анализатора, както и наличните ресурси и оборудване всичко това влияе върху конкретното индивидуално решение. Добрата ориентация в аналитичните методи за изолиране и количествено определяне на съдържанието на холестерол е необходима на специалистите, които търсят точна информация за неговото съдържание в различни източници с оглед на оценката на екзогенното му постъпление в организма чрез храната. Книгопис 1. Abell, LL., et al. A simplified method for the estimation of total cholesterol in serum and demonstration of its specificity. J. Biol. Chem., 1952, 195:357. 2. Abidi, SL, S. Thiam, IM Warner. Elution behavior of unsaponifiable lipids with various capillary electrochromatographic stationary phases. J Chromatogr., 2002, A 949:195 207. 3. Adams, ML., et al. Evaluation of direct saponification method for determination of cholesterol in meats. J Assoc Off Anal Chem., 1986, 69:844 6. 4. Allain, C., et al. Enzymatic determination of total serum cholesterol. Clin. Chem., 1974, 20:470. 5. Anderson, J. T. and A. Keys. Cholesterol in serum and lipoprotein fractions, its measurement and stability. Clin. Chem., 1956, 2:145. 6. AOAC International. Official methods of analysis of AOAC international. 16th ed. Gaithersburg, Md.: AOAC Intl, 1996. 7. Behrman, EJ, V. Gopalan. Cholesterol and Plants. J. Chem. Educ., December 2005, 82(12):1791. 8. Bloor, W. R. The determination of cholesterol in blood. J. Biol. Chem., 1916, 24, 227. 9. Bloor, W.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1920, 17:138-140. 10. Bragagnolo, N, DB. Rodriguez Amaya. Comparison of the cholesterol content of Brazilian chicken and quail eggs. J Food Comp Anal., 2003a, 16 (2):147 53. 11. Bragagnolo, N. Cholesterol and cholesterol oxides in meat and meat products. In: Nollet LML, Toldra F, editors. Handbook of muscle foods analysis. Florida: CRC Press, 2009:187 219. 12. Burchard, H., Beitrage zur Kenntnis des Cholesterins. Chem. Zentraibl., 1890, 610. 13. Cali, J. P. Rationale for reference method in clinical chemistry. Pure AppI. Chem.,1976, 45:63. 14. Chin, H. P., D. H. Blankenhorn and T. J. Chin. Altered partition of serum cholesterol and cholesterol ester in a petroleum ether-ethanol-water system after incubation. Lipids 1, 1966, 285. 15. Chizzolini, R. et al. Calorific value and cholesterol content of normal and low-fat meat and meat products. Trends Food Sci., 1999, 10:119 28. 16. Christie, W. Lipid analysis: isolation, separation, identification, and structural analysis of lipids. Ayr, Scotland: Oily Press., 2003,ISBN 0-9531949-5-7. 17. Daneshfar, A, T. Khezeli, HJ. Lotfi. Determination of cholesterol in food samples using dispersive liquid-liquid microextraction followed by HPLC-UV. J Chromatogr., 2009, B 877:456 60. 18. De Baets, J., and W. Lezy. Improved method for lipoprotein electrophoresis on cellogel. Clin. Chim., 1971, Acta 32:142. 19. Delsal, J. L. Microdosage colorim# {233} trique du cholesterol libre. Bull. Soc. Chum. Biol., 1946, 28:441. 20. Eberhagen, D. Betrachtungen zur Bestimmung des Cholesterins ha ldinisch-chemischen Laboratorium. Z. Kim. Chem. Kim. Biochem.,1969, 1:167. 21. Fenton, M. Chromatographic separation of cholesterol in foods. J Chromatogr., 1992, 624:369 88. 22. Fletouris, D.J. et al. Rapid Determination ofcholesterol in Milk and Milk Products by Direct Saponification and Capillary Gas Chromatography. J. Dairy Sci. 1998, 81:2833-2840. 23. Greenspan, M.D. Separation and Identification of triglycerides, cholesterol esters, cholesterols, 7-dehydrocholesterol, dolichol, ubiquinone, -tocopherol, and retinol by high performance liquid chromatography with a diode array detector Journal of Lipids Research, vol. 29, 1988. 24. Grigaut, colorim#{233}triquede Ia cholest#{233}rine A., Proc#{233}d#{233}de dosage dans l organisme. CR. Soc. Biol., 1910, 68:791. 25. Honikel, KO. Composition and calories. In: Nollet LML, Toldra F, editors. Handbook of processed meats and poultry analysis. Florida: CRC Press., 2009, 195 213. 26. Huang, T. C.et al. A stable reagent for the Liebermann-Burchard reaction. Anal. Chem., 1961, 33:1405. 27. Jencks, W. P. et al. A study of serum lipoproteins in normal and atherosclerotic patients by paper electrophoretic techniques. J. Clin. Invest., 1956, 35:980. 28. Jensen, RG, MM. Hagerty, KE. McMahon Lipids of human milk and infant formulas: a review (PDF). Am J Clin Nutr., (1 June 1978), 31 (6):990 1016. 29. Jordan, W. J. Jr. A modified total serum cholesterol method to eliminate the effect of high bilirubin levels. Clin. Chem., 1968, 14:31. 30. Jordan, W. J., Jr., and E. C. Knoblock. Micromethod for total serum cholesterol that eliminates interference by high bilirubin concentrations. Clin. Chem., 1970, 16:18. 31. Jung, D. H., and A. A. Parekh. A new color reaction for cholesterol assay. Clin. Chim., 1971, Acta 35:73. 32. Klatt, LV, BA. Mitchell, R. L. Smith. Cholesterol analysis in foods by direct saponification: gas chromatographic method collaborative study. J AOAC Intl., 1995, 78:75 9. 33. Levine, J., S. Morganstern, and D. Vlastelica. A direct Liebermann.-Burchard method for serum cholesterol. In Technicon Symposiua 1967, Automation in Analytical Chemistry, 1, N, B. Scova, et al., Eds., Mediad, Inc., White Plains, N. Y., 1968, 25 33. 34. Liebermann, C., Ueber des Oxychinoterpen. Bar. Dtsch. Chem. Ges., 1885, 18:1803. 35. Linscheer, W.G. & A.J. Vergroesen. in Lipids In Modern nutrition in Health and Disease, M.E.Shils and V.R. Young (Eds), Lea & febriger, Philadelphia, PA, 1988, 72 107. 36. Mann, G. V., A method for measurement of cholesterol in blood serum. Clin. Chem., 1961, 7:275. 37. Mourot, J., D. Hermier. Lipids in monogastric animal meat. Reprod Nutr Dev., 2001, 41:109 18. 38. Pearson, S., Stern, S., and McGavack, T. H., A rapid procedure for the determination of serum cholesterol. J. Clin. Endocrinol. 1952, 12:1245. 39. Piironen, V., J. Toivo, A-M. Lampi. New data for cholesterol contents in meat, fish, milk, eggs and their products consumed in Finland. J Food Comp Anal., 2002, 15:705 13. 40. Rosenthal, H. L., M. L. Pfluke, and S. Buscaglia. A stable iron reagent for determination of cholesterol. J. Lab. Clin. Med., 1957, 50:318. 41. Schoenheimer, R., and W. M. Sperry. A micromethod for the determination of free and combined cholesterol. J. Biol. Chem., 1934, 106:745. 42. Sperry, W. M., and F. C. Brand. The colorimetric determination of cholesterol. J. Biol. Chem., 1943, 150:315. 43. Tonks, D. B. The estimation of cholesterol in serum: A classification and critical review of methods. Clin. Biochem., 1967, 1:12. 44. USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 21 (PDF), 2008, United States Department of Agriculture. Retrieved, 2008-10-24. 45. U. S. Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service. 2011. USDA national nutrient database for standard reference. Beltsville, Md.: USDA/ARS Nutrient Data Laboratory, 2011, Available from: http://wwwarsusdagov/ba/bhnrc/ndl.accessed Feb 11, 2011. 46. Valsta, LM, H. Tapanainen, S. Mannisto. Meat fats in nutrition. Meat Sci., 2005, 70:525 30. 47. Vanzetti, G. Methodes photometriques de dosage dur cholesterol dana le serum. Clin. Chim., 1964, Acta 10:389. 48. Windaus, A. Uber die Entgiftung der Saponine durch Cholesterin. Bar. Dtsch. Chem. Ges., 1909, 42:238. 49. Wybenga, D. R. et al. Direct manual determination of serum total cholesterol with a single stable reagent. Clin. Chem., 1970, 16:980. 50. Zak, B., E. Epstein and E. S. Baginski. Review and critique of cholesterol methodology. Ann. Clin. Lab. Sci., 1972, 2:101. 41