Клинично и молекулно стадиране при НДБК Д-р Радостина Чернева, доц. Огнян Георгиев, доц. Даниела Петрова УМБАЛ Александровска, Катедра по пропедевтика на вътрешните болести, Отделение по пулмология Резюме Молекулното или генноекспресионно профилиране на туморите е съвременно направление в онкологията, което обединява генетични и молекулярнобиологични подходи. Основната идея е откриването и валидирането на биологични маркери, допълващи стандартните клинични показатели. Целите са: подобряване на ранната диагноза; осигуряване на адекватна прогноза, стратифициране на пациентите в рискови групи и проследяването им; откриване на предиктивни маркери и маркери за създаване на таргетни терапии. Молекулното профилиране и стадиране е възприето и като концепция по отношение на белодробния карцином. Въпреки че е частично залегнала в седемата ревизия на TNM системата, все още липсват официално възприети биологични маркери, намерили приложение в медицинската практика. Ключови думи: Молекулно профилиране, биологични маркери, молекулно стадиране Clinical and molecular staging of NSCLC Radostina Cherneva, Ognian Georgiev, Daniela Petrova UHAT Alexandrovska, Internal Disease Department, Clinic of Pulmonology Abstract Molecular or gene expression profiling of cancer is a contemporary trend in oncology, that applies both genetic and molecular biology methods. Its main idea is the establishment and validation of markers that are used in addition to the standard clinical approaches. Its aims are: improvement of early diagnosis; adequate prognosis, stratification of patients in risk subgroups, optimal disease follow-up; establishment of predictive markers and markers for target therapy. Molecular profiling and staging is adopted with regards to lung cancer as well. Despite the fact that it is partially assumed in the last seventh revision of the TNM, there are no generally validated markers that have found clinical application in medical practice till now. Key words: Molecular profiling, markers, molecular staging Стадиране при недребнoклетъчен белодробен карцином клинично значение Освен ранната диагноза, приоритет при разрешаването на клиничните проблеми, свързани с белодробния карцином, е адекватното стадиране. То е важно, поради две прчини. Първо, лечението му винаги е било зависимо от стадия. Второ, прогнозата на белодробния карцином силно варира при отделните стадии. 14 При ранните стадии подходът традиционно е хирургичен, допълнен от адювантна химиотерапия при по-високорисковите групи; при локално авансиралите карциноми се прилага комбинация от локална терапия (хирургия или радиотерапия) заедно с химиотерапия; а при метастатичните химиотерапия. Петгодишната преживяемост е както следва за: I стадий 60 38%; II стадий 34 24%; III стадий 5%; IV стадий 1%. 14 Клиничното решение за подхода на лечение при отделните пациенти се основава изцяло на стадия на заболяването. От друга страна точното стадиране е важно и за оценка и сравнение на ефективността на нови терапии в рамките на клиничните проучвания. Клиничното стадиране обаче (анамнеза, физикален преглед, визуализиращи изследвания) е неточно и налага повече или по-малко неинвазивни и инвазивни изследвания, с цел верификация на стадия. До голяма степен това се основава на факта, че оценката на чисто молекулна патология се прави със средства, които не са достатъчно чувствителни и комплексни, за да дадат пълна информация за разпространението й. 14 Подходи при клиничното стадиране на недребноклетъчния белодробен карцином Оценка на Т-TNM разпространение на тумора Определянето на локализацията и размера на тумора се основава на компютърната томография, като по отношение на тази характеристка се счита, че тя е достатъчно точен метод, за да даде реална представа за степента на локална инвазия. Компютъртомографските критерии за резектабилност са контакт между тумора и медиастинума под 3 cm; контакт по обиколката на аортата под 90 граду-
14 са; наличие на мастна тъкан между медиастинума и тумора. При тумори над 3 cm, контакт с медиастинума, както и такива, ангажиращи хода на аортата над 180 градуса, оценката е трудна и налага допълнителни походи ядреномагнитен резонанс (ЯМР), томография, инвазивна оценка на медиастинума, за да се осигури адекватен модел на лечение. Магнитният резонанс се приема като по-добър подход за оценка на големите съдове и аорто-пулмоналния прозорец. Позитронно-емисионната томография (ПЕТ) е по-чувствителен метод при оценка на солитарни периферни нодули с размер над 1.2 сm. Поради ниската си пространствена резолюция обаче не се препоръчва за самостоятелна характеристика на медиастинума или се налага като допълнение към КТ. 8 Ето защо КТ остава стандарт при оценката му. Тя не е достатъчно чувствителна обаче относно степента на медиастинална инвазия засягане на гръдната стена или медиастинални лимфни възли, поради което изисква допълнителни инвазивни или неинвазивни методи на изследване, за да се избегне стадиране в по-малък стадий от реалния. От друга страна, чрез КТ често се стига и до свръхдиагноза на тумори с размери под 0.5 mm. Проследяването на нарастването на тези лезии оскъпява скрининга, като едновременно с това не дава отговор на въпроса за наличие или липса на микрометастази в иначе нормални по размери лимфни възли. 9 Оценка на N-TNM локорегионална лимфна инвазия Въпреки че се запазва като начален подход за оценката на медиастинума, КТ е недостатъчно чувствителна при оценка на лимфните възли. 7 Чувствителността на КТ за оценката на медиастинума е средно 57% (49 66%), а специфичността 82% (77 86%), тоест находката, основана на КТ, не може да се ползва самостоятелно и налага задължително комплексен подход. 14 В частност причина за това са обструктивните пневмонити, които са причина 40% от случаите с увеличени лимфни възли да са израз на възпалително изменение. 14 От друга страна, 5 16% от нормалните лимфни възли са с микрометастази и водят до подценяване на реалния стадий, като объркват терапевтичния подход. 14 Позитронно-емисионната томография е с поголяма точност при изследване на медиастинума, с цел оценка на наличието на N2-N3 чувствителност 89% (70 100%), специфичност 92% (80 100%). Поради ниската си пространствена резолюця обаче тя се комбинира с КТ, което я оскъпява като метод за диагностика. 8 Оценка на M-TNM далечни метастази При оценка на М параметъра конвенциналното стадиране с КТ открива далечни метастази при 35 40% от пациентите, локализирани в черния дроб, надбъбречните жлези, мозъка и пропуска далечната дисеминация в 20% от случаите. В тези случаи ПЕТ се оказва по-добър метод за стадиране. 14 При лезии под 1 cm обаче тя не е с добра чувствителност и налага въвеждането на инвазивни методи за хистологична верификация. 15 Още повече, тя не може да верифицира наличието на хематогенна дисеминация в костите. Въпреки че спестява ятрогенните оперативни интервенции при 20% от болните и подобрява екстраторакалното стадиране, ентусиазмът от ПЕТ спада при разглеждане на единични контралатерални огнища, където също се налага хистологична верификация. 15 За да разясни значението на клиничните методи на стадиране като фактори, влияещи на процеса на стадиране и заедно с това и на преживяемостта, Международната организация за борба с белодробния карцином (IASLC) сравнява преживяемостта на общо 18 000 пациенти в първи стадий. Част от тях са стадирани клинично, а останалите са стадирани след патологично изследване. Петгодишната преживяемост за патологичното стадиране е I стадий 7%, а за клинично стадиране е 53%. Тоест, дори при условията на прецизно стадиране и лечение на пациенти в първи стадий, около 30% развиват рецидив в рамките на пет години. Като се основава на хипотезата, че патологичното стадиране е най-акуратно по отношение на оценката на разпространение на болестта, през 2007 (IASLC) предлага ревизия на ТNM класификацията. Седма ревизия на ТNM-класификацията За да направи ревизия на досега ползваните критерии за стадиране и за да може да валидира предложените от нея изменения, Международната организация за борба с белодробния карцином (IASLC) увеличава значително броя на изследваните пациенти като акцентира и на различната биология на туморите при представители нa различни раси. Включени са 100 869 пациенти с различни по хистология и стадии тумори, както и представители на различни популации Европа, Азия, Северна Америка, Австралия. Целта е да се направи оценка на популационните различия в биологичния ход на тумора, която липсва в досега ползваната шеста ревизия. 11
От друга старна, при шестата ревизия се проследява прогнозата на пациенти, диагностицирани през 1978 1988 г., тоест тя не отразява промените в диагностиката с въвеждането на КТ. Този недостатък също е преодолян чрез изследването на кохорта в периода 1990 2000 г., когато КТ е вече стандарт в диагностиката. Предложените нови критерии се основават на проследяване на преживяемостта на пациенти с Т1, Т2, Т3, Т4 N0M0, при които е направена пълна резекция R0. Чрез log-rank тест са определени гранични размери на тумора, които съществено влияят на преживяемостта 5, 15 (р<0.0001). В общата си характеристика новата система за стадиране представлява субкласифициране на досега ползваните стадии: Субкласифициране на Т1 туморите (0 3 cm) на Т1а (<2 cm) и на Т1b (2 3 cm). Субкласифициране на Т2 туморите (>3 cm) на Т2а (3 5 cm) и Т2b (5 7 cm). Рекласифициране на Т2 туморите с размер над 7 cm като Т3. Рекласифициране на туморите с налични сателитни огнища в същия лоб от Т4 на Т3. Рекласифициране на допълнителните нодули в ипсилатералния лоб от М1 на Т4. Рекласифициране на допълнителни нодули в контралатералния дроб като М1а. Рекласифициране на перикардната или плевралната дисеминация от Т4 на М1а. Рекласифициране на далечните метастази като М1b. Стадирането на пациентите единствено по отношение на прогнозата е проблематично. От една страна то е зависимо от средствата за диагностика, които не са достатъчно чувствителни, за да определят разпространението на молекулна по същността си патология. От друга ТNM не дава възможност за оценка на биологията на тумора и стратифициране на пациенти, диагностицирани в ранните стадии. 3 Неточното стадиране повлиява неблагоприятно прогнозата на пациентите с недрeбноклетъчен белодробен карцином. Когато според стандартните критерии, те попаднат в по-ранен стадий, отколкото в действителност са, те не получават необходимата индукционна или друг тип системна терапия. Обратно, при свръхстадиране са лишени от ползата на хирургично или друг вид лечение. Неправилното стадиране замъглява и ефекта от клиничните проучвания на нови препарати. 3 Молекулно стадиране Молекулното биологично стадиране включва оценката на туморни маркери, свързани с различни онкогенни механизми. То се ползва като допълнение на досега ползваната TNM-класификация с цел да се стратифицират пациентите в рискови групи. 3 Необходимостта от съобразяването на биологията на тумора е залегнала и в седмата ревизия, предложена от Международната организация за борба с белодробния 5, карцином (IASLC). Молекулно стадиране се прилага по отношение на всяка една от трите компоненти Т-характеристиката разпространение на тумора, N-параметъра локорегионална лимфна инвазия, M-параметъра далечни метастази. Целта е да се постигне точно стадиране, да се открият окултни метастази, да се оцени рискът и субгрупирането на пациентите в рамките на един стадий, да се избере подходяща терапия. Това се осъществява чрез анализ на ДНК, ирнк или белтъци. 3 Целта на оценката на първичния тумор е да се открият маркери за оценка на риска при пациенти в ранен стадий, при които вероятността от агресивно протичане на заболяването е достататъчно голяма, за да се оправдае прилагането на адювантна химиотерпия. Анализът на лимфните възли позволява откриването на микрометастази, които не се виждат при стандартните диагностични процедури. Коректното стадиране при наличие на микрометастази до голяма степен подобрява избора на адекватен терапевтичен подход. Изследването на костния мозък и кръвта позволява откриването на окултни далечни метастази (стадий IV), при което на пациентите ще се спести ненужно хирургично лечение и ще се подложат на системна химиотерпия като първичен подход. 3 Молекулно стадиране на първичния тумор Съществуват различни подходи за оценка на молекулната характеристика на първичния тумор. Такива са микрочиповите генноекспресионни изследвания, които предоставят възможност за анализ на множество гени, в рамките на определен метаболитен или сигнален път, или на независим сет от гени. Протеомният анализ дава реална представа за експресията на белтъци и така преодолява посттранслационните промени, които не могат да се детектитрат чрез генноекспресионния анализ. Имунохистохимията остава стандарт за валидиране и оценка на биологични маркери. 15
16 Генноекспресионно профилиране на първичния тумор и прогноза Целта на тези изследвания е да се открият специфични генни профили, които могат да определят общата преживяемост и времето до появата на рецидив, като по този начин се постига адекватно молекулно стадиране при пациенти с еднакви по хистология, диференциация или стадии тумори. До момента са описани около 50 такива гена, като значителна част от тях присъстват в отделните проучвания. Garber et al. 4 (2002) определят експресионните профили със cdna при 56 аденокарцинома в различни клинични стадии. На базата на получените рзултати, те описват три фенотипа аденокарциноми със съществени различия както по отношение на експресираните от тях гени, така и по отношение на преживяемостта. При първата група преобладават гени, свързани с регулацията на клетъчния цикъл и пролиферация, както и такива, които се експресират от нормалния белодробен епител сърфактант А, Б. Във втората група преобладават тумори, експресиращи характерните за белодробния епител маркери тироиден транскрипционен фактор, сърфактант А, Б, С, пронапсин А, регулатори на клетъчния цикъл. В третата група са налице гени, отговорни за екстрацелуларното ремоделиране рецепторът на плазминоген-активатора, катепсин L, които осъщестявават екстрацелуларната протеолиза, както и съдовия растежен фактор С и други ангиогенни фактори. Интерес представлява и фактът, че генните профили на интрапулмонални метастази на аденокарциномите от тип 1 са по-близки по характеристика до група 3. При тази група е описана и най-ниска преживяемост. Сравнена с преживяемостта на първата група, разликата е сигнификантна (р<0.002). Генноекспресионното профилиране при аденокарциноми е обект на изследване и Bhatacharjee et al. 2 (2001). Те прилагат Gene Chip Affymetrix при 125 пациенти с аденокарциноми в различен клиничен стадий. Отдиференцират четири групи, към които се отнасят: група, чиито профил е с невроендокринни харктеристики; група, със свръхекспресирани гени на клетъчния цикъл и пролиферация; такава със свръхекспресирани маркери, характерни за тип II пневмоцити, и такава при които е налице свръхекспресия на сърфактант-асоциирани гени. Последните корелират с данните от Garber et al. 4 (2002), но за останалите две групи липсва аналог. Beer et al. 1 (2002) определят генната експресия на 67 пациенти с аденокарциноми в първи стадий, 19 в трети, и 10 здрави контроли. Те ползват олигонуклеотидни чипове с 6800 транскриптома Affymetrix, като след това проследяват времето до появата на първи рецидив. При анализ на цялата група в I и III стадий са налице 50 гена, на базата на които пациентите се разделят на група с нисък риск (петгодишна преживяемост 90%; и на група с висок риск петгодишна преживяемост <50% (р=0.024). Единадесет от пациентите в I стадий попадат във високорисковата група. При валидирането на този сет от гени върху тумори в I стадий (n=67), се оказва, че 46 от тях са с нисък риск за рецидив, а 21 с висок риск. Преживяемостта на така определените групи съществено се отличава (р=0.005). Miura et al. 10 (2004) анализират генната експресия на аденокарциноми в първи стадий, при което откриват 27 гена, чиято експресия определя пациентите с по-голям риск от рецидив на заболяването. Молекулната хетерогенност на недребноклетъчния белодробен карцином е причина при пациентите с еднакъв стадий и хистология преживяемостта да варира значително. Микрочиповите техники дават възможност едновременно да се анализира експресията на хиляди гени и да се определи туморната хетерогенност като цяло. При анализ на 672 гена, отговорни за процесите на инвазия и метастазиране, е установено, че 5 гена са независими предиктори за обща преживяемост. Potti et al. 12 (2006) създават така наречения метагенен модел. Те определят експресионните профили на кохорта от 89 пациенти с ранен стадий на недребноклетъчен белодробен карцином. При него е открит пул от гени, който адекватно разделя пациентите в зависимост от риска от рецидив в отделни подгрупи. Този пул след това е валидиран в две отделни групи от пациенти 25 и 84 съответно, при което е постигната точност от 72% и 79% по отношение на риска от рецидив. Метагенният модел дава възможност за подобряване на оценката на риска на пациентите за рецидив на забляването и така принципно подобрява прилагането на адювантна химиотерапия при онкоболни с по-агресивно заболяване. Генноекспресионните анализи показват, че различията в експресията на биологичните маркери могат да се ползват не само при определяне на пациентите с по-добър или по-лош отговор на терапията, но и за откриването на стотици известни и неизвестни гени, експресирани различно при адено- и плоскоклетъчните карциноми, при туморите с добра или лоша прогноза.
С цел да определят генноекспресионни профили, свързани с лимфното метастазиране, Hoang et al. 6 (2007) изследват 15 карцинома аденокарцинома и 2 плоскоклетъчни, като ги разделят на базата на наличието или липсата на микрометастази. Те доказват, че чрез експресията на 75 гена могат да се отдиференцират туморите с и без лимфна дисеминация. Протеомен анализ на първичния тумор Нивата на информационната РНК, която се ползва при експресионните анализи, невинаги корелира със белтъчната експресия, поради наличието на посттранслационни модификации или междубелтъчни взаимодействия, ето защо белтъчното профилиране на туморната тъкан е подход, допълващ експресионния анализ. За разлика от имунохистохимията, която остава стандарт при характеризиране на единични белтъчни маркери, белтъчното профилиране описва по-глобално отделни сигнални и метаболитни пътища. При изследването на протеомния профил на диспластични и ранни неопластични лезии са открити няколко молекулни маркери миграционен инхибиторен фактор (MIF), циклофилин А (CyP-A), SUMO-2, тимозин. 4.18 Имунохистохимични маркери на първичния тумор Zhu et al. 17 (2006) прави обзор на изследваните през последното десетилетие имунохистохимични маркери. Най-често изследвани са: EGFR, Her2, Ki-67, p53, Bcl-2, като резултатите са противоречиви за всеки един от тях. Счита се, че Ki-67, p53, Bcl-2 са съществени негативни прогностични маркери. 17 При ранен стадий на недребноклетъчен белодробен карцином обаче корелацията им с лоша преживяемост е слаба. Шест други маркера свръхекспресията на циклин E, VEGF-A, загубата на експресията на р16, р27, -катенин и Е-кадхерин, се считат за важни прогностични маркери, определящи лоша прогноза в над 50% от изследванията. Други генетични и епигенетични промени, които се наблюдават в хода на белодробната канцерогенеза, не са валидирани като прогностични маркери при независими проучвания. Въпреки наличието на много проучвания обаче все още няма общоприети прогностични маркери и по-голямата част от изследванията са с експлоративна насоченост. Причините за това от една страна са, че, веднъж открити, маркерите трябва да бъдат валидирани в последващи кохорти от пациенти, от друга страна трябва да се докаже, че прилагането на химиотерапия при пациентите с по-висок риск наистина увеличава преживяемостта им в сравнение с липсата на такова лечение. Литература 1. Beer G, Kardia L, Huang C, Levin M, Misek E, Lin L, Chen G, Gharib G, Thomas G, Lizyness L, Kuick R, Hayasaka S, Taylor M, Iannettoni D, Orringer B, Hanash S. Gene-expression profiles predict survival of patients with lung adenocarcinoma. Nat Med 2002; 8:816 24. 2. Bhattacharjee A, Richards G, Staunton J, Li C, Monti S, Vasa P, Ladd C, Beheshti J, Bueno R, Gillette M, Loda M, Weber G, Mark J, Lander S, Wong W, Johnson E, Golub R, Sugarbaker J, Meyerson M. Classification of human lung carcinomas by mrna expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(24):790 5. 3. D Amico A. Molecular Biologic Staging of Lung Cancer. Ann Thorac Surg 2008; 85:737 42. 4. Garber E, Troyanskaya G, Schluens K, Petersen S, Thaesler Z, Pacyna-Gengelbach M, van de Rijn M, Rosen D, Perou M, Whyte I, Altman B, Brown O, Botstein D, Petersen I. Diversity of gene expression in adenocarcinoma of the lung. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(2):1098. 5. Goldstraw P, Crowley J, Chansky K, Giroux J, Groome A, Rami- Porta R, Postmus E, Rusch V, Sobin L.The IASLC lung cancer staging project: proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM classification for malignant tumors. J Thorac Oncol 2007; 2:706 14. 6. Hoang K, Patz E, Giroux D, Goldstraw P. Frequency and prognostic significance of preoperatively detected enlarged regional lymph nodes in patients with pathological stage I non-small cell lung cancer following resection. J Thorac Oncol. 2007; 2(12):1103 6. 7. Ikezoe J, Kadowaki K,Morimoto S. Mediastinal lymph node metastases in non-small cell bronchogenic carcinoma: reevaluation of with CT. J Comp Assist Tomography 1990; 14:340 344. 8. Lardionis D, Weder W, Hany F.Staging of non-small cell lung cancer with integrated positron-emission tomography and computed tomography. N Engl J Med 2003; 348:2500 2507. 9. Mahadevia P, Fleisher A, Fleisher LA, Frick KD, Eng J, Goodman SN, Powe NR. Lung cancer screening with helical computed tomography in older adult smokers: a decision and costeffectiveness analysis. JAMA 2003; 289:3 322. 10. Miura K, Bowman D, Simon R, Bowman D, Simon R, Peng C, Robles I, Jones T, Katagiri T, He P, Mizukami H, Charboneau L, Kikuchi T, Liotta A, Nakamura Y, Harris C. Laser capture microdissection and microarray expression analysis of lung adenocarcinoma reveals tobacco smoking- and prognosis related molecular profiles. Cancer research 2004; 62:3244 3250. 11. Mountain F. Revisions in the International System for Staging Lung Cancer. Chest 1997; 111:1710 7 12. Potti A, Mukherjee S, Petersen R. A genomic strategy to refine prognosis in early-stage non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2006; 355:570 80.. Rami-Porta R, Ball D, Crowley J. The IASLC lung cancer staging project: proposals for the revision of the T-descriptors in the forthcoming (seventh) edition of the TNM classification for lung cancer. J Thorac Oncol 2007; 2:593 602. 14. Roberts J, Pass H.Lung cancer staging in non-small cell lung cancer including preoperative and intraoperative techniques In Pass H, Carbone D, Johnson D, Minna J, Turissi A editiors. Lung cancer Principles and practice. III ed. Philadelphia: Lippincot Williams&Wilkins 2004; 372 386. Пълната библиографска справка е на разположение в издателството и може да бъде представена при поискване. 17